ה-RNA ניתוח כתמי לזיהוי וכימות של מיקרורונאס הצמח

סיכום

שיטה זו ממחישה את השימוש בטכניקת הכלאה הצפוני כדי לזהות miRNAs מתוך תמצית RNA מוחלטת.

תקציר

מיקרורונאס (miRNAs) הם מחלקה של מבוטא באופן שגוי בקידוד, ~ 21 nt RNAs קטן מעורב בוויסות של ביטוי גנים בשני הצמחים ובעלי חיים. רוב miRNAs לפעול כמתגים שליליים של ביטוי גנים מיקוד גנים מפתח. ב צמחים, ראשי miRNAs (פרי-miRNAs) התעתיקים נוצרות על ידי RNA פולימראז II, והם יוצרים אורכים שונים של מבנים גזע לולאה יציבה בשם pre-miRNAs. הסכם endonuclease, Dicer-like1, מעבד את מקדם-מירנס לתוך דופלקסים של Mirnas-Mirnas. אחד הגדילים מ-miRNA-miRNA * דופלקס נבחר ונטען על החלבון 1 Argonaute או הומויומנים שלה כדי לתווך את המחשוף של mRNAs היעד. למרות miRNAs הם מולקולות איתות מפתח, הזיהוי שלהם מבוצע לעתים קרובות על-ידי פחות שיטות מבוססות PCR מיטביות במקום ניתוח כתמי בצפון רגיש. אנו מתארים פשוטה, אמין, שיטה צפונית מאוד רגיש האידיאלי עבור כימות של רמות miRNA עם רגישות גבוהה מאוד, פשוטו כמשמעו מכל רקמת הצמח. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לאשר את הגודל, היציבות והשפע של miRNAs ואת הסמנים הקדם.

מבוא

הגילוי האחרון של RNAs ברגולציה קטנה, microRNAs, הוביל מחקר בהבנת אותם ואת תפקידם בצמחים ובעלי חיים¹. משתמשים ארוכי-סמנים של mirnas מעובדים לתוך 21 כדי 24 nt בוגרת mirnas על ידי HYL1 ו-dicer מסוימים כמו חלבונים^2,3. A 22 nt miRNA יכול ליזום מדורגת על ידי יצירת siRNAs משני⁴. מחקרים הראו את התפקיד של mirnas ואת sirnas משני בפיתוח, הגורל תא התגובות הלחץ^5,6.

הכלאה בצפון היא שיטה ניסיונית המועסקים באופן שגרתי כדי לזהות מולקולות RNA מסוימות. שיטה זו מתאים אישית את השימוש שלה בזיהוי של כ-19 -24 nt RNAs קטן ארוך מתוך מאגר של סך RNAs⁷. בהפגנה זו אנו ממחישים את השימוש בטכניקה זו לאיתור ולקוונפיקציה של miRNAs. שיטה זו משתמשת בתיוג של הגששים באמצעות רדיואיזוטופים; thus, רמות miRNA במדגם ניתן להבחין עם רגישות מוגברת. שלא כמו שיטות המבוססות על PCR, שיטה זו מבטיחה כימות ביטוי, כמו גם קביעת גודל של ה-miRNAs. בפרוטוקול זה, אנו מציגים צעדים מכריעים המשפרים את גילוי miRNA. שינו שינוי בשלבים בגושים והיברידיזציה לקבלת זיהוי אותות ברזולוציה גבוהה של miRNAs. טכניקה זו יכולה לשמש גם לאיתור RNAs קטנים שונים אנדוגניים כגון siRNAs, tasi-RNAs משנית ו שנחונות.

פרוטוקול

1. הכנה של 15% הרפתקאות פוליאקרילמיד ג'ל

1. שוקלים ולהוסיף 4.8 g של אוריאה, להוסיף 3.75 mL של 40% אקרילאמיד: bisacrylamide (19:1) פתרון 1 מ ל של 10x TBE pH ה8.2 לתוך שפופרת סטרילי משנת mL.
2. מפזר אוריאה באמצעות מרחץ מים שנקבע ב 60 ° c לתוך פתרון ברור.
3. הפוך את עוצמת הקול ל-10 מ"ל באמצעות מים סטריליים טריים ומצננים את תערובת ג'ל לטמפרטורת החדר.
4. להכין חדש 10% (w/v) הפתרון אמוניום פרסולפט.

