Method Article

אקסטרה סלולר מבוסס מטריצה ודור נוסף ללא מטריקס סלולרי של אורגנואידים אשכים Murine

DOI:

10.3791/61403

⸱

October 7th, 2020

 ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, ארבע שיטות ליצירת אורגנואידים אשכים מתאי אשכים מורין ילודים ראשוניים מתוארים כלומר, מטריצה חוץ תאית (ECM) וסביבות תרבות 2D ותלת-מיוד ללא ECM. טכניקות אלה יש יישומי מחקר מרובים והם שימושיים במיוחד ללימוד פיתוח האשכים ופיזיולוגיה במבחנה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים אשכים מספקים כלי לחקר התפתחות האשכים, spermatogenesis, אנדוקרינולוגיה במבחנה. מספר שיטות פותחו על מנת ליצור אורגנואידים האשכים. רבות משיטות אלה מסתמכות על מטריצה חוץ-תאית (ECM) כדי לקדם את הרכבת רקמת דה נובו, עם זאת, ישנם הבדלים בין שיטות במונחים של מורפולוגיה ביומימטית ותפקוד של רקמות. יתר על כן, יש כמה השוואות ישירות של שיטות שפורסמו. כאן, השוואה ישירה נעשתה על ידי לימוד הבדלים בפרוטוקולים דור אורגנואיד, עם תוצאות שסופקו. ארבע שיטות לדור ארכיטיפי: (1) ללא ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) ללא ECM תלת-מיוד, ו-(4) תרבות ECM תלת-מיידה מתוארות. שלושה מבחני ביצועים עיקריים שימשו להערכת דור אורגנואיד האשכים. אלה הם הרכבה עצמית תאית, הכללה של סוגי תאים עיקריים (Sertoli, Leydig, נבט, ותאים פריטבולר), וארכיטקטורת רקמות ממופרת כראוי. מתוך ארבע סביבות שנבדקו, תרביות 2D ECM ו-3D-ECM שנוצרו אורגנואידים עם מורפולולוגיות פנימיות הדומות ביותר לאשכים מקומיים, כולל מידור דה נובו של סוגי תאים צינוריים לעומת תאי בין-עירוניים, פיתוח מבנים דמויי צינור, ותפקוד אנדוקריני ארוך טווח מבוסס. כל השיטות שנבדקו מנוצל לא ממוין, מתלים ראשיים של תאים אשכים murine והשתמשו במשאבי תרבות נגישים בדרך כלל. טכניקות אלה של דור אורגנואידים באשכים מספקות ערכת כלים נגישה ותועתקת ביותר ליוזמות מחקר לתוך אורגנוגנזה אשכים ופיזיולוגיה במבחנה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורגנואידים אשכים הם טכניקה חלוצית ללימוד התפתחות האשכים, spermatogenesis, ופיזיולוגיהבמבחנה 1,,2,,3,,4. מספר שיטות נחקרו עבור דור אורגנואיד; אלה כוללים מגוון של מערכות תרבות חוץ-תאיות (ECM) ו-ECM ללא ECM, הן בכיוון דו-ממדי (דו-ממדי) והן בכיוון תלת-ממדי (תלת-ממדי). שיטות ייצור שונות יכולות לקדם אסטרטגיות הרכבה תאיות נפרדות; התוצאה היא רמה גבוהה של השתנות מורפולוגית ופונקציונלית בין מודלים אורגנואידים שפורסמו. מטרת מאמר זה היא לדון במצב הנוכחי של מודלים אשכים במבחנה, ולשמש כתבנית עבור חוקרים עתידיים, בעת עיצוב ניסויי אורגנואיד האשכים. במסגרת המחקר הנוכחי, ארבעה ארכיטיפים שונים של מערכת תרבות מוגדרים ומאופיין בתהליך ניסיוני ותוצאה ביולוגית. אלה כוללים: שיטות תרבות ECM ללא ECM 2D, 3D-ללא ECM ותו לא. האסטרטגיות המוצגות בהן נועדו להיות פשוטות, נגישות ותורמות מאוד בין מעבדות וקבוצות מחקר שונות.

מבחינה היסטורית עבור האשכים, הכינוי "במבחנה", שימש עבור מספר שיטות תרבות שונות של רקמות אשכים ותאים. אלה כוללים שיטות רקמות אורגנוטיפיקות / תרבות איברים (כלומר, תרבות explant)5,תרבות צינורית סמיניפריתמבודדת 6,תרבות תאהאשכים 7, ושיטותשל מורפוגנזה רקמת דה נובו (כלומר, מבנים ביולוגיים אורגנואידים)1. החקירות הראשונות בזרע חוץ-חוץ-כוכבי בוצעו לפני כ-100 שנה, כאשר תרבות האשכים של הארנבים נתלו ב-19208- ומאוחר יותר ב-1937עם תפוצות עכבר 9. בתוך ניסויים ראשוניים אלה spermatogonia נצפו במידה רבה מנוון לאורך השבוע הראשון של התרבות, אם כי כמה תאים מבדיל meiotically זוהו. מזכיר דוחות היסטוריים אלה, testis explant תרבות התחדשה אופטימיזציה 2011 כדי להפוך טכניקה אפשרית ללימוד האשכיםהוא 10. מאז 2011, תרבות explant הפיקה זרע כשיר פוריות במספר דיווחים11,12,13. עם זאת, בשל ההסתמכות של תרבות explant על צינורות אשכים מקומיים קיימים מראש, אלה ההתקדמות האחרונה מתוארים בצורה מדויקת יותר כדוגמאות של "ex vivo" תפקוד האשכים spermatogenesis, פונקציית רקמות ש נשמרה או חודשה עם הסרת מגופו של אורגניזם. למרות השכיחות שלה בספרות, תחזוקה ארוכת טווח של תאי נבט והידול בתוך explants האשכים מאתגרלשכפל 14 , 15,16,17,18,במיוחד על פני מסגרותזמן מספיק זמן כדי להתבונן באופן מלא זרע חוץית (~ 35 ימיםבעכברים 19 ו 74 בבניאדם 20). זה מסקרן להעריך כי רבים מאותם אתגרים שחוו לפני 100 שנים, עדיין מנוסים בתוך זרע ויו לשעבר היום.

