מאמר שיטה

העברת in vitro ו- in vivo של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים באמצעות מערכת אספקה שנבנתה בהתאמה אישית

4.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61413

⸱

2 ביולי 2020

 ,  , 
1Thayer School of Engineering, Dartmouth College, 2Geisel School of Medicine, Dartmouth College

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג טכניקות ומתודולוגיות הדרושות להעברה מדויקת של היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים באמצעות מערכת אספקה וניטור מתוחכמת.

תקציר

היפרתרמיה כבר זמן רב בשימוש בטיפול בסרטן. הטכניקות השתנו מהחדרה תוך-גידולית של מוטות ברזל חמים, לננו-חלקיקים מגנטיים ממוקדי נוגדנים לגידול באופן שיטתי, בטמפרטורות של 39 מעלות צלזיוס (רמת חום) עד 1,000 מעלות צלזיוס (אלקטרוקאוטריה) וזמני טיפול משניות עד שעות. הקשר בין הטמפרטורה לזמן (מינון תרמי) מכתיב את האפקט עם מינונים תרמיים גבוהים וכתוצאה מכך אבלציה של הרקמה ומינונים תרמיים נמוכים יותר וכתוצאה מכך השפעות תת-קטלניות כגון זרימת דם מוגברת, הצטברות של תרופות וגירוי חיסוני. אחד הטיפולים הרפואיים המבטיחים ביותר כיום הוא היפרתרמיה ננו-חלקיקית מגנטית (mNPH). טכניקה זו כוללת הפעלת ננו-חלקיקים מגנטיים, שיכולים להיות מועברים באופן מערכתי או תוך-גופי, עם שדה מגנטי חלופי לא פולשני ולא רעיל. הגודל, המבנה והקשר של הננו-חלקיקים המגנטיים והתדר ועוצמת השדה של השדה המגנטי הם גורמי חימום עיקריים. פיתחנו מכשור וטכניקות מתוחכמות להעברת היפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים הניתנים לשחזור במודלים של בעלי חיים גדולים וקטנים ובתאים בתרבית. גישה זו, תוך שימוש בניטור טמפרטורה רציף בזמן אמת במספר מקומות, מאפשרת מתן מנות תרמיות מוגדרות היטב לרקמת המטרה (הגידול) או לתאים תוך הגבלת חימום רקמות שאינן מטרה. בקרה וניטור מדויקים של הטמפרטורה, במספר אתרים, ושימוש באלגוריתם הסטנדרטי בתעשייה (דקות שוות ערך מצטברות ב- 43 °C / CEM43), מאפשרים קביעה וכימות מדויקים של מינון תרמי. המערכת שלנו, המאפשרת מגוון רחב של טמפרטורות, מינונים תרמיים והשפעות ביולוגיות, פותחה באמצעות שילוב של רכישות מסחריות ופיתוחים הנדסיים וביולוגיים פנימיים. מערכת זו עברה אופטימיזציה באופן המאפשר המרה מהירה בין טכניקות ex vivo, in vitro ו- in vivo. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד לתכנן, לפתח וליישם טכניקה ומערכת יעילה להעברת היפרתרמיה של טיפול בננו-חלקיקים מגנטיים (mNP) הניתנת לשחזור ומדויק.

מבוא

היפרתרמיה שימשה בעבר בטיפול בסרטן, לבדה או בשילוב עם טיפולים אחרים. למרות שיש לו היסטוריה ארוכה של שימוש, השיטה הטובה ביותר למתן טיפול זה עדיין נתונה לוויכוח והיא תלויה באתר המחלה ובמיקום. שיטות להעברת היפרתרמיה כוללות מיקרוגל, גלי רדיו, אולטרסאונד ממוקד, לייזר וננו-חלקיקים מתכתיים (כגון תחמוצת זהב או ברזל)1,2,3,4. שיטות אספקה אלה יכולות להוביל למגוון טמפרטורות טיפול מרמת חום ועד מאות מעלות צלזיוס. ההשפעה הביולוגית של היפרתרמיה תלויה בעיקר בטמפרטורות המשמשות ובמשך הטיפול5. לשם כך אנו מתמקדים בהיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים (mNPH). שיטה זו מאפשרת שינויי טמפרטורה ממוקדים, מקומיים, מנוטרים היטב ומבוקרים, תוך שימוש בננו-חלקיקים לא רעילים, מאושרים על ידי ה-FDA.