2. הרכבת לוחית הזכוכית ויחידת האלקטרופורזה

1. שוטפים את כל המכשירים הנדרשים לאלקטרופורזה בג ולאלקטרו-מיכשור כביסה. בעדינות לקרצף אותם באמצעות ספוג רך להסיר מאגר שיורית אקרילמיד, לשטוף עם מים ולאפשר להם להתייבש.
2. להרכיב את לוחיות הזכוכית יחד ולמקם אותם בחוזקה על הספוג. השתמש בלוח עבה 1 מ"מ עבור הגדרה זו. ודא כי הלוחות נמצאים באותה רמה כדי למנוע דליפה.
3. כדי 10 mL ג'ל לערבב, להוסיף 8 μl של temed ו 80 μl של טרי מוכן 10% (w/v) הפתרון אמוניום פרסולפט.
4. ללא דיחוי, לערבב בעדינות לשפוך את זה בין צלחות זכוכית מורכבים. . הציבו את המסרק בזהירות הימנע מיצירת בועות אוויר בשלב זה.
5. אפשר לג לפולימל כ-45 דקות.
6. רוחצים את הג הפילמור במים סטריליים לפני הצבתם בתוך הכיוונון המפעיל ג'ל.
7. הכנס את הלוחות בתוך הקלטת הפועלת והסר את המסרק בעדינות.
8. לשפוך טרי מוכן סטרילי 1x TBE, pH 8.2 לתוך הטנק.
9. רוחצים את הבארות בזהירות על ידי ליטוף החוצץ כדי להסיר גבישי מלח. שלב זה מסייע לדגימת RNA לפעול בצורה אחידה על פני הג.
10. בצע מראש הפעלה ב 80 V עבור 30 דקות.

3. הכנת צבע ודגימות של העמסה

1. עבור 10 מ ל של צבע העמסה ג'ל, שוקל 5 מ ג של ברומאופנול כחול, 5 מ"ג של קסילן, להוסיף 10 מ ל של הטופסלמיד בזהירות ולערבב אותם היטב.
2. Aliquot 10 μg של כולל RNA לתוך צינור 1.5 mL סטרילי ויבש את הדגימות באמצעות speedvac. . אל תייבש יותר מדי את הדגימות
3. השהה מחדש את דגימות ה-RNA ב-8 μL של טעינה.
4. החום דגימות ב 98 ° c עבור 2 דקות, קריר עבור 1 דקות ב RT, מערבולת ולסובב את הדגימות, עבור 3 פעמים. שלב זה חיוני עבור השעיה נאותה ובתורו זה עוזר בטעינה שווה של דגימות.

4. אלקטרופורזה בג

1. הפסיקו את ההפעלה מראש ושטפו את הבארות לפני טעינת המדגם.
2. החום דגימות ב 98 ° c עבור 1 דקות וטען את הדגימות חם לתוך הבאר באמצעות טיפים קפילר. הכנס את הקצה לתחתית הבאר, כך שמדגם זה תופס שכבה דקה אחת בבאר.
3. . העלאה מלאה של כל הדגימות כלול כדי לטעון את סמן העשור של RNA.
4. הפעל את ג'ל ב 80 V עד הצבע הכחול ברומרופנול פועל כמעט לחלוטין. ברומאופנול כחול רץ 10 bp ב 15% הרפתקאות אקרילאמיד ג'ל.