שונה מאשר גישות ויוו לשעבר, אורגנואידים האשכים הם דה נובו מורכב microtissues שנוצר כולו במבחנה ממקורות סלולריים (כלומר, תאי האשכים העיקריים). אורגנואידים אשכים מספקים אסטרטגיה יצירתית לעקוף את ההסתמכות ההיסטורית של השדה על רקמה מקומית קיימת מראש, ולסיכום הביולוגיה האשכים לחלוטין במבחנה. ישנן דרישות מרובות המשותפות על ידי רוב מודלים רקמת אורגנואיד; אלה כוללים (1) מורפולוגיה או ארכיטקטורה של רקמות vivo-mimetic, (2) סוגי תאים עיקריים מרובים של הרקמה המיוצגת, (3) הרכבה עצמית או ארגון עצמי בדורם, ו-(4) את היכולת לדמות רמה מסוימת של תפקוד הרקמה המיוצגתופיזיולוגיה 21,22,23,,24. עבור האשכים, זה יכול להיות נתפס בארבעה סימני היכר עיקריים: (1) הכללה של סוגי תאי אשכים עיקריים, נבט, Sertoli, Leydig, peritubular, ותאים interstitial אחרים, (2) הרכבת רקמות בהכוונה תא, (3) מתאים ממודר סוגי תאים לתאים צינוריים נפרדים (נבט וSertoli) ואזורים interstitial (כל סוגי התאים האחרים), ו (4) מידה מסוימת של תפקוד רקמות (למשל, הפרשת הורמון הרבייה או תגובות רקמות, ותחזוקת תא נבט ושונות). בהתחשב באתגרים ההיסטוריים בשמירה על בידול תאי הנבט אקס ויוו ובמבחנה, היוון של ארכיטקטורות אשכים vivo-mimetic (כלומר, מבנים הדומים צינורות סמיניפרים) עם סמנים נוספים מציע סימולציה של פיזיולוגיה אשכים (למשל, פונקציה אנדוקרינית), הם אבני דרך עדיפות לקראת יצירת איברים אשר עשוי יום אחד לקיים במבחנה spermgenesis.

רוב שיטות האורגנואידים האשכים שפורסמו לנצל ECM זמין מסחרית (למשל, קולגן או קניינית ניסוחים ECM)25,26,27 או ECMs ממקור מותאם אישית (כלומר, אשכים decellularized נגזר ECM הידרוג'לים)28,,29,30. ECM אקסוגני מקדם היווצרות רקמת דה נובו באמצעות מתן פיגומים תומכים הרכבה עבור יצירת רקמות. שיטות ECM העניקו רמה מרשימה של היווצרות רקמות, כולל כמה נוכחות תא נבט מורפולוגיה רקמות-mimetic25,28. עם זאת, ECMs הם משתמשים אינם תמיד זמינים אוניברסלית (כלומר, הידרוג'לים נגזר ECM decellularized), ושיטות מסוימות דורשות ג'ל מתוחכם ותאים זריעה כיוונית (למשל, מעברי צבע תלת שכבתיים של ECM והדפסה 3D)25,,31,,32. שיטות ללא פיגומים (למשל, צניפה תלויה וצלחות תרבות לא דביקות)33,34,35יצרו גם אורגנואידים חזקים ותו לא רקים ללא צורך בג'לים או פיגומים של ECM. עם זאת, מורפולוגיה רקמות של אורגנואידים אלה ללא פיגומים הוא לעתים קרובות שונה במבחן vivo, ורוב הדיווחים האלה לשלב תוסף ECM ביוכימיכדי לקדם היווצרות רקמות 33,34,36, או לחילופין, להסתמך על צנטריפוגה עבור צנטריפוגה של תאיםכפויים וקומפקטיות 34, מה שהופך אותם פחות אידיאליים ללימוד הגירה מכוונת תא וארגון עצמי.

ארבע שיטות דור האורגנואידים המוצגות בכתב יד זה כוללות הן אסטרטגיות תלויות ECM והן אסטרטגיות עצמאיות, שכל אחת מהן משתמשת בזרעת תאים פשוטה המאפשרת תצפית על הרכבה עצמית של אורגנואידים מונחי תאים. ניתן לבצע את כל ארבע הטכניקות מאותן מתלי תאים או לעשות שימוש באוכלוסיות מועשרות מותאמות אישית וסוג תא. כוחן של שיטות אלה הוא היכולת להתבונן באורגניואידים בהרכבה עצמית בזמן אמת, ולהשוות ישירות את האופן שבו מבנים אשכים מרכיבים את עצמם בין מיקרו-סביבה של תרבות שונה. ההבדלים הפנוטיפיים בין ארבע שיטות תרבות אלה צריכים להיחשב להשפעתם על שאלת המחקר או הנושא של החוקר. כל שיטה מייצרת מבנים ביולוגיים או אורגנואידים בתוך 24 שעות או פחות. לסיכום, השיטות המוצגות כאן מספקות ערכת כלים של טכניקות הרכבה אורגנואידית ללימוד הרכבה אורגנואיד אשכים, פיתוח רקמות, ופיזיולוגיה אשכים במבחנה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ניסויי העכבר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של אוניברסיטת נורת'ווסטרן, וכל ההליכים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על-ידי IACUC.