מלכודת אחת של אופני היפרתרמיה אחרים היא היעדר מיקוד תאי מדויק; היפרתרמיה אין יחס טיפולי גבוה מטבעו, ולכן, תרמומטריה זהירה ומיקוד הוא הכרחי6. mNPH מאפשר הזרקה מערכתית או תוך-גופית של mNPs, כאשר החום נוצר רק במקום שבו ממוקמים ה-mNPs, ובכך מכוון את הטיפול ישירות לגידול. mNPH יכול להיות יעיל כאשר הננו-חלקיקים המגנטיים ממוקמים בתוך התא או מחוצה לו. עבור טיפול בסרטן, הסקירה הכללית של mNPH היא כי ננו-חלקיקים מגנטיים מוזרקים (תוך כדי או תוך ורידי), ואז מופעל שדה מגנטי לסירוגין, מה שגורם לקטבים המגנטיים של ננו-חלקיקים להתיישר מחדש כל הזמן, מה שמוביל לחימום מקומי של התאים והרקמות הקשורים לננו-חלקיקים 7,8 . על ידי התאמת נפח הננו-חלקיקים והתדר/חוזק של השדה המגנטי המתחלף (AMF), ניתן לשלוט בקפידה בטמפרטורה הנוצרת בתוך הרקמה.

טיפול זה פועל היטב בגידולים הקרובים לפני השטח של הגוף, שכן גידולים עמוקים יותר דורשים AMF חזק יותר ולכן הסיכון לחימום זרם אדי עולה9. ישנן עדויות לשימוש בהיפרתרמיה קלינית כמונותרפיה, אולם לעתים קרובות היפרתרמיה משולבת עם הקרנות או כימותרפיה, מה שמוביל לאפקט אנטי-סרטני ממוקד יותר10,11,12. עדויות קליניות לכך שהיפרתרמיה פועלת בשילוב עם הקרנות נבדקות בפרסום קודם13. המעבדה שלנו טיפלה בהצלחה במגוון בעלי חיים, מעכברים ועד חזירים וסרטן כלבים ספונטני, בשיטת mNPH12,14,15. פרוטוקול זה מיועד למעוניינים לחקור את ההשפעות של טיפול היפרתרמיה מקומי, לבד או בשילוב עם טיפולים אחרים.

אחד הגורמים החשובים ביותר בהיפרתרמיה הוא היכולת למדוד ולהבין, בזמן אמת, את המינון התרמי המועבר לרקמת המטרה/הגידול. דרך סטנדרטית לחישוב והשוואת מינון היא באמצעות הדגמה של דקות שוות ערך מצטברות של חימום ב 43 מעלות צלזיוס; אלגוריתם זה מאפשר השוואה של מנות ללא תלות במערכת האספקה, טמפרטורות מקסימום ומינימום (בטווח מסוים) ופרמטרים לחימום/קירור 5,16. חישוב CEM עובד בצורה הטובה ביותר עבור טמפרטורות בין 39-57 מעלות צלזיוס5. לדוגמה, בחלק מהמחקרים שביצענו, בחרנו מנה תרמית של CEM43 30 (כלומר, 30 דקות ב 43 מעלות צלזיוס). בחירת מינון זה אפשרה לנו להסתכל על השפעות אימונוגנטיות בטוחות, יעילות, במבחנה, הן לבד, והן בשילוב עם מנה אחת של קרינה17.

עם היפרתרמיה ננו-חלקיקית מגנטית, ישנם מספר גורמים שיש לקחת בחשבון בבניית מערכת אספקה מתאימה. תכנון המכשור כולל גורמי בטיחות חשובים, כגון שימוש בצ'ילר כדי להבטיח שציוד אספקת השדה המגנטי יישאר קריר גם כאשר הוא מופעל בהספק גבוה, ונהלים בטוחים לכשל המונעים את הפעלת המערכת אם כל הטמפרטורה, הערכת ההספק ומערכות הבקרה לא הופעלו. בנוסף, ישנם גורמים ביולוגיים חשובים שיש לקחת בחשבון הן עבור מצבים in vivo והן עבור מצבים במבחנה. בעת שימוש בתאים בתרבית, יש צורך לטפל במדיה צמיחה ולשמור על טמפרטורה קיימא עקבית כדי למנוע שינויים פיזיולוגיים שעלולים להשפיע על התוצאות. עבור סוגי ננו-חלקיקים בודדים, חשוב לדעת את קצב הספיגה הספציפי (SAR) בעת חישוב פרמטרי חימום מבוססי AMF. באופן דומה, חשוב לדעת את ריכוז ה-mNP/Fe, בתאים וברקמות, הנחוץ להשגת החימום הרצוי. שיטות in vivo דורשות תשומת לב רבה עוד יותר לפרטים מכיוון שיש לשמור על בעל החיים תחת הרדמה במהלך הטיפול וטמפרטורת הגוף המרכזית של החיה נשמרת ברמה נורמלית לאורך כל הטיפול. מתן אפשרות לטמפרטורת הגוף של בעל החיים לרדת, כפי שקורה בהרדמה, יכול להשפיע על התוצאות הכוללות, ביחס למינון התרמי של הרקמה המטופלת.