5. הכנה לאלקטרו-בלוקטים

1. חותכים את קרום N + ניילון לממדים של צלחת זכוכית תווית הקרום בפינה הימנית העליונה שלה עם עיפרון HB.
2. מניחים בעדינות את הקרום על פני השטח של מים סטריליים, מול הצד המסומן לכיוון משטח המים. להשרות את הקרום מראש במשך 15 דקות.
3. גזור 4 חתיכות של נייר לחסום אני לממדים של משטח סיבים.
4. הכן את כריך ג'ל להנחת הצד האפור של הקלטת למטה במגש נקי.
5. הרטיב מראש את פד הסיבים והניחו אותו מעל הקלטת. להסיר בועות אוויר.
6. לפני רטוב חתיכה אחת של נייר לחסום ב-1x TBE ומקום על המשטח סיבים. להסיר בועות אוויר על ידי גלגול צינורות פלסטיק על הנייר. הנח עוד פיסה של נייר מוכתם מראש והסירו בועות אוויר.
7. בזהירות להסיר את הג מתוך הקלטת פועל ולמקם אותו על הגדרת כריך, כך את המדגם RNA הראשון נטען לכיוון ימין.
8. טובלים בעדינות את הקרום הספוג מראש ב-1x TBE ומניחים אותו על הג, ופונים לכיוון מטה. להתגלגל כדי להסיר את בועות האוויר.
9. טובלים בחתיכת נייר מוכתם, מניחים אותו על הקרום, ומסירים את בועות האוויר. לטבול עוד פיסת נייר כתמים, למקם אותו על הגדרת כריך ולהסיר בועות אוויר.
10. להשלים את הכריך על ידי הצבת משטח סיבים רטוב מראש על ההתקנה ולסגור בחוזקה את הקלטת.
11. מניחים את הקלטת כתמים במודול ולמלא 1x TBE, pH 8.2 עד הסימון לחסום.
12. העברה ב -10 וולט, הלילה ב -4 ° c.
13. לאחר העברה, מניחים את הקרום הלח על גיליון נייר ומיד להצליב את ה-RNA לקרום על ידי הקרנה עם אור UV 254-nm (120,000 μles/cm ²). האבן החשופה לחתך החוצה מאוחסנת ב -4 ° c להמשך הכלאה.

6. הכנת בדיקה רדיוקולילד

1. עיצוב לווין כי הוא משלים לחלוטין RNA קטן שהוא להתגלות.
2. סיים את התווית החללית באמצעות ƳP³²ATP (המתקבל מברית) בסוף ה -5 שלה על ידי שילוב הרכיבים לפי מתכון המסופק בטבלה 1.
3. מודקון את תערובת התגובה לעיל ב 37 ° c עבור 30 דקות.
4. הפרד את ƳP³²ATP מההפרדה המסומנת באמצעות עמודה באמצעות Sephadex G-25 לפי פרוטוקול היצרן.

7. הכלאה של האבן החשופה

1. מניחים את הכתם מקושרת, צד RNA פונה למעלה בתוך בקבוק הכלאה.
2. מערבבים במרץ את מאגר היברידיזציה הרגיש במיוחד, מוסיפים 10 מ ל ממנה ומודפפות את האבן החשופה בתוך תנור הכלאה שנשמר ב-35 ° c, עם סיבוב.
3. לבצע טרום היברידיזציה עבור 20 דקות.
4. הסירו את הבקבוק מהתנור והוסיפו את המקדח המסומנת למאגר ההכלאה בעדינות.
5. Hybridize האבן החשופה ב35 ° c, עם סיבוב של 12 שעות.
6. לאחר היברידיזציה להעביר בזהירות את הפתרון הכלאה ל 15 מ ל צינור. ניתן לאחסן פתרון זה ב-4 ° צ' עד לשימוש חוזר.
7. לבצע שטיפת מהירה של האבן החשופה עבור 2 דקות כדי להסיר פתרון היברידיזציה עודף על-ידי הוספת מאגר המיסלס 2x פלוס 0.5% SDS. בטל את הפתרון.
8. מיכל האבן החשופה עם מאגר המידע הנוסף 0.5% SDS עבור 35 ° c, עם סיבוב עבור 30 דקות.
9. שטפו שוב את האבן החשופה במאגר המידע החדש של 0.5 x בתוספת 0.5% SDS ב-35 ° c, עם סיבוב של 30 דקות.
10. הצב את האבן החשופה בתוך כיסוי הכלאה, הסר את המאגר העודף וחתום אותו.
11. לחשוף אותו הקרינה בחינם זרחן מסך צמידה לילה בתוך הקלטת.
12. לזהות את האות הכלאה באמצעות imaole, ולנתח את התוצאות באמצעות תוכנה מתאימה.
13. להסיר את אבן החשופה על-ידי דגירה ב 80 ° c, עם סיבוב עבור 30 דקות עם 0.5 X מאגר המידע ועוד 0.1% SDS ו 0.1 X מאגר המידע בתוספת 0.1% SDS עבור 30 דקות.