1. הכנת פתרונות לדיסוציאציה אנזימטית לרקמות

  1. השתמש בשני פתרונות אנזימטיים שונים (פתרון 1 ופתרון 2), שניהם מיוצרים באמצעות פתרון בינוני של תרבות בזל (BM).
  2. כדי להכין BM, להוסיף סרום ופניצילין-סטרפטומיצין לריכוזים בינוניים חיוניים מינימליים של 10% ו 1% בהתאמה (ראה טבלת חומרים עבור reagents ספציפיים). לאחר מכן סטרילי לסנן את BM באמצעות מסנן 0.22 μm. לפני השימוש עם תאים, pre-equilibrate סטרילי BM ל-pH נייטרלי על ידי חלוקה לתוך צלחת תרבות והצבת בתוך לח, 5% CO2 אינקובטור ב 37 ° C למינימום של 1 שעות.
    הערה: ניתן לאחסן BM ב- 4 °C למשך שבוע אחד בלבד, לאחר מכן BM טרי צריך להיעשות.
  3. כדי להכין collagenase אני פתרונות מלאי, הראשון להמיס 100 מ"ג של קולגנאז אני לתוך 1 מ"ל של עובר סטרילי כיתה H2O (ריכוז סופי 10% m / v), להפוך או מערבולת כדי להתמוסס, ולאחסן 20 μL aliquots ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. צריך להפשיר את אליקוט רק פעם אחת.
  4. כדי להכין deoxyribonuclease I (DNase I) פתרונות מניות, להוסיף 20 מ"ג של DNase I לתוך 1 מ"ל של עובר סטרילי כיתה H2O (ריכוז סופי 2% m / v), להפוך או להסתחרר כדי להתמוסס (לא מערבולת), ולאחסן 20 μL aliquots ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. צריך להפשיר את אליקוט רק פעם אחת.
  5. עבור פתרונות מניות hyaluronidase, להוסיף 30 מ ג לתוך 1 מ"ל של תמיסת מלח פוספט סטרילי (PBS; ריכוז סופי 3% m/v hyaluronidase ב PBS המכיל Ca++/ Mg++), היפוך או מערבולת כדי להתמוסס, ולאחסן 100 μL aliquots ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. Aliquots ניתן להפשיר ולהקפיא מחדש מספר פעמים ללא אובדן של פעילות אנזימטית.
  6. כדי להכין פתרון דיסוציאציה 1, להוסיף 10 μL קולגנאז אני ו 10 μL DNase אני לתוך 1 מ"ל של סטרילי, pre-equilibrated BM (ריכוזים סופיים: 1 מ"ג / מ"ל קולגנאז אני ו 5 μg / mL DNase I). לערבב בעדינות עם פיפטה כדי לערבב את הפתרון, וחם מראש עד 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש עם הרקמה.
    הערה: פתרון 2 מוכן על ידי הוספת 33 μL של hyaluronidase (מראש 37 °C) לכל 1 מ"ל של פתרון 1, (לריכוז הסופי של 1 מ"ג / מ"ל). מצב זה מתרחש באמצע הדרך באמצעות דיסוציאציה אנזימטית של רקמת האשכים בשלב 2.5 להלן.

2. פירוק רקמת טטיס

הערה: כל העכברים היו שכולנים בתוך כלובי פוליפרופילן וסיפקו עם מזון ומים אד libitum. בעלי חיים האכילו אוכל מוקרן שאינו מכיל פיטואסטרוגן. עכברי CD-1 לנוער, 5 ימים לאחר הלידה (dpp), שימשו עבור כל הניסויים והרדמה לפני המתת חסד ואיסוף רקמות, בתוך תא הרדמה המצורף לאיידוי isoflurane (2.5 L/min ב O2). עכברים אושרו להרדמה מלאה באמצעות היעדר תגובה לדקירת בוהן, שלאחריה עכברים הומתו באמצעות עריפת ראש.

