מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR באמצעות התקן מחולל טיפות פולימר לאבחון המטולוגי

סיכום

סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תא דם לבן (WBC) תת-כמות באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA. פרוטוקול זה מציג שיטת תגובת שרשרת פולימראז טיפות טיפות כפוליות (mdPCR) באמצעות elastomer תרמופלסטי (TPE) מבוסס מיקרופלואידים התקן עבור יצירת droplet המאפשר דיוק ו- multiplex ספציפית מתילציה היעד כימות של ספירות דיפרנציאליות WBC.

תקציר

זרימת עבודה של PCR (mdPCR) של טיפות מרובות ופרוטוקול מפורט לקביעת ספירת תאי דם לבנים מבוססי אפיגנטיקה (WBC) מתוארת, יחד עם התקן ייצור טיפות מיקרופלויד (TPE) תרמופלסטי. סמנים אפיגנטיים משמשים עבור תת-תחליף WBC שהוא בעל ערך פרוגנוסטי חשוב במחלות שונות. זה מושגת באמצעות כימות של דפוסי מתילציה DNA של אזורים ספציפיים עשירים CG בגנום (CpG loci). בנייר זה, ביסובפיט שטופלו DNA מתאי דם היקפיים מונונוקולריים (PBMCs) הוא עטוף טיפות עם reagents mdPCR כולל פריימרים ובדיקות הידרוליזה פלורסנט ספציפי עבור CpG loci כי לתאם עם אוכלוסיות משנה WBC. גישת המולטיפלקס מאפשרת חקירה של CpG loci רבים ללא צורך בתגובות MDPCR נפרדות, המאפשרת קביעה פרמטרית מדויקת יותר של תת-אוכלוסיות WBC באמצעות ניתוח אפיגנטי של אתרי מתילציה. כימות מדויקת זו יכולה להיות מורחבת ליישומים שונים ומדגישה את היתרונות לאבחון קליני ופרוגנוזה עוקבות.

מבוא

ניתוח של הרכב תאי דם לבנים (WBCs) הוא בין בדיקות המעבדה הנפוצות ביותר באבחון המטולוגי. ספירת לוקוציט דיפרנציאלית משמשת כאינדיקטור לספקטרום של מחלות כולל זיהום, דלקת, אנמיה, לוקמיה, והוא נמצא תחת חקירה כסמן ביולוגי פרוגנוסטי מוקדם עבור מספר תנאים אחרים, כמו גם. תקן זהב ב-WBC subtyping כרוך בחיסונים ו/או ציתומיה זרימה ששניהם דורשים נוגדני פלורסנט יקרים, הנוטים לחוסר יציבות, ולעתים קרובות תלויים מאוד במיומנות המפעיל בהכנה לדוגמה. יתר על כן, שיטה זו ישימה לדגימות דם טריות בלבד, כך שלא ניתן להקפיא את הדגימות לצורך משלוח או ניתוח מאוחר יותר.

סמנים אפיגנטיים התגלו לאחרונה ככלים אנליטיים רבי עוצמה לחקר וריאציות פנוטיפיות. לאחר מכן, אוכלוסיות לוקוצייט אנושיות הראו שיש דפוסי מתילציה DNA lineage תא המאפשרים אפיון מדויק של ערכות משנה WBC. תת-ערך המבוסס על סמנים אפיגנטיים מספק אלטרנטיבה מבטיחה שאינו תלוי באיסוף דגימות דם טריות או נוגדנים יקרים, וניתן לנצלו כסמן ביולוגי לתחילת מחלות^{ורגישות 1},^,2,,3,,4,,5.