בכתב יד זה אנו דנים בשיטות המשמשות לתכנון ובנייה של מערכת היפרתרמיה רב-תכליתית של ננו-חלקיקים מגנטיים, כמו גם בגורמי שימוש חשובים שיש לקחת בחשבון. המערכת המתוארת מאפשרת העברה חזקה, עקבית, מתאימה ביולוגית, בטוחה ומבוקרת היטב של היפרתרמיה ננו-חלקיקית מגנטית. לבסוף, יש לציין כי מחקרי mNPH שאנו עורכים כוללים לעתים קרובות טיפולים אחרים כגון הקרנות, כימותרפיה ואימונותרפיה. כדי שתוצאות אלה יהיו משמעותיות, חשוב לקבוע כיצד החום המועבר יכול להשפיע על היעילות ו/או הרעילות הבטיחותית של שיטות אחרות (או להיפך) ועל רווחת החיה. מסיבה זו והדוזימטריה והמצבים הטיפוליים שהוזכרו קודם לכן, חיוני להקדיש תשומת לב קפדנית לדיוק מינון ההיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים ולמדידות הליבה וטמפרטורת היעד המתמשכות. מטרת פרוטוקול זה היא לספק שיטה ותיאור פשוטים ועקביים להעברת היפרתרמיה בטוחה ויעילה של ננו-חלקיקים מגנטיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תוכנית הטיפול והשימוש בבעלי חיים של דארטמות' קולג' מוכרת על ידי האגודה האמריקאית להסמכת טיפול בחיות מעבדה (iAAALAC) ועומדת בכל ההנחיות והתקנות של UDSA ו-NIH (המשרד לרווחת חיות המעבדה). כל מחקרי ה-in vivo אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בדארטמות' קולג' (IACUC). נוהל המתת חסד תואם את הנחיות AVMA לשנת 2020 להמתת חסד של בעלי חיים.