תוצאות

בהפגנה זו, זיהינו לכמת את הביטוי של miR397 ברקמות שונות של האורז אינדיקה var וויטני (איור 1). miR397 הוא מבנה 22 nt ו-miRNA שימור. ניתן לזהות את הביטוי של miR397 בכל הדגימות שנבדקו. לפי הדור הבא ברצף נתונים, לדוגמה 1 (רקמת שתיל) יש miR397 ב 5 קריאות למיליון (rpm). גילינו את האות שלה בנוחות, המציין כי השיטה היא רגישה מאוד ניתן להשתמש כדי לזהות אפילו מאוד נמוך miRNAs שופע. בניסוי זה, השתמשנו miR168 ו U6 כמו טעינת פקדים.

באבן מחשופה זו (

דיון

ניתן להשתמש בשיטה זו בהרחבה לאיתור וכימות של RNAs קטנים כולל מירנאס שופע פחות. הפרוטוקול מתאר בעיקר את השלבים של העברת ה-RNA הכולל במאגר טעינה, גודל הפרדה על ידי אלקטרופורזה ג'ל, העברה של RNA לקרום, להצליב את הקישור RNA אל ממברנה וhybridize באמצעות רדיויניום בדיקה הרצוי oligo.

הצעד הקריטי עבור כל ניסוי לחסום הוא השימוש ב-RNA באיכות טובה עבור הכנה לדוגמה. לפני טעינת ג'לים, יש לוודא כי הדגימות הן בחינם זורם ולא לדבוק טיפים הטעינה. הטיפול חייב להילקח בעת טעינת המדגם, עצה יש להוסיף ממש מעל החלק הת...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
40% תמיסת אקרילאמיד-ביסקרילאמיד	סיגמא	A9926
אמוניום פרסולפט (APS)	BioRad	1610700
נייר ספיגה	מה נייר ספיגה I	1001-125
ברומופנול כחול	סיגמא	B5525-5G
טיפים לטעינה נימית	BioRad	2239915
דה-יונים פורממיד	אמביון	AM9342
בלוק חימום	Eppendorff	5350
Hybond N + ממברנת ניילון	GE	RPN203B
בקבוק היברידיזציה	Sigma	Z374792-1EA
תנור היברידיזציה	Thermo Scientific	1211V79
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma	T7024-25ml
PhosphorImager	GE- סורק טייפון	29187194
PhosphorImager מסך וקלטת	GE healthcare	GE28-9564-75
פיפטות	גילסון, דגמים: P20 ו-P10	FA10002M, FA10003M
פלסטיק פיפטה	Falcon	357550
מכשיר ג'ל פוליאקרילאמיד	BioRad	1658003EDU
Sephadex G-25 עמודה	GE בריאות	27532501
מהירות Vac רכז	Thermo Scientific	20-548-130
Spinwin	Tarsons	1010
T4 Polynucleotide Kinase (PNK)	NEB	M0201S
Transblot מכשיר	BioRad	1703946
ULTRAHyb מאגר הכלאה	אמביון	AM8670
אוריאה	פישר סיינטיפיק	15985
UV-crosslinker	UVP	CL-1000L
מערבולת	טרסונס	3020
אמבט מים	NEOLAB	D-8810
קסילן ציאנול	סיגמא	X4126-10G