מחקרים גנומיים בוצעו עבור מיפוי נרחב של אזורים עשירים CG ספציפיים מתילציה בגנום (איי CpG) בתתי-סוגים של leukocyte כדי לזהות סמנים אפיגנטיים מועמד ספציפי תת סוגי לוקוצייט. פרוטוקולי PCR פותחו בשל סיבה זו עבור אזורי גנים מתילציה, למשל, CD3Z ו FOXP3, המתאימים CD3⁺ T-תאים ו- CD4⁺ CD25⁺ תאי T רגולטוריים (T-Regs), בהתאמה. Wiencke ואח ' הדגימו את השירות של PCR טיפות דופלקס עבור subtyping epigenetic של T-תאים, תוצאות מניבות כי מאוד לתאם עם זרימה מופעל תא מיון (FACS)^{ניתוח 6}. שיטת ניתוח גנטי כמותי זה מסתמכת על חלוקה למחיצות מולקולות חומצה גרעין תבנית ריאגנטים PCR לאלפי דיסקרטי, מוגדר נפח, טיפות בגודל תת-nanoliter המכיל אפס, אחד או יותר עותקים חומצה גרעין היעד, באמצעות אמולסיות מים בשמן מופעל על ידי microfluidics^7,8. ההגדלה PCR מתבצעת בתוך כל טיפה בודדת ועוצמת פלואורסצנטיות נקודת הקצה של כל טיפה נמדדת, ומאפשרת כימות מוחלטת של מטרות הנוכחיות בדגימה. Droplet PCR הוקמה כדי להיות מדויק יותר, מדויק, ומבחינה טכנית פשוט יותר מאשר qPCR סטנדרטי, מה שהופך אותו לשיטה נוחה יותר מבוססי מתילציה DNA להערכה קלינית של T-תאים. למרות מתודולוגיית תת-טיפוס המתפתחת במהירות, ניתוח אפיגנטי מרובה כדי לבדוק עבור אזורי CpG מתילציה שונים בו זמנית חסר. זה הכרחי לספירת דיפרנציאל לוקוצייט שגרתית.

בזאת, מכשיר מיקרו-נוזלים תרמופלסטי (TPE) טיפות טיפות מוצג ומועסק עבור מתילציה ספציפית מולטיפלקס טיפות PCR (mdPCR). הטכנולוגיה שימשה כדי לפרט סוגי משנה ספציפיים leukocyte, CD3⁺ T-תאים ו- CD4⁺ CD25⁺ T-Regs, בהתבסס על דפוסי מתילציה DNA של שושלת תאים, כלומר, וריאציה אפיגנטית של אזורי CD3Z ו FOXP3 CpG, בהתאמה. פרוטוקול מפורט עבור הפקת DNA, המרת בישולפיט ו- mdPCR מתואר בקונצרט עם שיטת ייצור עבור מכשיר דור טיפות TPE. התוצאות המייצגות של השיטה מושוות לאלה של כתמי חיסון המדגישים את התועלת של הגישה המוצעת.

פרוטוקול

כל הניסויים שבוצעו במחקר זה מעורבים דגימות אנושיות אושרו על ידי מועצת האתיקה של NRC ונעשה על פי המדיניות של NRC המסדיר נושאים אנושיים המצייתים להנחיות המחקר החלות ותואמת את החוקים ב Québec, קנדה.

1. הכנת תאים

1. להפשיר את תאי הדם ההיקפיים הקפואים (PBMCs) באופן מיידי על ידי הצבת cryovial באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
2. הפוך את cryovial פעמיים כדי להשתמש מחדש בעדינות את התאים ובשימוש 1 מ"ל pipette להעביר את מתלה התא לתוך צינור חרוב 15 מ"ל.
3. הוסף 10 מ"ל של חימום מראש (37 °C) גדילה בינוני בתוספת עם 10% סרום פר עוברי (RPMI-1640 + 10% FBS) לצינור 15 מ"ל המכיל את ה-PBMCs.
4. צנטריפוגה מתלי התא צנטריפוגה דלי מתנדנד בטמפרטורת החדר במהירות של 330 x g במשך 10 דקות עם האצה מהירה ואת הבלם על גבוה.
5. ברגע שהספין נגמר, בזהירות לתן את supernatant. תולה מחדש את גלולת התא ב 3 מ"ל של פוספט מאגר תמיסת מלח (PBS) pH 7.2, המכיל 2 m אתילנדיאמיןtetraacetic חומצה (EDTA) על ידי הקשה על הצד של הצינורות.
6. מערבבים את התאים על-ידי היפוך הצינור עם המכסה סגור היטב.
7. להכין שני microtubes 1.5 מ"ל ובשימוש aliquot pipette 1.5 מ"ל של מתלה התא בכל צינור, אחד מהם משמש עבור הכתמת חיסון לאחר מכן ואחד לחילוץ ה-DNA.