1. מכשור/תכנון המערכת

  1. תכנן אנטנת AMF (סליל) מותאמת אישית להיות לולאה סגורה, תוך בחירת צורות ליצירת השדה המגנטי הרצוי. השתמש בנוסחאות השראה ומאפיינים מבחירת גנרטור כוח כדי לתכנן סלילים תואמים כדי ליצור את השדה הרצוי. השתמש בעיצובים שונים לניסויים in vitro ו- in vivo.
  2. ודא שהשראות אנטנת AMF נמצאות בטווח המקובל של גנרטור החשמל. הוסף או החסר קבלים כדי להתאים (לכוונן) את האנטנה למחולל החשמל.
  3. לניסויים במבחנה, תכננו סליל סלילי בעל 14 סיבובים, קוטר פנימי 2 ס"מ ואורך 14 ס"מ, שיכול להכיל צינורות של 1.5 מ"ל, המאפשרים טיפול במספר דגימות בו זמנית. לבודד את הסליל עם פולימר ויניל ולהשתמש מרווח פוליסטירן כדי להפריד את הסליל מן הצינורות. פירוט מפרט התכנון והשיקולים מצויים בתיק המשלים 1.
  4. עבור ניסויי in vivo, רכשו סליל סלילי לכל הגוף שנבנה בהתאמה אישית מיצרן עם מידע עיצובי קנייני. השתמש בצינורות מרובעים בקוטר 8 מ"מ (מכיוון שהם יוצרים שדה אחיד יותר בתוך הבור של הסליל), ורכז באזור הטיפול הממוקד. הפוך את הרכז 5.0 ס"מ אורך, עם סך של 5 סיבובים וכתוצאה מכך קוטר פנימי 3.6 ס"מ, קוטר חיצוני 5.2 ס"מ, ויש לו את מיקומו באזור הטיפול הממוקד. הקף את הסליל עם קליפת פוליקרבונט.
  5. השתמש בגנרטור AMF עם הספק ותדר מתכווננים, המדורגים בהספק של 10 קילוואט ומעלה כמקור החשמל. ההשראות מתאימות את מקור ההספק והאנטנות/סלילים לטווח של 0.62 עד 1.18 μHenries (μH), ומאפשרות תדרים הנעים בין 30-300 קילוהרץ. קירור הגנרטור באמצעות מים ממוחזרים באמצעות משאבת דחיפה צנטריפוגלית, לחץ מווסת עד 50 psi.
  6. קררו את הסלילים בעזרת צ'ילר בעל קיבולת קירור של 5.6 טון השואב נוזל העברת חום על בסיס אתילן גליקול ב-25% המדולל במים דרך אנטנת AMF. הגדר את הטמפרטורה של הצ'ילר כך שהאנטנה לא תחמם או תקרר את הדגימה.
  7. עבור הכלת החיה, בנה מחזיק צינורי שניתן לתלות במרכז הסליל עם מרווח אוויר של 0.5 ס"מ בין המחזיק למשטח הסליל. חברו משאבת אוויר ממוזגת מתכווננת המזרימה אוויר דרך הקליפה סביב הסליל וקבעו אותה כך שתשמור על טמפרטורת ליבה רגילה של בעלי חיים. חבר את מכונת ההרדמה למחזיק בעל החיים הצינורי ליד ראש החיה כדי להבטיח אספקה נאותה של הרדמה.
  8. להכלת תאים, צרו מנגנון שמזרים מים מאמבט מים דרך הספייסר שבו ממוקמים הצינורות. הגדר את הטמפרטורה של אמבט מים זה כך שהצינורות מוקפים במים ב 37 מעלות צלזיוס.
  9. השתמש בבדיקות סיבים אופטיים כדי לנטר את הטמפרטורות בתוך הגידול, ליבת החיה וסביבת בעלי החיים או לצורך מחקרים במבחנה, ניטור הטמפרטורה של גלולת התא והמים המקיפים את הצינורות.
  10. השתמש בננו-חלקיקי תחמוצת ברזל מגנטית בגודל 100 ננומטר לכל הניסויים.
    הערה: ריכוז וקצב ספיגה ספציפי (SAR) הם שני מאפיינים שיש לקחת בחשבון בעת בחירת ננו-חלקיקים, מכיוון שהם משפיעים ישירות על המינון האפשרי של חימום ותרמי18.

