Method Article

ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

DOI:

10.3791/61394

⸱

July 11th, 2020

 ,  , 
1National Centre for Biological Sciences, Tata Institute of Fundamental Research, 2SASTRA University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו ממחישה את השימוש בטכניקת הכלאה הצפוני כדי לזהות miRNAs מתוך תמצית RNA מוחלטת.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרורונאס (miRNAs) הם מחלקה של מבוטא באופן שגוי בקידוד, ~ 21 nt RNAs קטן מעורב בוויסות של ביטוי גנים בשני הצמחים ובעלי חיים. רוב miRNAs לפעול כמתגים שליליים של ביטוי גנים מיקוד גנים מפתח. ב צמחים, ראשי miRNAs (פרי-miRNAs) התעתיקים נוצרות על ידי RNA פולימראז II, והם יוצרים אורכים שונים של מבנים גזע לולאה יציבה בשם pre-miRNAs. הסכם endonuclease, Dicer-like1, מעבד את מקדם-מירנס לתוך דופלקסים של Mirnas-Mirnas. אחד הגדילים מ-miRNA-miRNA * דופלקס נבחר ונטען על החלבון 1 Argonaute או הומויומנים שלה כדי לתווך את המחשוף של mRNAs היעד. למרות miRNAs הם מולקולות איתות מפתח, הזיהוי שלהם מבוצע לעתים קרובות על-ידי פחות שיטות מבוססות PCR מיטביות במקום ניתוח כתמי בצפון רגיש. אנו מתארים פשוטה, אמין, שיטה צפונית מאוד רגיש האידיאלי עבור כימות של רמות miRNA עם רגישות גבוהה מאוד, פשוטו כמשמעו מכל רקמת הצמח. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאשר את הגודל, היציבות והשפע של miRNAs ואת הסמנים הקדם.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הגילוי האחרון של RNAs ברגולציה קטנה, microRNAs, הוביל מחקר בהבנת אותם ואת תפקידם בצמחים ובעלי חיים1. משתמשים ארוכי-סמנים של mirnas מעובדים לתוך 21 כדי 24 nt בוגרת mirnas על ידי HYL1 ו-dicer מסוימים כמו חלבונים2,3. A 22 nt miRNA יכול ליזום מדורגת על ידי יצירת siRNAs משני4. מחקרים הראו את התפקיד של mirnas ואת sirnas משני בפיתוח, הגורל תא התגובות הלחץ5,6.

הכלאה בצפון היא שיטה ניסיונית המועסקים באופן שגרתי כדי לזהות מולקולות RNA מסוימות. שיטה זו מתאים אישית את השימוש שלה בזיהוי של ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנה של 15% הרפתקאות פוליאקרילמיד ג'ל

  1. שוקלים ולהוסיף 4.8 g של אוריאה, להוסיף 3.75 mL של 40% אקרילאמיד: bisacrylamide (19:1) פתרון 1 מ ל של 10x TBE pH ה8.2 לתוך שפופרת סטרילי משנת mL.
  2. מפזר אוריאה באמצעות מרחץ מים שנקבע ב 60 ° c לתוך פתרון ברור.
  3. הפוך את עוצמת הקול ל-10 מ"ל באמצעות מים סטריליים טריים ומצננים את תערובת ג'ל לטמפרטורת החדר.
  4. להכין חדש 10% (w/v) הפתרון אמוניום פרסולפט.

