מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR באמצעות התקן מחולל טיפות פולימר לאבחון המטולוגי

Summary

סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תא דם לבן (WBC) תת-כמות באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA. פרוטוקול זה מציג שיטת תגובת שרשרת פולימראז טיפות טיפות כפוליות (mdPCR) באמצעות elastomer תרמופלסטי (TPE) מבוסס מיקרופלואידים התקן עבור יצירת droplet המאפשר דיוק ו- multiplex ספציפית מתילציה היעד כימות של ספירות דיפרנציאליות WBC.

Abstract

זרימת עבודה של PCR (mdPCR) של טיפות מרובות ופרוטוקול מפורט לקביעת ספירת תאי דם לבנים מבוססי אפיגנטיקה (WBC) מתוארת, יחד עם התקן ייצור טיפות מיקרופלויד (TPE) תרמופלסטי. סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תת-תחליף WBC שהוא בעל ערך פרוגנוסטי חשוב במחלות שונות. זה מושגת באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA של אזורים ספציפיים עשירים CG בגנום (CpG loci). בנייר זה, ביסובפיט שטופלו DNA מתאי דם היקפיים מונונוקולריים (PBMCs) הוא עטוף טיפות עם reagents mdPCR כולל פריימרים ובדיקות הידרוליזה פלורסנט ספציפי עבור CpG loci כי לתאם עם אוכלוסיות משנה WBC. גישת המולטיפלקס מאפשרת חקירה של CpG loci רבים ללא צורך בתגובות MDPCR נפרדות, המאפשרת קביעה פרמטרית מדויקת יותר של תת-אוכלוסיות WBC באמצעות ניתוח אפיגנטי של אתרי מתילציה. כימות מדויקת זו יכולה להיות מורחבת ליישומים שונים ומדגישה את היתרונות לאבחון קליני ופרוגנוזה עוקבות.

Introduction

ניתוח של הרכב תאי דם לבנים (WBCs) הוא בין בדיקות המעבדה הנפוצות ביותר באבחון המטולוגי. ספירת לוקוציט דיפרנציאלית משמשת כאינדיקטור לספקטרום של מחלות כולל זיהום, דלקת, אנמיה, לוקמיה, והוא נמצא תחת חקירה כסמן ביולוגי פרוגנוסטי מוקדם עבור מספר תנאים אחרים, כמו גם. תקן זהב ב-WBC subtyping כרוך בחיסונים ו/או ציתומיה זרימה ששניהם דורשים נוגדני פלורסנט יקרים, הנוטים לחוסר יציבות, ולעתים קרובות תלויים מאוד במיומנות המפעיל בהכנה לדוגמה. יתר על כן, שיטה זו ישימה לדגימות דם טריות בלבד, כך שלא ניתן להקפיא את הדגימות לצורך משלוח או ניתוח מאוחר יותר.

סמנים אפיגנטיים התגלו לאחרונה ככלים אנליטיים רבי עוצמה לחקר וריאציות פנוטיפיות. לאחר מכן, אוכלוסיות לוקוצי....

Protocol

כל הניסויים שבוצעו במחקר זה מעורבים דגימות אנושיות אושרו על ידי מועצת האתיקה של NRC ונעשה על פי המדיניות של NRC המסדיר נושאים אנושיים המצייתים להנחיות המחקר החלות ותואמת את החוקים ב Québec, קנדה.

1. הכנת תאים

1. להפשיר את תאי הדם ההיקפיים הקפואים (PBMCs) באופן מיידי על ידי הצבת cryovial באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
2. הפוך את cryovial פעמיים כדי להשתמש מחדש בעדינות את התאים ובשימוש 1 מ"ל pipette להעביר את מתלה התא לתוך צינור חרוב 15 מ"ל.
3. הוסף 10 מ"ל של חימום מראש (37 °C) גדילה בינוני בתוספת עם 10% סרום פר עוברי (RPMI-1640 + 10% FBS) לצינור 15 מ"ל המכיל את ה-PBMCs.
4. צנטריפוגה מתלי התא צנטריפוגה דל....