2. פרוטוקול התכתם והדמיה חיסונית

1. תאים תלויים מחדש (מ 1.7) ב 200 μL של מאגר PBS המכיל 0.1% נתרן אזיד ו 2% FBS ולהתאים את הריכוז הסופי של מתלה התא למקסימום של 2 x 10⁷ תאים / מ"ל.
2. חלק את מתלה התא על ידי pipetting 100 μL נפח בשני microtubes נפרד 1.5 מ"ל.
3. הוסף 20 μL נפח של אנטי-Hu CD3 / CD4 בהתדדות עם פלואורסין isothiocyanate (FITC) ו Phycoerythrin (PE) לצינור אחד ואנטי-Hu CD4 / CD25 יחד עם FITC ו- PE (ראה טבלת חומרים)לצינור השני, בהתאמה.
4. הוסף טיפה אחת של כתם תא חי פלורסנט כחול (ראה טבלת חומרים)לכל שפופרת.
5. דגירה בטמפרטורת החדר באמצעות מסובב צינור במשך 2 שעות. הגן מפני אור.
6. צנטריפוגה מתלי התא בטמפרטורת החדר ב 330 x g במשך 10 דקות עם האצה מהירה ואת הבלם על גבוה.
7. תקטנו את הסופרנטנט והתחברו בזהירות את גלולת התא על ידי הקשה על הצינור. הוסף 1 מ"ל של PBS, pH 7.2 המכיל 2 mM EDTA. כדי לוודא כי הכובע סגור בחוזקה, לערבב את התאים על ידי היפוך הצינור 2x.
8. חזור על שלבים 2.6 ו- 2.7 עבור שלוש פעמים.
9. תאים עצמאיים ב- 20 μL של PBS pH 7.2 המכיל 2 mM EDTA.
10. פיפטה 10 μL טיפה של מתלה התא על שקופית מיקרוסקופ borosilicate ולחכות 2 דקות לתאים לתאים לשעמם לאט לתחתית הטיפה.
11. מניחים בזהירות החלקה על מכסה זכוכית על החלק העליון של שקופית המיקרוסקופ ולמקם את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ הפוך.
12. הקלט תמונות של התאים באמצעות מטרה 10x ומצלמת EMCCD מחובר למיקרוסקופ עבור כל פלואורופורים עבור שתי דגימות מתלי התא.
13. ספירה ידנית של תאים המסווים בתווית פלורסנטית (ראה מידע משלים עבור נתונים גולמיים).
14. קח את היחס של אנטי-Hu CD3 ואנטי-Hu CD4/ CD25 תאים עם תוויות לתאים מוכתמים DAPI כדי להשיג את הפרופורציות של CD3⁺ T-תאים ו- CD4⁺ CD25⁺ T-Regs ללוקוצייט סה"כ.