  1. להרדים עכברים בתא isoflurane, להבטיח הרדמה באמצעות בהון, ולאחר מכן לערוף את ראשו של העכבר באמצעות מספריים חד. מניחים את העכבר המתת חסד על מחצלת ניתוח ולחטא את הבטן עם 70% אתנול. אוהל העור של הבטן התחתונה עם מורסות ולפתוח את הבטן עם מספריים.
  2. אתר את האשכים באזורים השמאליים הימניים והימניים של הבטן. לנתק את הקשרים שלהם vas deferens וכל רקמת חיבור עיגון, לאחר מכן להרים את האשכים כולו (עם אפידימיס עדיין מחובר) מן החיה. מניחים את האשכים בצלחת פטרי של BM שוויון מראש.
  3. תחת מיקרוסקופ פירוק ובתוך שדה סטרילי, לעשות חתך קטן ב albuginea tunica בקצה אחד של כל אשכים עם מספריים microdissection קטן או על ידי קרעת בעדינות באמצעות שני ממחצויות עדינות.
    1. לאחר מכן, בעודו מחזיק את האשכים מהקצוות הנגדיים של החתך, סוחטים בעדינות את האשכים במלחציים עדינים ודוחפים בתנועה סוחפת עדינה לעבר החור בטוניקה; זה ישחרר את רקמת האשכים כחתיכה אחת מלבנית.
  4. חותכים את האשכים לחתיכות קטנות יותר (≤ 2מ"מ 3)וממקם אותם ל-1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה חם מראש (37°C) 1.
    1. דגירה ב 37 °C במשך 10 דקות.
    2. עבור יותר מ-10 אשכים, הגדל את נפח פתרון הדיסוציאציה הכולל ב-1 מ"ל, תוך הבטחת מינימום של 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה לכל 10 אשכים (למשל, 2 מ"ל ל-20 אשכים, 3 מ"ל ל-30 אשכים וכו').
    3. בעדינות triturate את חתיכות האשכים 50 פעמים (50x) בפתרון 1 באמצעות פיפטה P1000. ודא כי הצינורות מופרדים זה מזה ומרקמות interstitial בשלב זה. אם הגושים נשארים, דגירה במשך 5 דקות נוספות וטריטורה פעם נוספת (50x).
  5. להוסיף 33 μL של תמיסת מניות hyaluronidase (מראש חימם ב 37 ° C, מ שלב 1.5) לכל 1 מ"ל של תערובת דיסוציאציה פתרון 1 (המכיל רקמת האשכים וצינורות תותכים מפורק חלקית). לאחר הוספת hyaluronidase, זה נקרא פתרון 2.
    1. טריטורה (50x) באמצעות P1000 דגירה ב 37 °C במשך 5 דקות.
    2. טריטורט (50x) באמצעות פיפטה P200.
    3. ודא כי בשלב זה לא קיימים צינורות גלויים או גושי תאים. אם גושים נמשכים, דגירה עד 5 דקות נוספות, עם טריטורציה נוספת באמצעות P200 pipette (50x).
  6. הרוו את אנזימי הדיסוציאציה על-ידי הוספת סרום בקר עוברי (FBS) ל-10% מהנפח הכולל של פתרון 2. לתמזה מספר פעמים באמצעות פיפטה P200 כדי להבטיח שלא יישארו גושים, וסנן באמצעות מסננת תא של 40 μm כדי לייצר מתלה של תא יחיד.
  7. תאי צנטריפוגה ב- 100 x g למשך 7 דקות, נפטרים מהסופרנט ופנסים מחדש את התאים ב-BM טרי.
  8. לספור את ריכוזי התא הכולל ו קיימא באמצעות הדרה כחול trypan על hemocytometer. להוסיף 10 μL של 1:1 מדולל, מתלה תא: פתרון כחול trypan, לתוך תא ספירת תאים hemocytometer (ראה טבלת חומרים).
    1. תאים צנטריפוגה מחדש ב 100 x g עבור 7 דקות וssuspend ב BM טרי.
      הערה: השתמש בתאים מעשיים רק לחישוב ריכוז ומספר תאים. השתמש רק מתלי תאים של ≥ 80% קיום ליצירת אורגנואידים.
    2. הכן את מתלי התא הבודד לריכוזי תאים כמתואר על מנת לצטט 280,000 תאים בהתחשב בנפחים המשמשים בפרוטוקול שלבים ספציפיים להלן בסעיף 3: 2D ECM-חינם – 0.56 x 106 תאים/מ"ל, 2D ECM – 0.56 x 106 תאים/מ"ל, 3D ECM-חינם – 4.66 x10 6 תאים/ מ"ל, 3D ECM – 2.8 x 106 תאים / מ"ל.
      הערה: כל ניסויי התרבות המוצגים כאן מתחילים עם 280,000 תאים שנזרעו היטב לכל תרבות. מספרים אלה תואמים לנתונים המייצגים בדמות 1, איור 2, איור 3 ואיור 4.

3. הכנת מנות תרבות אורגנואיד ותרעת תאים

הערה: כדי להבטיח ECM הומוגני, pre-פשרה קפוא aliquots של ECM לילה לפני ניסויים. ECM aliquots צריך להיות שקוע בתוך דלי של קרח בתוך מקרר 4 מעלות צלזיוס או חדר קר כדי להבטיח עלייה איטית, הדרגתית בטמפרטורה. כל ECM משמש 1:1 דילול סופי BM לתרבות. שמור ECM מופרך ו- ECM מדולל 1:1 על קרח עד מיד לפני השימוש, אחרת ECM עלול לפולימר בטרם עת.