2. היפרתרמיה במבחנה

  1. תרבית B16F10 מורין מלנומה תאים במדיית RPMI עם 10% FBS ו-1% עט/סטרפ. צלחת 150, 000 תאים / באר ב 6 צלחות היטב, עם 2 מ"ל של בינוני שלם.
  2. לקבוע את הטיפול המתאים לכל באר, כלומר, תאים ללא mNPs וללא AMF, תאים עם mNPs וללא AMF, תאים ללא mNPs ו- AMF, תאים עם mNPs ו- AMF.
    הערה: בנוסף, ודא שיש בקרות מתאימות אם משלבים היפרתרמיה עם טיפול אחר. AMF מבוצעת במעבדת ספסל מחקר סטנדרטית עם יכולות ההספק והקירור הדרושות.
  3. 24 שעות לאחר הציפוי, יש להוסיף mNPs לבארות המתאימות כפי שנקבע בשלב הקודם. יש להוסיף mNPs לריכוז של 3 מ"ג ברזל/מ"ל. ודא שה-mNPs מופצים ברחבי הבאר, בין אם על ידי יצירת תמיסת מדיה/mNP (הסרת מדיה ישנה, הוספת תמיסה זו) או על-ידי הוספת לוחות mNPs ישירות ובעדינות לפיזור הומוגני.
  4. התחל את הטיפול, 48 שעות לאחר הוספת mNPs, כאשר בארות הם ~ 80% נפגש, על ידי הסרת המדיה ושטיפת בארות עם מדיה טרייה. הסר את המדיה.
  5. יש להוסיף 0.5 מ"ל של טריפסין לכל אחד מהמטופלים היטב, ולסובב בעדינות. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שהתאים מנותקים.
  6. הוסף 1 מ"ל של מדיה לכל באר כדי לאסוף את התאים לתוך צינורות 1.5 מ"ל. לאסוף את כל התאים מן הבאר (~ 1 x 106 תאים). השתמש בצינור נפרד מסומן בבירור עבור כל באר.
  7. סובב צינורות ב 60 x גרם במשך 2-3 דקות כדי לאפשר לתאים כדור. שמור את הכדור בתקשורת.
  8. מניחים צינורות במרווח מלא מים בתוך הסליל. הגדר את הטמפרטורה של אמבט המים כך שהמדיה וכדור התא נשמרים ב 37 מעלות צלזיוס. עקוב אחר הטמפרטורה בתוך הצינור ואמבט המים באמצעות בדיקות טמפרטורה נפרדות של סיבים אופטיים.
  9. הפעל את הצ'ילר, בדוק כי נוזל הקירור זורם דרך הסליל. הפעל את מקור החשמל והתאם את אחוז המקסימום לשדה הרצוי. הפעל את סליל הסולנואיד בעל 14 הסיבובים, המופעל על ידי גנרטור של 10 קילוואט, במהירות של 165 קילו-הרץ ו-23.87 kA/m (300 Oe).
  10. הכניסו בדיקה נפרדת של טמפרטורת סיב אופטי לתוך אחד הצינורות. לטפל בתאים עד מינון תרמי פרוטוקול שנקבע בעבר. דוגמה לכך היא 30 דקות ב-43 מעלות צלזיוס (CEM43 מתוך 30).
  11. יש לתלות מחדש תאים במדיה שנמצאת בצינורות שלהם ולהפוך אותם מחדש ל-6 לוחות באר חדשים. תייג בבירור את הלוחות החדשים. המטרה היא לצלוח מחדש את כל התאים שנאספו (~1 x 106 תאים).
    הערה: יש להשתמש ב-6 צלחות באר חדשות כדי להבטיח שהתאים שעברו תרבית יקבלו טיפול. אם משתמשים בצלחות הישנות עדיין יכולים להישאר תאים על הצלחות שלא עברו טריפסינציה מוצלחת.
  12. במידת הצורך, עבור ההליך הניסויי הבא, lyse את התאים עבור RNA או ניתוח ביטוי חלבון.