3. הפקת DNA והמרת בישולפיט

1. הפקת דנ"א
   הערה: חלץ דנ"א ממחשבי PC שהוכנו בסעיף 1 באמצעות ערכת טיהור DNA מגנטית (ראה טבלת חומרים)בעקבות הליכים שסופקו על-ידי היצרן.
   1. ב צינור 1.5 מ"ל להשעות תאים ב 100 μL של PBS ולהוסיף 20 μL של חלבון K ו 400 μL של מאגר Lysis / איגוד. מערבבים על ידי התפתלות כלפי מטה 10x, ולאחר מכן לבצע דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   2. ללכוד את קומפלקס חרוז DNA על ידי הצבת הצינור על מתלה מגנטי במשך 1-2 דקות, לאחר מכן בזהירות להסיר ולהיפטר supernatant.
   3. הסר את הצינור המכיל את קומפלקס חרוז ה-DNA ממדף מגנטי ולתהוס מחדש את החרוזים ב 600 μL של מאגר כביסה #1 לשטוף כל כריכה לא ספציפית.
   4. מניחים שוב את הצינור על המדף המגנטי ומסירים בזהירות וזורקים את הסופרנטנט.
   5. חזור על שלבים 3.1.3 ו- 3.1.4 עם 600 μL של מאגר #2.
   6. השאר את הצינור פתוח לייבוש אוויר למשך דקה אחת.
   7. הסר את הצינור מהמדף המגנטי ולחץ על ה-DNA על-ידי חלוקת 100 μL של חוצץ אלגנטיות וצינור קומפלקס ה-DNA/חרוז למעלה ומטה פי 20.
   8. מניחים את הצינור המכיל את ה-DNA האלגנטיות שוב על המדף המגנטי ותדגם במשך 1-2 דקות כדי להפריד את החרוזים המגנטיים מהדנ"א הנתעב.
   9. העבר את תמיסת הדנ"א המטוהרת לצינור נקי חדש.
   10. להעריך את הריכוז של דגימת ה-DNA מטוהר על ידי מדידת הספיגה ב 260 מילימטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
2. המרת בישולפיט
   הערה: בצע את המרת הבישולפיט בדנ"א מטוהר באמצעות ערכת מתילציה (ראה טבלת חומרים)בהתאם לנוהלי היצרן.
   1. כדי 20 μL של דגימת DNA (200-500 ng) בצינור PCR להוסיף 130 μL של Reagent המרה. מערבבים היטב ומסובבים בקצרה.
   2. העבר את צינור ה-PCR למחזור תרמי ובצע את פרוטוקול הרכיבה כדלקמן: 98°C למשך 8 דקות; 54°C ל-60 דקות והחזק ב-4°C.
   3. הוסף 600 μL של מאגר האיגוד לעמודת כרומטוגרפיה יון (IC) הממוקמת בצינור אוסף.
   4. הוסף את דגימת ה-DNA לעמודת IC המכילה את מאגר האיגוד והתערבב על-ידי היפוך הצינור מספר פעמים. צנטריפוגה ל-30 שניות במהירות מלאה. בטל את הזרימה שנאסף.
   5. לעמודה עכשיו להוסיף 100 μL של מאגר כביסה. בצע צנטריפוגציה כמתואר בשלב 3.2.4 ובטל את הזרימה דרך.
   6. להוסיף 200 μl של חיץ Desulfonation ולבצע דגירה בטמפרטורת החדר במשך 15-20 דקות. צנטריפוגה ולהיפטר הזרימה דרך כמתואר בשלבים לעיל.
   7. הוסף 200 μL של מאגר כביסה לעמודה. צנטריפוגה במהירות מלאה במשך 30 שניות ולזרוק את הזרימה דרך.
   8. חזור על שלב 3.2.7.
   9. להעביר את העמודה צינור אוסף חדש 1.5 מ"ל ולהוסיף 100 μL של מים ברמת PCR על קרום העמודה. צנטריפוגה במהירות מלאה במשך דקה אחת כדי לתחמק מהדנ"א.
   10. להעריך את הריכוז של דגימת DNA bisulfite המרה על ידי מדידת הספיגה ב 260 טנומטר באמצעות ספקטרופוטומטר.
       הערה: השתמש בערך של 40 μg/mL לספיגה ב- 260 nm = 1.0.
   11. אחסן דנ"א ב-20°C לאחסון לטווח קצר או ב-70°C לאחסון לטווח ארוך.

4. ייצור מכשיר דור Droplet

הערה: התקן מיקרו-נוזלים המשמש ליצירת טיפות (קובץ CAD המסופק במידעהמשלים) היה מפוברק בסביבה של חדר נקי (Class 1,000) באלסטומר תרמופלסטי (ראה טבלת חומרים)באמצעות התגלמות חמה שנוצרה על-ידי הפרוטוקול הבא.