  1. עבור תרבות 2D ECM ללא, אין צורך בהכנה מיוחדת, מתלים תא יחיד צלחת (500 μL של 0.56 x10 6 תאים / מ"ל ב BM) ישירות על 4- גם שקופיות תא, ומקום לתוך 35 ° C אינקובטור לתרבות.
    הערה: תאים צריכים לדבוק בתחתית צלחת התרבות בתוך 24 השעות הראשונות של התרבות, עשויים להציג כמה אשכולות תאים תלת-מית-מירביים קטנים בתוך זמן זה.
  2. עבור תרבות ECM 2D, לוותר 100 μL של קר 1:1 מדולל מטריצה חוץ תאית מטריצה לתוך שקופית 4 באר תא, להבטיח את הג'ל מכסה את כל תחתית המנה.
    1. מניחים את השקופית התא באינקובטור 35 °C למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר ECM פולימר לתוך ג'ל.
    2. הוסף את מתלה התא (500 μL של 0.56 x10 6 תאים /מ"ל ב BM) ישירות על החלק העליון של ג'ל 2D ברגע שיש לו polymerized.
      הערה: תאים צריכים להתקבץ יחד כדי ליצור אשכולות תלת-מית-מירביים קטנים בתוך 24 השעות הראשונות של התרבות.
  3. עבור תרבות ללא ECM 3D, להכין agarose 3D פטרי צלחת תוספות לפני תחילת תרבות התא.
    1. ראשית, autoclave 1.5 g אבקת agarose ב 100 מ"ל בפיק, לאחר מכן להוסיף 75 מ"ל סטרילי, מים מזוקקים ומיקרוגל כדי לייצר מותך 2% agarose עבור יציקת צלחת פטרי 3D.
    2. בתוך סביבת עבודה סטרילית, לחלק agarose מותך לתוך תבנית צלחת פטרי 3D עד המניסקוס הוא ברמה עם צידי התבנית.
    3. אפשרו לאגרוז להתקרר ולגבש. כאשר מוצק, להפוך את התבנית בעדינות להתכופף שוב ושוב עד צלחת פטרי 3D agarose נופל חופשי מהתבנית.
      הערה: בשלב זה, ניתן להכין הרבה מנות agarose 3D פטרי ולאחסן אותם ב- H2O או DPBS סטרילי ב 4 ° C עבור כלפי מעלה של חודש אחד.
    4. לפני ההתפלה, מניחים את מנות הפטרי 3D של Agarose במנה תרבותית של 24 באר, ומכסים אותן ב-1 מ"ל BM. תנו לתמזי ה-3D של פטרי להסתוות ל-BM למשך 30 דקות לפחות בתוך חממת תרבות של 37 מעלות צלזיוס. בטל את ה-BM וחזור על השיוויון פעם נוספת עם BM טרי של 1 מ"ל. לאחר שיווי משקל של מנות פטרי 3D ב BM, הם יופיעו באותו צבע כמו BM (כלומר, ורוד).
    5. כדי להתכונן זריעת תאים, להסיר את כל BM מהבאר ולחלק 200 μL של BM טרי מסביב, אבל לא בתוך ההפסקה המרכזית של צלחת פטרי 3D. כמו כן, לאסוף את כל BM הנותרים מתוך הפסקה זריעת התא המרכזי של מוסף microwell.
    6. לחלק את מתלה תא יחיד (4.66 תאים / מ"ל ב 60 μL של BM) לתוך ההפסקה המרכזית של צלחת agarose 3D פטרי. בעדינות לתלת למעלה ומטה כדי לערבב תאים ולהבטיח מתלה תא יחיד בתחילת התרבות.
    7. מניחים באינקובטור לח של 35 מעלות צלזיוס לתרבות. למחרת, להסיר את 200 μL של BM מסביב להוכנס microwell, ולהחליף עם 1 מ"ל של BM טרי. זה יביא את הרמה הנוזלית מעל מישור של הכנס, שקוע התרבות כולה.
    8. לאט ובזהירות להסיר / להוסיף מדיה מחוץ לצלחת agarose 3D פטרי. האורגנואידים היו אמורים להידחק בן לילה, ולאפשר להם לנוח בתחתית ולאפשר לשינויים בתקשורת להשאיר אורגנואידים ללא הפרעה.
  4. עבור תרבות ECM 3D, להכין מתלה תא יחיד על ידי שילוב, בחלקים שווים, מתלה התא BM עם קר, PRE-הפשיר ECM (ריכוז סופי = 2.8 x 106 תאים / מ"ל).
    1. מיד לחלק את תערובת התא-ECM לתוך שקופית 4 באר תא, להבטיח את התערובת מכסה את החלק התחתון כולו של הצלחת.
    2. מניחים את שקופיות התא ב-35°C באינקובטור ומאפשרים לתכולתו לפולימר. זה צריך לקחת לפחות 30 דקות. לאחר הפולימר, להוסיף 500 μL של BM על החלק העליון של התרבות.
      הערה: תאים היו צריכים להתקבץ יחד כדי ליצור אגרגטים תלת-מית-דיים קטנים בתוך 24 השעות הראשונות של התרבות.

4. תחזוקת אורגנואידים

  1. תרבות כל סוגי מודלים אורגנואידים ב 35 °C. עבור כל סוגי התרבות להחליף מחצית מהמדיה שלהם עם BM טרי כל 2 ימים. כדי להבטיח כי אורגנואידים לא נאספים בטעות בעת החלפת מדיום, תמיד לאסוף מדיה לאט מפינה של צלחת שקופיות התא, ומן נקודה חיצונית מחוץ צנרת agarose 3D פטרי. ניתן לאחסן את כל אמצעי התקשורת ב-20°C לשימוש עם immunoassays או ניתוחים אחרים מאוחר יותר (כלומר, כימות של הורמוני רבייה הפרשה או ציטוקיני).
  2. לאחר 7 ימים בתרבות, להשתמש BM המכיל הורמון מגרה זקיק (ריכוז סופי 20 mIU / מ"ל) וגונדוטרופין כוריוני אנושי (ריכוז סופי 4.5 IU / מ"ל). זה חל על כל סוגי תרבות האורגן.
  3. באופן שגרתי תדמיתי את כל תרבויות האורגניואידים (כלומר, הדמיית זמן-זמן) לאפיון היווצרות אורגנואידים וכמת מדדים של הרכבה עצמית, פיתוח וצמיחה לאורך זמן.