Results

התקן מחולל טיפות microfluidic מבוסס TPE היה מפוברק באמצעות הפרוטוקול המתואר כפי המוצג איור 1. מסיכת שקיפות שימשה בפוטוליתוגרפיה כדי להשיג סיליקון (Si) מאסטר. ליתוגרפיה רכה בוצעה כדי להשיג עותק משוכפל PDMS הפוך של מאסטר Si אשר שימש לאחר מכן כדי לפברק את עובש אפוקסי. מבשר אפוקסי נשפך על PDMS ונרפא כדי crosslink והתקשות. עובש זה, המייצג את העותק המשוכפל המדויק של מאסטר Si היה עמיד יותר עבור תרמופורמציה עוקבות של תרמופלסטיקה באמצעות התגלמות חמה. ברגע שתבנית האפוקסי הושגה, אלסטומר תרמופלסטי היה מ.......

Discussion

הפרוטוקול הניסיוני שהוצג ושיטות לאפשר mdPCR בתוך הבית באמצעות גנרטור טיפות TPE מפוברק, מחזור תרמי, מיקרוסקופ פלואורסציט. המכשיר המפוברק באמצעות TPE רך כדי TPE מליטה מאפשר מאפייני פני השטח הידרופוביים כי הם אחידים על פני כל קירות הערוץ, כך המכשיר הסופי אינו דורש כל טיפול פני השטח לשימוש הבא כמחולל טיפות. חומר זה הועסק באופן שגרתי בפלטפורמות נקודת טיפול המחייבות תאימות עם ייצור תפוקה גבוהה^9,10,11,12

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bio-Rad, מיסיסוגה, ON	TFI0201	צינור
RAN Biotechnologies, בוורלי, MA	008-FluoroSurfactant	פלואורו-פעילי שטח
סיליקון קווסט אינטרנשיונל, סנטה קלרה, קליפורניה
אוקספורד אינסטרומנטס, אבינגדון, בריטניה		מצלמת
תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		משמש לניתוח
ניקון, יפן		10x אובייקטיבי
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
פישר, קנדה
ויטרוקום, ניו ג'רזי, ארה"ב	5015 ו-5010	בורוסיליקט צינור
(http://definetherain.org.uk/)
המאמאטסו, יפן	LC-L1V5	DEL מקור
UV דולומיט	3200063	צינורות
דולומיט	3200302	צינורות נוזלים חד פעמיים
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		מיקרוסקופ
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä rding, אוסטריה
Zymo Research , אירווין, CA	D5030
Photron , סן דייגו, CA
IDT, Coralville , IA
Gersteltec , Pully , שוויץ		SU-8 photoresist
Fineline Imaging, קולורדו ספרינגס, CO
Qiagen , הילדן, גרמניה
203603 תמונה J		משמשת להערכת אנכמיה בקוטר
, מונטריאול, QC
Excelitas, MA, ארה"ב		מנורת פלורסנט LED רחבת ספקטרום
MÅ l, שוודיה		אלסטומר תרמופלסטי (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, יפן		משמש לרכישת
3M, St Paul, MN		Carrier Oil
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	כתם תא חי פלואורסצנטי כחול (DAPI)
IDEX בריאות & מדע, אוק הארבור, וושינגטון	P-881	אביזרי
סיגמא-אולדריץ', אוקוויל, ON	806552
דאו קורנינג, מידלנד, MI
Thinkyארה"ב, קליפורניה, ארה"ב	ARV 310
Ihc world, מרילנד, ארה"ב	IW-125-0
Zinsser NA, נורת'רידג', קליפורניה	2607808
Cetoni GmbHקורבוסן, גרמניה
סיגמא-אולדריץ', אוקוויל, ON	484431
Bio-Rad, מיסיסוגה, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, מיסיסוגה, ON
ניקון, מלוויל, ניו יורק		מיקרוסקופ
ניקון, יפן
לוקטיט	AA 352