1. ייצור עובש SU-8
   1. הכן תבנית SU-8 על וופל סיליקון "6 באמצעות פוטוליתוגרפיה סטנדרטית כמפורט להלן.
   2. נקה וופל סיליקון בגודל 6 אינץ' באמצעות פלזמת חמצן ב-500 ואט ל-10 שניות.
   3. ספין-מעיל SU-8 להתנגד על וופל סיליקון ב 900 סל"ד עבור 40 s כדי להשיג עובי סרט כולל של 100 μm.
   4. מניחים את הוופל על פלטה חמה ואופים מראש במשך 15 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, ואחריהם 2 שעות ב-95 מעלות צלזיוס.
   5. לחשוף אור UV ב 365 צפון ל(Hg i-line) באמצעות מסכה שקיפות בהבחנה גבוהה באמצעות מינון חשיפה של 1,000 mJ/cm².
   6. מניחים את הוופל על פלטה חמה ולאחר האפייה במשך 15 דקות ב-65 מעלות צלזיוס, ואחריהם 40 דקות ב-95 מעלות צלזיוס.
   7. פיתוח על ידי טבילה פרופילן גליקול מונומתיל אתר אצטט (PGMEA) במשך 5 דקות.
   8. לשטוף עם PGMEA ואיזופרופנול ויבש עם זרם של גז חנקן.
   9. מניחים את הוופל על פלטה חמה ואופים במשך 2 שעות ב-135 מעלות צלזיוס.
   10. Silanize הוופל במייכל ואקום המכיל טיפה של סוכן silanizing (tricholoro perfluorooctyl silane) הניח על שקופית מיקרוסקופ זכוכית סמוכה במשך 2 שעות.
       הערה: נעשה כדי להפוך את silanes טופס מונומר על פני השטח של SU-8 מאסטר. Tricholoro perfluorooctyl סיליאן תמיד צריך להיות מטופל ב מכסה המנוע אדים והתרחק ממקורות מים.
2. עותק משוכפל של פולידימתילסילוקסן (PDMS)
   1. הכן prepolymers נוזלי של PDMS (ראה טבלת חומרים)ביחס 10:1 w /w של בסיס אלסטומר לחומר ריפוי בספל פלסטיק.
   2. מניחים את הספל במיקסר ואקום צנטריפוגלי פלנטרי כדי לערבב ולדלג על תערובת PDMS.
   3. יוצקים תערובת PDMS על התבנית הממוקמת במחזיק מתכת מותאם אישית המונע דליפת שף ולרפא ב 65 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות.
   4. בעזרת פינצטה, קלף בזהירות את תבנית ה-PDMS מתבנית SU-8.
3. עובש אפוקסי
   הערה: עובש אפוקסי היה מפוברק מSU-8 / סיליקון מאסטר באמצעות תהליך שכפול ביניים עם PDMS.