5. אוסף אורגנואידים

הערה: ניתן לתקן את כל האורגנואידים עם 4% paraformaldehyde ב PBS עבור אימונולת במורד הזרם וניתוחים היסטולוגיים. תקן במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר עם סיבוב, או לילה ב 4 °C.

  1. עבור תרבויות ללא ECM 2D, תחילה לשטוף את המדגם עם PBS טרי, ולאחר מכן להוסיף קיבעון ישירות על גבי המבנים דבק.
  2. עבור שיטות תרבות ECM (2D ו- 3D), לשטוף פעם אחת עם PBS, ולאחר מכן גם להוסיף קיבעון ישירות על החלק העליון של מדגם ECM-אורגנואיד (כדי לתקן את ג'ל ECM אורגנואידים יחד), או לחילופין, בעדינות pipette אורגנואידים למעלה ו למטה כדי לשחרר אותם ECM שמסביב, ולעבור צינור נפרד קיבעון.
  3. עבור תרבות נטולת ECM תלת-מית, בעדינות pipette אורגנואידים למעלה ומטה בתוך ההפסקה המרכזית של צלחת agarose 3D פטרי; זה יהיה לשטוף את האורבנואידים החוצה להקל על האוסף הקל שלהם עם פיפטה. לאחר מכן להעביר אורגנואידים לצינור נפרד עבור קיבעון.
  4. לפני עיבוד לתוך פרפין, להטביע אורגנואידים רבים (≥ 20) בתוך נפח קטן (~ 30 μL) של ג'ל עיבוד רקמות; זה עוזר לכוון ולרכז אורגנואידים לתוך אזור קטן בתוך בלוקי פרפין, להקל על תצפית קלה יותר בעת מקטע וזיהוי חזותי קל יותר בתוך מקטעים פרפין.
    הערה: אורגנואידים יכולים להיות מאתגרים לזהות לאחר הטבעת פרפין וניתוח על microtome.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דור אורגנואיד נחשב לא מוצלח אם תאי האשכים לא הרכבה עצמית בתוך 72 שעות של תרבות, עם זאת, כל השיטות המוצגות כאן להרכיב בתוך 24 שעות בעת שימוש בתאים מורין ילדותי (5 dpp). כשל בדור המבנה הביולוגי הוצג כהמשך של תאים מושעים באופן חופשי (עמודה של 0 שעות באות 1) גםלאחר תרבות מורחבת (72 ש).) בהיעדר הרכבה עצמית של רקמות, כל אשכולות תאים לכאורה התפזרו בקלות לתאים בודדים על מניפולציה עדינה אפילו (כלומר, pipetting). רקמות שנוצרו בהצלחה נצפו בתחילה כתא תלת-מיואש "אשכולות" (חצים צהובים בעמודה של 6 שעות

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עם השלמת פרוטוקול זה דור אורגנואיד, המשתמש יהיו ארבע טכניקות תרבות שונות זמינות להם להרכבת מבנים אשכים אורגנואידים בסביבות ECM או ECM ללא. חשוב לציין, כל ארבע השיטות מאפשרות לחוקר להתבונן באופן לא פולשני בהרכבה עצמית של אורגנואידים לאורך זמן באמצעות הדמיית זמן או הקלטת וידאו, ולאסוף באופן לא פולשני מדיה מותנית לניתוח הורמונים וציטוקינות הפרשה, ללא רקמות מטרידות במהלך התרבות. בכל השיטות, במהלך 24 שעות, ניסוי יכול ליצור כמה מאות אורגנואידים / מבנים אשכים, כפי שמספרי תאים מאפשרים. שיטות אלה לקדם הרכבה עצמית רקמות לתוך מבנים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) F31 HD089693, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה / המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 ו 4UH3ES029073-03, ואת הפרופסור לזכר תומאס J. Watkin.