3. היפרתרמיה in vivo

  1. תרבית תאים וחיסון
    1. תרבית B16F10 מורין מלנומה תאים במדיית RPMI עם 10% FBS ו-1% עט/סטרפ. השתמש בצלחות / כלים שיספקו מספיק תאים לחיסון מספר בעלי החיים הרצוי. לדוגמה, 10, 100 מ"מ מנות, מצופה ב 100, 000 תאים יהיה מפגש עם מספיק תאים עבור 20 עכברים זריקות בתוך 48 שעות.
    2. טריפסיניזציה של תאים ואיסוף באמצעות מדיית RPMI טהורה (ללא FBS או עט/סטרפ).
    3. לספור תאים וליצור פתרון לריכוז התאים הרצוי, בהתבסס על נפח החיסון, ומספרי העכברים.
    4. הרדימו נקבות C57Bl/6 עכברות בנות 6 שבועות באמצעות איזופלורן וחמצן מאודים. הכניסו בעלי חיים לקופסת פרספקס עם 5% איזופלוראן ו-95% חמצן עד להשרה. לאחר ההשרה, יש להסיר את בעלי החיים ולהשתמש בקונוס פנים ב-2% איזופלוראן כדי להשלים את שלבים 3.1.5-3.1.7 ו-3.3.3-3.3.6.
      הערה: להרדמה במהלך הטיפול יש להשתמש בהכלת הרדמה מובנית. עקוב אחר פרוטוקולים מוסדיים סטנדרטיים להרדמה בעכבר. לפני ניסויים בבעלי חיים יש לוודא אישור IACUC מתאים. לאחר ההרדמה, החזירו את החיה לכלוב ועקבו אחר ההתאוששות כדי להבטיח שלא יהיו סיבוכים.
    5. בדוק את חוסר התגובה לרפלקסים הנכונים.
    6. לגלח את האגף הימני באמצעות מכונת גילוח חשמלית.
    7. נקו את אזור ההזרקה עם מגבון אלכוהול. להזריק 1-2 x 106 תאים , באמצעות מזרק זכוכית 100 μL עם מחט 28 גרם, מפוזר ב 50 μL של מדיה intradermally על האגף הימני מגולח של מורדם.
  2. גידול גידול/הזרקת ננו-חלקיקים
    1. מדוד גידולים בשלושה ממדים באמצעות קליפרים (אורך, רוחב ועומק), וחשב נפחים לפי (אורך x רוחב x עומק x π)/6.
    2. כאשר נפחי הגידול מגיעים ל-120 מ"מ 3 (+/- 20 מ"מ3), הניחו את בעלי החיים במחקר. תכנן את המחקר, כדי לוודא שקיימות קבוצות בקרה וטיפול מתאימות הכוללות קבוצות טיפול משולבות (כלומר, בקרה, mNPH, קרינה והשילוב).
    3. הרדמת עכברים שיקבלו mNPs כמתואר ב-3.1.4.
    4. נקו את האזור עם מגבון אלכוהול. יש להזריק mNPs לגידול 3 שעות לפני טיפול AMF. להזריק נפח כזה שהמינון הוא 7.5 מ"ג ברזל/ס"מ3 של גידול.
      הערה: נתונים שלא פורסמו מהמעבדה מצביעים על ספיגת mNP מקסימלית המתרחשת ב-3-6 שעות.
  3. טיפול AMF
    1. מרדימים את העכבר ומניחים על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הליבה.
    2. בדוק את חוסר התגובה לרפלקסים הנכונים. הסר את תג האוזן או כל חפץ מתכתי אחר על העכבר.
    3. יש להניח בעדינות בדיקת טמפרטורה של סיב אופטי משומן לתוך פי הטבעת של העכבר.
    4. מכניסים קטטר לתוך הגידול, מסירים את המחט. חותכים את הקטטר כך שהוא לא יבלוט מהגידול יותר מדי.
      הערה: צנתרי הטמפרטורה הפיברופטיים ממוקמים ומוסרים בזמן שהעכברים נמצאים בהרדמה כללית, כלומר, הצנתרים נמצאים במקומם רק במהלך הליך חימום הגידול. עכברים מקבלים מנה תת עורית אחת של תרופה משככת כאבים NSAID, קטופרופן (5 מ"ג/ק"ג), בזמן ההליך. לא ראינו אי נוחות או תחלואה בטווח הקצר או הארוך הקשורה למיקום הצנתרים.
    5. הכנס בדיקת טמפרטורה של סיב אופטי בעל 3 חיישנים לתוך הקטטר. הקטטר מגן על חיישני בדיקת הטמפרטורה של הסיבים האופטיים.
    6. הדביקו את הבדיקה הרקטלית והתוך-גופית לזנב החיה כדי להבטיח שהם יישארו במקומם.
    7. הכנס את העכבר לתוך צינור 50 מ"ל, ראש לתחתית. הצינור צריך להיות חור ליד הראש שבו ההרדמה תהיה מחוברת ומועברת.
    8. מקם את הצינור בתוך מערך הסליל וחבר מחדש את ההרדמה.
    9. הכניסו בדיקת טמפרטורה של סיבים אופטיים באופן רופף לתוך הצינור כדי למדוד את טמפרטורת הסביבה.
    10. הפעל את הצ'ילר, וודא שנוזל הקירור מופץ.
    11. בדוק וודא שתוכנת המחשב מציגה את הטמפרטורות השונות והתחל להקליט כדי לאפשר הצגת חישוב CEM43 בזמן אמת. ה- CEM43 הנדרש הוא המינון שנקבע בעבר.
      הערה: לפני הפעלת המגנט, ודא שאין פריטי מתכת מחוברים לבעל החיים, מכיוון שהם יתחממו במהירות. בנוסף, ודא שלכל מי שנמצא בחדר אין קוצב לב ושהוא בטוח להיות שם.
    12. הפעל את המגנט באחוז הספק נמוך.
    13. ודא שבדיקות טמפרטורת הסיבים האופטיים רושמות שינויי טמפרטורה. הטמפרטורות יעלו ברגע שה-AMF יופעל ככל שהשדה יגדל. ודא שטמפרטורת הליבה של החיה נשארת ב -38 מעלות צלזיוס. ווסת את טמפרטורת הליבה באמצעות מעיל האוויר הממוזג.
    14. התאם את עוצמת השדה המגנטי על ידי שינוי הכוח בגנרטור, באמצעות חוגת הבקרה המובנית, אשר בתורה שולטת ברמת הטמפרטורה בגידול.
    15. כבה את AMF פעם אחת המינון הרצוי, כפי שנקבע בעבר על ידי המשתמש (למשל CEM43 40), מושגת בתוך הגידול.
    16. לאחר כיבוי ה- AMF, הסר את הצינור מהסליל.
    17. הסר את העכבר מן הצינור, חילוץ בדיקות שונות קטטר. במידת הצורך, תייג את החיה בתג אוזן מתכתי חדש.
    18. לאחר סיום הטיפולים, כבה את הצ'ילר.
    19. לשחזר את בעלי החיים מן ההרדמה להבטיח שום סיבוכים. עקוב אחר התנהגותם כדי להבטיח חזרה לשגרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מחקרים במבחנה
התאים ישיגו וישמרו על הטמפרטורה והמינון התרמי הרצויים רק אם הכמות והריכוז של הננו-חלקיקים/הברזל המגנטיים וה-AMF מותאמים כראוי. בעת שימוש בננו-חלקיקים מגנטיים לחימום תאים במבחנה (וב-in vivo), יש לציין כי כדי להשיג היפרתרמיה בתאים עם ננו-חלקיקים מגנטיים מופנמים, יהיה צורך ברמה מסוימת של mNP/Fe תוך-תאי, ויהיה צורך במספר ובקרבה של תאים טעונים mNP, זה לזה. אם רמת ה-mNP/Fe בתאי המטרה/רקמה מספיקה כדי להשיג אפקט חימום, ניתן לכוונן את התדר והעוצמה של השדה המגנטי כדי להשיג את הטמפרטורה וההשפעות הר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