   1. הכן את שרף האפוקסי (ראה טבלת חומרים)באמצעות יחס של 100/83 w/w של שרף/מקשיח.
   2. Degas את התערובת תחת לחץ מופחת באמצעות תנור ייבוש ואקום במשך 30 דקות.
   3. יוצקים את ה-Resin מעל העותק המשוכפל של PDMS ותרפאו ב-80°C למשך 12 שעות.
   4. הסר את תבנית האפוקסי המשובשת מהעתק PDMS, מניחים על פלטה חמה ואופים ב-2 שעות ב-120°C.
4. התקן TPE
   1. כדוריות הבלטה של TPE (ראה טבלת חומרים)ב-165°C בעובי 2.0 מ"מ וברוחב 7 אינץ' באורך של מספר מטרים ומאחסנים אותם ככיל לשימוש עתידי.
   2. חותכים את גיליון ה-TPE מהגליל באמצעות מספריים לריבוע של 7 אינץ'.
   3. מקם את גיליון TPE בין עובש אפוקסי וופל סיליקון סילאני ללא דוגמאות (ראה שלב 4.1.10 עבור הליך סילאניזציה וופל).
   4. בצע התבעוב חם בטמפרטורה של 125 °C, כוח מוחל של 10 kN, ולחץ של 10^-2 mbar במשך 10 דקות.
   5. דמולד בזהירות בטמפרטורת החדר באמצעות תרסיס מתנול כדי להפריד את TPE מובחן מוופל הסיליקון ועובש אפוקסי.
   6. חותכים עוד גיליון מרובע של TPE בגודל 7 אינץ' ומנחים אותו בין שני וופלים מסיליקון ללא דוגמאות.
   7. בצע התבעוב חם בטמפרטורה של 140 °C, כוח מוחל של 10 kN, ולחץ של 10^-2 mbar במשך 10 דקות כדי ליצור משטח מישור לסגירת הערוצים ולאיטום המכשיר.
   8. Demold בזהירות בטמפרטורת החדר באמצעות תרסיס מתנול כדי להפריד את TPE מובחן משני וופלים סיליקון.
   9. חותכים כל אחד מגליונות TPE עם ההתלואה לגודל ההתקן באמצעות להב רופא.
   10. נווט את חורי הגישה של הערוצים פנימה ושקע בהתקן המומבנה באמצעות מחט ניקוב ביופסיה 1 מ"מ עם בוכנה.
   11. הקף את הערוצים על-ידי הצבת התקן TPE מישורי במגע ישיר עם הערוצים בטמפרטורת החדר.
   12. לחלופין, מניחים בתנור ב-70°C למשך 2 שעות כדי לקדם את מליטה ההתקן.
   13. התאם את חורי הגישה עם צינורות נוזליים חד פעמיים (תעודה זוהה 0.25 מ"מ, O.D. 0.8 מ"מ). אטמו את המפרקים באמצעות דבק אפוקסי כדי להבטיח מניפולציה חסינת דליפה.