המחברים רוצים להודות לאריק ו. רות' על עזרתם במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו עשתה שימוש במתקן BioCryo של מרכז NUANCE של אוניברסיטת נורת'ווסטרן, אשר קיבל תמיכה ממשאב ננוטכנולוגיה רכה והיברידית (SHyNE) משאבים (NSF ECCS-1542205); תוכנית MRSEC (NSF DMR-1720139) במרכז לחקר החומרים; המכון הבינלאומי לננוטכנולוגיה (IIN); ו מדינת אילינוי, דרך ה-IIN. הוא גם עשה שימוש בציוד CryoCluster, אשר קיבל תמיכה מתכנית MRI (NSF DMR-1229693). גרפיקה באות 1 תוכננה באמצעות BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 um מדיה מסננים סטרילייםMillipore Sigmascgpu05reלמדיית סינון סטרילית
3β נוגדן ראשוני HSDCosmo Bio CoK0607סמן תא ליידיג, דילול 1:500
AlexaFluor 568 α-Mouse Thermo Fisher ScientificA-21202נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי
AlexaFluor 568 α-RabbitThermo Fisher ScientificA10042נוגדן משני מתויג פלואורסצנטי
Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific11-095-080בסיס אמצעי תרבית
קולגנאז Iוורת'ינגטון ביוLS004197לתמיסת דיסוציאציה 1
מטריצת ממברנה של קורנינג מטריג'ל354234קורנינגמטריצה חוץ-תאית המשמשת ליציקת ג'לים לתרבית ECM דו-ממדית ותלת-ממדית
מונה תאים ThermoFisher ScientificC10227מונה תאים אוטומטי (מכונת המציטומטר)
שקופיות תא ספירת תאים של רוזנתThermo Fisher ScientificC10228שקופית המציטומטר לשימוש עם מונה אוטומטי של הרוזנת
DDX4 נוגדן ראשוניAbcam138540סמן זרע, דילול 1:500
Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)Worthington BioLS002140לפתרון דיסוציאציה 1
DPBS 1X, + CaCl + MgClThermo Fisher Scientific14040182לשחזור
מלח פוספט חוצץ פוספט של Hyaluronidase Dulbecco +Ca/+ MgThermo Fisher Scientific14040117PBS
Embryo Grade H2OMIllipore SigmaW1503לשחזור קולגנאז I ו-Dnase I
סרום בקר עובריThermo Fisher Scientific16000044למרווה תמיסות דיסוקציה של אנזימים
זקיק הורמון מגרהAbcamab51888לתרבית אורגנואידים לטווח ארוך
גונדוטרופין כוריוני אנושיMillipore SigmaC1063לתרבית אורגנואידים לטווח ארוך
Hyaluronidase, מאשכי בקרMillipore SigmaH4272לתמיסת דיסוציאציה 2
Inhibin B Linked Enzyme Immunosorbent AssayAnsh LabsAL-107Inhibin B ELISA Kit
החלפת סרום נוקאאוטתרמו פישר סיינטיפיק10828-028מקור סרום למדיה בזאלית
MicroTissues 3D Petri צלחת מיקרו-עובש ספרואידים (מערך 24-35, 5x7)Millipore SigmaZ764051לייצור אורגנואידים תלת מימדיים ללא ECM
Nunc, Lab Tek II מערכת שקופיות קאמרית, 4 בארותThermo Fisher Scientific12-565-7עבור 2D ECM ללא ECM, ודו-ממד, תרבית ECM תלת מימדית
פניצילין/סטרפטומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15-140-122אנטיביוטיקה למדיה
ריצ'רד-אלן סיינטיפיק; היסטוג'ל, ג'ל לעיבוד דגימותThermo Fisher ScientificHG-4000-012לסיוע בהטמעת פרפין
נוגדן ראשוני SOX9Millipore SigmaAB5535Sertoli Marker, דילול 1:500
Tedklad Global Mouse Chow (מגדל)Teklad Global2920מזון עכבר ללא פיטואסטרוגנים
Tedklad Global Mouse Chow (תחזוקה)Teklad Global2916מזון עכברים ללא פיטואסטרוגנים
טסטוסטרון מקושר לאנזים אימונוסורבנט מבחןCalbiotechTE373Sטסטוסטרון ELISA ערכת
טריפן בלו, 0.4%תרמו פישר מדעי15250061לספירת תאים
ואלפא;נוגדן ראשוני SMAMillipore SigmaA2547סמן פריטובולרי, דילול 1:500
&בטא; נוגדן ראשוני של CateninBD Biosciences610154סמן ציטופלזמה של סרטולי, דילול של 1:100
, ללא LDEV