2. הרכבת לוחית הזכוכית ויחידת האלקטרופורזה

  1. שוטפים את כל המכשירים הנדרשים לאלקטרופורזה בג ולאלקטרו-מיכשור כביסה. בעדינות לקרצף אותם באמצעות ספוג רך להסיר מאגר שיורית אקרילמיד, לשטוף עם מים ולאפשר להם להתייבש.<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהפגנה זו, זיהינו לכמת את הביטוי של miR397 ברקמות שונות של האורז אינדיקה var וויטני (איור 1). miR397 הוא מבנה 22 nt ו-miRNA שימור. ניתן לזהות את הביטוי של miR397 בכל הדגימות שנבדקו. לפי הדור הבא ברצף נתונים, לדוגמה 1 (רקמת שתיל) יש miR397 ב 5 קריאות למיליון (rpm). גילינו את האות שלה בנוחות, המציין כי השיטה היא רגישה מאוד ניתן להשתמש כדי לזהות אפילו מאוד נמוך miRNAs שופע. בניסוי זה, השתמשנו miR168 ו U6 כמו טעינת פקדים.

באבן מחשופה זו (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן להשתמש בשיטה זו בהרחבה לאיתור וכימות של RNAs קטנים כולל מירנאס שופע פחות. הפרוטוקול מתאר בעיקר את השלבים של העברת ה-RNA הכולל במאגר טעינה, גודל הפרדה על ידי אלקטרופורזה ג'ל, העברה של RNA לקרום, להצליב את הקישור RNA אל ממברנה וhybridize באמצעות רדיויניום בדיקה הרצוי oligo.

הצעד הקריטי עבור כל ניסוי לחסום הוא השימוש ב-RNA באיכות טובה עבור הכנה לדוגמה. לפני טעינת ג'לים, יש לוודא כי הדגימות הן בחינם זורם ולא לדבוק טיפים הטעינה. הטיפול חייב להילקח בעת טעינת המדגם, עצה יש להוסיף ממש מעל החלק הת.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לא הוכרזו קונפליקטים של אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מכירים בגישה למעבדת קרינה שמספקת המכון המארח וברית לרדיואיזוטופ. PVS מעבדה נתמכת על ידי המרכז הלאומי למדעים ביולוגיים, מכון טאטא למחקר ומענקים בסיסיים (BT/PR12394/AGIII/103/891/2014; BT/ב/שוויצרי/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/קבל/119/151/2017) מהמחלקה לביוטכנולוגיה, ממשלת הודו. MP מכיר DBT-מחקר האסוציאטאניה, DBT, ממשלת הודו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
40% תמיסת אקרילאמיד-ביסקרילאמידסיגמאA9926
אמוניום פרסולפט (APS)BioRad1610700
נייר ספיגהמה נייר ספיגה I1001-125
ברומופנול כחולסיגמאB5525-5G
טיפים לטעינה נימיתBioRad2239915
דה-יונים פורממידאמביוןAM9342
בלוק חימוםEppendorff5350
Hybond N + ממברנת ניילוןGERPN203B
בקבוק היברידיזציהSigmaZ374792-1EA
תנור היברידיזציהThermo Scientific1211V79
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)SigmaT7024-25ml
PhosphorImagerGE- סורק טייפון29187194
PhosphorImager מסך וקלטתGE healthcareGE28-9564-75
פיפטותגילסון, דגמים: P20 ו-P10FA10002M, FA10003M
פלסטיק פיפטהFalcon357550
מכשיר ג'ל פוליאקרילאמידBioRad1658003EDU
Sephadex G-25 עמודהGE בריאות27532501
מהירות Vac רכזThermo Scientific20-548-130
SpinwinTarsons1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)NEBM0201S
Transblot מכשירBioRad1703946
ULTRAHyb מאגר הכלאהאמביוןAM8670
אוריאהפישר סיינטיפיק15985
UV-crosslinkerUVPCL-1000L
מערבולתטרסונס3020
אמבט מיםNEOLABD-8810
קסילן ציאנולסיגמאX4126-10G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431, 356-363 (2004).
  2. Anushree, N., Shivaprasad, P. V. Regulation of Plant miRNA Biogenesis. Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).
  3. Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA Blot AnalysisMicroRNA DetectionNorthern BlotPlant MicroRNAsSmall RNA AnalysisGel ElectrophoresisUV Cross linkingHybridization ProbeImageJ QuantificationLoading Controls

Related Articles