5. דור טיפות וPCR

הערה: טבלה 1 מתארת מידע על פריימרים קדימה והפוך יחד עם בדיקות הידרוליזה מרווות כפולות עבור גנים C-LESS, CD3Z ו- Foxp3, הנדרשים להגברת מולטיפלקס של מטרות גנים דמטילציה.

1. הכן את תערובת האב כמתואר בטבלה 2.
2. הפשרת כל הרכיבים של תערובת האב למעט תערובת האנזימים. מערבבים היטב את תערובת המאסטר על-ידי התפתלות כלפי מטה וספין כלפי מטה לזמן קצר.
3. הוסף את אמצעי האחסון המתאים (1 μL) של בישולפיט מומר DNA (מסעיף 3.2) לתערובת מאסטר בצינור PCR. מערבבים את התגובה על ידי התפתלות כלפי מטה וספין למטה לזמן קצר.
4. חבר צינורות נוזליים חד פעמיים (I.D. 0.25 מ"מ, O.D. 1.6 מ"מ) לשני מזרקי זכוכית מדויקים (נפח של 250 μL) באמצעות אביזרי PEEK.
5. תכילו מזרק זכוכית אחד מדויק עם 250 μL של שמן נושא המכיל 5% פלואורו-פעילי שטח.
6. מילוי מזרק זכוכית מדויק נוסף עם 50 μL של שמן נושא לפני טעינת 100 μL של תמהיל PCR כדי להבטיח חלוקת נפח המדגם כולו במהלך אמולסיה.
7. הגדר מכשיר מיקרו-נוזל טיפה על במה של מיקרוסקופ אור זקוף מצויד במצלמה במהירות גבוהה כדי לצפות ולהקליט היווצרות טיפות בזמן אמת.
8. מקם את המזרקים הממולאים מראש על משאבת המזרק הניתן לתכנות ובשימוש ב-PEEK Union עם אביזרים (ראה טבלת חומרים),חבר את הצינורות של המזרקים לצינורות של צינורות הבלתי מתכלים המתאימים של ההתקן המיקרו-נוזל droplet.
9. מקם את הצינורות מהשקע של גנרטור הטיפות בתוך צינור PCR 0.5 מ"ל.
10. להתאים את קצב הזרימה של משאבת המזרק ל 2 μL/min ולאפשר את גודל הטיפה להתייצב לפני איסוף אמולסיה וכתוצאה מכך.
11. לאסוף את אמולסיה ולהעביר 75 μL לצינור PCR 0.2 מ"ל לרכיבה תרמית.
12. ודא כי תכולת השמן בצינור PCR תואם באופן הדוק את נפח השלב המפוזר על מנת למנוע התמזגות של טיפות במהלך רכיבה תרמית.
13. מקם את צינור PCR 0.2 מ"ל ברכיבה תרמית ובצע את פרוטוקול רכיבה על אופניים כדלקמן: חימום מראש ב 95 °C במשך 5 דקות, לאחר מכן 45 מחזורים של denaturation ב 95 ° C עבור 15 s ו annealing / הארכה ב 60 °C עבור 30 s.
14. השתמש בתחלוב הנותר כדי למלא צינור נכים בורוסיליאט (עומק 100 μm) עם פרופיל מלבני כדי טיפות תמונה ולהעריך את קוטר הטיפות.
15. מניחים את צינור הבורוסיליץ מלא בתחלומה על מגלשת מיקרוסקופ. השתמש במיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמת EMCCD ובמטרה של פי 10 כדי להקליט תמונות שדה בהירות של הטיפות.
16. מדוד את קוטר הטיפות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה כמפורט להלן.
17. הגדר את קנה המידה של המרחק המוכר במיקרונים המתאימים למספר הפיקסלים בתמונה על-ידי בחירה בלחצן 'נתח' ולאחר מכן 'קבע קנה מידה'.
18. המר את התמונה לגווני אפור על-ידי בחירהבלחצן' תמונה' ולאחר מכן 'Type'. כוונן את הבהירות והניגודיות במידת הצורך. הגדר סף ידני כדי להגדיר ולמלא את העיגולים על-ידי בחירה בלחצן 'תמונה' ולאחר מכן 'התאם סף'.
19. נתח את החלקיקים על-ידי בחירהבלחצן' נתח חלקיקים ' והגדרת המעגליות ל- 0.75 – 1.
20. השג את האזור שנוצר ואת הקוטר של טיפות נמדד אשר מוצג באופן אוטומטי בתוכנה.
21. מחשב את קוטר הטיפות הממוצע ובהנחה של טיפה כדורית, העריך את אמצעי האחסון של המחיצה, אשר ישמש לחישוב ריכוז יעד מוחלט.
22. ודא כי הטיפות הן monodisperse על ידי ניתוח מקדם וריאציה (CV) אשר נלקח כיחס של סטיות תקן לערכי ממוצע (k = 1), עבור קוטר droplet (< 3%).