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alves-Lopes, J. P., Stukenborg, J. B. Testicular organoids: a new model to study the testicular microenvironment in vitro. Human Reproduction Update. 24 (2), 176-191 (2018).
  2. Komeya, M., Sato, T., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis: A century-long research journey, still half way around. Reproductive Medicine and Biology. 17 (4), 407-420 (2018).
  3. Sakib, S., Goldsmith, T., Voigt, A., Dobrinski, I. Testicular organoids to study cell-cell interactions in the mammalian testis. Andrology. , 12680(2019).
  4. Gargus, E. S., Rogers, H. B., McKinnon, K. E., Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Engineered reproductive tissues. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 381-393 (2020).
  5. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  6. Eddy, E. M., Kahri, A. I. Cell associations and surface features in cultures of juvenile rat seminiferous tubules. The Anatomical Record. 185 (3), 333-357 (1976).
  7. Dietrich, A., SCholten, R., Vink, A., Oud, J. Testicular cell suspensions of the mouse in vitro. Andrologia. 15, 236-246 (1983).
  8. Champy, C. De la méthode de culture des tissus. VI. Le testicule. Archives de Zoologie Experimentale Generale. 60, 461-500 (1920).
  9. Martinovitch, P. The development in vitro of the mammalian gonad. Ovary and ovogenesis. Proceedings of the Royal Society B of Biological Sciences. 125, 232-249 (1938).
  10. Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications. 2, 472(2011).
  11. Komeya, M., et al. Long-term ex vivo maintenance of testis tissues producing fertile sperm in a microfluidic device. Scientific Reports. 6 (1), 21472(2016).
  12. Sanjo, H., et al. In vitro mouse spermatogenesis with an organ culture method in chemically defined medium. PLoS One. 13 (2), 0192884(2018).
  13. Komeya, M., et al. In vitro spermatogenesis in two-dimensionally spread mouse testis tissues. Reproductive Medicine and Biology. 18 (4), 362-369 (2019).
  14. Reda, A., et al. In vitro differentiation of rat spermatogonia into round spermatids in tissue culture. Molecular Human Reproduction. 22 (9), 601-612 (2016).
  15. Reda, A., et al. Knock-Out Serum Replacement and Melatonin Effects on Germ Cell Differentiation in Murine Testicular Explant Cultures. Annals of Biomedical Engineering. 45 (7), 1783-1794 (2017).
  16. Chapin, R. E., et al. Lost in translation: The search for an in vitro screen for spermatogenic toxicity. Birth Defects Research Part B - Developmental and Reproductive Toxicology. 107 (6), 225-242 (2016).
  17. Portela, J. M. D., et al. Strains matter: Success of murine in vitro spermatogenesis is dependent on genetic background. Developmental Biology. 456 (1), 25-30 (2019).
  18. Gholami, K., et al. The air-liquid interface culture of the mechanically isolated seminiferous tubules embedded in agarose or alginate improves in vitro spermatogenesis at the expense of attenuating their integrity. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 56 (3), 261-270 (2020).
  19. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).
  20. Amann, R. P. The cycle of the seminiferous epithelium in humans: A need to revisit. Journal of Andrology. 29 (5), 469-487 (2008).
  21. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  22. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125(2014).
  23. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
  24. Takahashi, T. Organoids for Drug Discovery and Personalized Medicine. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 59, 447-462 (2019).
  25. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system. Biomaterials. 130, 76-89 (2017).
  26. Lee, J. H., Kim, H. J., Kim, H., Lee, S. J., Gye, M. C. In vitro spermatogenesis by three-dimensional culture of rat testicular cells in collagen gel matrix. Biomaterials. 27 (14), 2845-2853 (2006).
  27. Zhang, J., Hatakeyama, J., Eto, K., Abe, S. I. Reconstruction of a seminiferous tubule-like structure in a 3 dimensional culture system of re-aggregated mouse neonatal testicular cells within a collagen matrix. General and Comparative Endocrinology. 205, 121-132 (2014).
  28. Vermeulen, M., et al. Development of a Cytocompatible Scaffold from Pig Immature Testicular Tissue Allowing Human Sertoli Cell Attachment, Proliferation and Functionality. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 227(2018).
  29. Baert, Y., et al. Derivation and characterization of a cytocompatible scaffold from human testis. Human Reproduction. 0 (0), 1-12 (2014).
  30. Baert, Y., Rombaut, C., Goossens, E. Scaffold-Based and Scaffold-Free Testicular Organoids from Primary Human Testicular Cells. Methods in Molecular Biology. 1576, 283-290 (2019).
  31. Alves-Lopes, J. P., Söder, O., Stukenborg, J. B. Use of a three-layer gradient system of cells for rat testicular organoid generation. Nature Protocols. 13 (2), 248-259 (2018).
  32. Baert, Y., Dvorakova-Hortova, K., Margaryan, H., Goossens, E. Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds. Biofabrication. 11 (3), 035011(2019).
  33. Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitro. Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).
  34. Sakib, S., et al. Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture. Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).
  35. Cameron, D. F., et al. Formation of Sertoli Cell-Enriched Tissue Constructs Utilizing Simulated Microgravity Technology. Annals of the New York Academy of Sciences. 944 (1), 420-428 (2006).
  36. Strange, D. P., et al. Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis. Emerging Microbes & Infections. 7 (1), 1-7 (2018).
  37. Edmonds, M. E., Woodruff, T. K. Testicular organoid formation is a property of immature somatic cells, which self-assemble and exhibit long-term hormone-responsive endocrine function. Biofabrication. 12 (4), 045002(2020).
  38. Baert, Y. Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties. Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).
  39. Pinto, M. P., Jacobsen, B. M., Horwitz, K. B., Maggiolini, M. An immunohistochemical method to study breast cancer cell subpopulations and their growth regulation by hormones in three-dimensional cultures. Front Endocrinol (Lausanne). 2, 15(2011).
  40. Brinster, R. L. Germline stem cell transplantation and transgenesis. Science. 296 (5576), New York, N.Y. 2174-2176 (2002).
  41. Hue, D., et al. Meiotic Differentiation of Germinal Cells in Three-Week Cultures of Whole Cell Population from Rat Seminiferous Tubules. Biology of Reproduction. 59 (2), 379-387 (1998).
  42. Zhou, Q., et al. Complete Meiosis from Embryonic Stem Cell-Derived Germ Cells in Vitro. Cell Stem Cell. 18 (3), 330-340 (2016).
  43. Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-Term Proliferation in Culture and Germline Transmission of Mouse Male Germline Stem Cells. Biology of Reproduction. 69 (2), 612-616 (2003).
  44. Helsel, A. R., Oatley, M. J., Oatley, J. M. Glycolysis-Optimized Conditions Enhance Maintenance of Regenerative Integrity in Mouse Spermatogonial Stem Cells during Long-Term Culture. Stem Cell Reports. 8 (5), 1430-1441 (2017).
  45. Sato, T., et al. In vitro spermatogenesis in explanted adult mouse testis tissues. PLoS One. 10 (6), 0130171(2015).
  46. Xiao, S., et al. A microfluidic culture model of the human reproductive tract and 28-day menstrual cycle. Nature Communications. 8 (1), 1-13 (2017).
  47. Skardal, A., et al. Drug compound screening in single and integrated multi-organoid body-on-a-chip systems. Biofabrication. 12 (2), 025017(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Testicular OrganoidsECM Culture2D ECM free3D ECM freeCellular Self assemblySertoli CellsLeydig CellsGerm CellsPeritubular CellsTissue Architecture

Related Articles