התכנון והיישום של מערכת זו מספק את היכולת לבצע ניסויים מדויקים וניתנים לשחזור בהיפרתרמיה של ננו-חלקיקים מגנטיים in vivo ו- in vivo. זה קריטי שהמערכת מתוכננת כך שהתדר ועוצמת השדה של AMF יותאמו כראוי לסוג הננו-חלקיקים המגנטיים, לריכוז ולמיקום הרקמה ולטמפרטורה הרצויים. בנוסף, ניטור מדויק של הטמפרטורה בזמן אמת הוא קריטי לבטיחות ולחישוב מינון תרמי מדויק (דקות שוות ערך מצטברות ב 43 °C / CEM). מיקום הגשושיות, כפי שהודגם באיור 1, מאפשר ניטור בזמן אמת של המינון התרמי וטמפרטורת הליבה של הגוף, כפי שנית...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחקר מומן על ידי מספרי מענקים: NCI P30 CA023108 ו- NCI U54 CA151662.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
.25% טריפסיןקורנינג45000-664זמין מחברות רבות
צינורות 1.5 מ"לאפנדורףאפנדורף 22363204זמין מחברות רבות
B16F10 תאי מלנומה של עכבריםתרבות מסוג אמריקאיCRL-6475
עכברי C57/Bl6נהר צ'ארלס027C57BL/6עכברים נקבות בנות 6 שבועות
צ'ילרמסדרת Thermal Care NQ 5שמקרר את הסליל
נוזל קירור נוזל קירורDow Chemical CompanyDowtherm SR-1נוזל קירור אנטנה
סרום בקר עובריHycloneSH30071 זמין מחברות רבות
בדיקות סיבים אופטיים, תוכנה ושלדה תוכנת אבולוציהFISO FISOהמשמשת לקריאת הטמפרטורות
מצלמת IRFlirמצלמת אינפרא אדום לניטור חימום לא מכוון
ננו-חלקיקי תחמוצת ברזלmicromod Partikeltechnologie GmbHננו-חלקיקיתחמוצת ברזל מצופה דקסטרן
סליל עכבר, סולנואידFluxtrolבהתאמה אישית נבנה
פניצילין / סטרפטומיציןקורנינג45000-652זמין מחברות רבות
מחולל RFHuttingerTIG 10/300מקור כוח
RPMI מדיהCorning45000-396זמין מחברות רבות
אוסף צ'ילר Dowtherm SR-1

מקורות

  1. Chen, X., Tan, L., Liu, T., Meng, X. Micro-Nanomaterials for Tumor Microwave Hyperthermia: Design, Preparation, and Application. Current Drug Delivery. 14 (3), 307-322 (2016).
  2. Luo, W., et al. Effects of radiofrequency ablation versus other ablating techniques on hepatocellular carcinomas: A systematic review and meta-analysis. World Journal of Surgical Oncology. 15 (1), 126(2017).
  3. Ter Haar, G. Heat and sound: Focused ultrasound in the clinic. International Journal of Hyperthermia. 31 (3), 223-224 (2015).
  4. Salunkhe, A. B., Khot, V. M., Pawar, S. H. Magnetic Hyperthermia with Magnetic Nanoparticles: A Status Review. Current Topics in Medicinal Chemistry. 14 (5), 572-594 (2014).
  5. Dewhirst, M. W., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hanson, M., Hoopes, P. J. Basic principles of thermal dosimetry and thermal thresholds for tissue damage from hyperthermia. International Journal of Hyperthermia. 19 (3), 267-294 (2003).
  6. Roizin-Towle, L., Pirro, J. P. The response of human and rodent cells to hyperthermia. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 20 (4), 751-756 (1991).
  7. Hergt, R., Dutz, S., Müller, R., Zeisberger, M. Magnetic particle hyperthermia: Nanoparticle magnetism and materials development for cancer therapy. Journal of Physics Condensed Matter. 18 (38), (2006).
  8. Kumar, C. S. S. R., Mohammad, F. Magnetic nanomaterials for hyperthermia-based therapy and controlled drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (9), 789-808 (2011).
  9. Stigliano, R. V., et al. Mitigation of eddy current heating during magnetic nanoparticle hyperthermia therapy. International Journal of Hyperthermia. 32 (7), 735-748 (2016).
  10. Johannsen, M., et al. Clinical hyperthermia of prostate cancer using magnetic nanoparticles: Presentation of a new interstitial technique. International Journal of Hyperthermia. 21 (7), 637-647 (2005).
  11. Horsman, M. R., Overgaard, J. Hyperthermia: a Potent Enhancer of Radiotherapy. Clinical Oncology. 19 (6), 418-426 (2007).
  12. Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Kaufman, P. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia enhancement of cisplatin chemotherapy cancer treatment. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 845-851 (2013).
  13. Peeken, J. C., Vaupel, P., Combs, S. E. Integrating hyperthermia into modern radiation oncology: What evidence is necessary. Frontiers in Oncology. 7, 132(2017).
  14. Petryk, A. A., Giustini, A. J., Gottesman, R. E., Trembly, B. S., Hoopes, P. J. Comparison of magnetic nanoparticle and microwave hyperthermia cancer treatment methodology and treatment effect in a rodent breast cancer model. International Journal of Hyperthermia. 29 (8), 819-827 (2013).
  15. Stigliano, R. V., Shubitidze, F., Petryk, A. A., Tate, J. A., Hoopes, P. J. Magnetic nanoparticle hyperthermia: predictive model for temperature distribution. Energy-based Treatment of Tissue and Assessment VII. 8584, 858410(2013).
  16. Dewhirst, M., Viglianti, B. L., Lora-Michiels, M., Hoopes, P. J., Hanson, M. A. Thermal dose requirement for tissue effect: experimental and clinical findings. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment II. 4954, 37(2003).
  17. Duval, K. E. A., et al. Immunogenetic effects of low dose (CEM43 30) magnetic nanoparticle hyperthermia and radiation in melanoma cells. International Journal of Hyperthermia. 36, 37-46 (2019).
  18. Giustini, A. J., Petryk, A. A., Cassim, S. M., Tate, J. A., Baker, I., Hoopes, P. J. Magnetic Nanoparticle Hyperthermia in Cancer Treatment. Nano LIFE. 01, 17-32 (2010).
  19. Hoopes, P. J., et al. Intratumoral iron oxide nanoparticle hyperthermia and radiation cancer treatment. Thermal Treatment of Tissue: Energy Delivery and Assessment IV. 6440, (2007).
  20. Semiatin, S. L., Zinn, S. Coil design and fabrication basic design and modifications. Heat Treating. , 32-41 (1988).
  21. Maxwell, J. C. On physical lines of force. The London, Edinburgh, and Dublin Philosophical Magazine and Journal of Science. 21 (139), 161-175 (1861).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Vitro

מאמרים קשורים