6. הדמיית פלואורסץ וניתוח תמונה

1. הדמיית פלואורסץ
   1. לאחר ההגדלה, להעביר את אמולסיה PCR לתוך צינור נכים borosilicate (50 μm עומק) עם פרופיל מלבני על מנת לסדר טיפות לתוך מונו-שכבת סגורה להדמיה.
   2. לתקן את הנימים מלא על שקופית מיקרוסקופ ולאטום את שני הצדדים באמצעות דבק אקרילי UV. החל מקור אור UV על דבק UV להיות זהיר לא להאיר את אמולסיה כדי למנוע הלבנה הדגימה.
   3. טען את מגלשת הזכוכית על מיקרוסקופ הפוך המצויד במצלמת EMCCD ומטרה של פי 10.
   4. באמצעות תוכנת הדמיה מיקרוסקופית, בחר לרכוש | Live - מהיר כדי להתחיל ברכישת מצלמה בזמן אמת, לצפות בדגימה, ולהבטיח כי רוחב נמת נלכד.
   5. הגדר את מנורת השדה הבהירה עבור תאורה דיאסקופיסית ב- 3.5 V.
   6. הגדר את מנורת ה-LED הפלורסנט בעלת הספקטרום הרחב להארה אפיסקופית בעוצמה של 20%.
   7. כוונן את הגדרת הלכידה עבור כל אורכי הגל (שדה בהיר, FAM, HEX ו- Cy5) באופן ידני על-ידי בחירה ב-Calibration | הפקודה 'תצורות אופטיות' תוכנת ההדמיה. עבור כל פלואורופור, קוביית מסנן הפלואורסץ המתאימה צריכה להיות מוחלפת באופן ידני. יש להשתמש בקוביית מסנן עבור הדמיית השדה הבהיר כדי לשמור על אותו נתיב אופטי.
   8. התאם את זמן החשיפה באופן ידני לפני רכישת תמונה באמצעות Acquire | הפקודה 'הגדרות מצלמה' עבור כל פלואורפור כפי שמסוכם בטבלה 3. הגדר את מצב הקריאה EM לקבל 17 MHz ב 16 סיביות עם מכפיל רווח של 100בתפריט' הגדרות לכידה ' של התוכנה.
   9. בחלון LUT של התוכנה, הגדר את קנה המידה של LUTs כך שאות השידור יהיה מוקף בטווח הזמן. בניסוי זה נקבע קנה המידה מ-500 ל-12,000 כ- 500.
   10. הפוך את הלכידה לאוטומטית באמצעות תוכנית רכישה מרובת נקודות באמצעות אפשרויות סריקת XY ואורך גל מרובים בסדר ספציפי זה. ודא שהשלב עובר למיקום הראשוני, לכוד את כל אורכי הגל השונים ולאחר מכן המשך למיקום הבא.
   11. תחילה, הגדר את סריקת XY על-ידי התאמה אישית של פרופיל סריקת XY בתפריט הסריקה XY של התוכנה. ב 'הגדרת מרובה נקודות מותאמתאישית ', בחר את תיבת הגדרת התמונה הגדולה והגדר אותה כ- 40.0 x 1.0 מ"מ בערך (אורך מילוי ההדמיה). השתמש ב-1% חפיפה.
   12. הפעל את האפשרות 'השתמש במשטחפוקוס ' והגדר את עקומת משטח המוקד על-ידי התאמת מישור המיקוד בנקודות שונות על המדגם באמצעות ידית המיקוד במיקרוסקופ.
   13. שנית, הגדר את סריקת אורך הגל המרובה על-ידי בחירת כרטיסיית הסריקה. הוסף כל אחת מהתצורות האופטיות שנוצרו בשלב 6.1.7 עבור כל אורך גל.
   14. לחץ על האפשרות לסגור תריס פעיל במהלך תנועת שלב ובמהלך שינוי מסנן כדי למנוע הלבנה של הדגימה ולהפעיל את הרכישה על-ידילחיצה על לחצן' התחל הפעלה '. יצא כל מסגרת רכישה לקבצי iff וחלק כל ערוץ לקובץ מופרד באמצעות אפשרות פיצול קבצים מרובים ועל-ידי החלת הגדרות גרפיות כלליות שמורות. השתמש באפשרות שם נקודה ושם ערוץ כדי להבדיל בקלות כל קובץ תמונה.
2. ניתוח תמונות
   1. מיין את כל התמונות שנרכשו לפי מסנני brightfield ופלואורסץ כדי להעלות לתוכנה לניתוח תמונות ב קוד פתוח.
   2. השתמש בתוכנה לניתוח תמונה כדי ליצור צינור כדי לזהות את כל הטיפות באמצעות תמונות brightfield, ולאחר מכן למדוד את העוצמה של טיפות פלורסנט המשויכות.
   3. כדי לצינור, העלה תמונות טיף של brightfield ופלואורסצינטי ולאחר מכן הוסף מודולים 'ColorToGray', 'IdentifyPrimaryObjects', 'MeasureObjectIntensity', ו -ExportToSpreadsheet'. השתמש בתמונות טיפות brightfield כדי לזהות אובייקטים ולאחר מכן השתמש באובייקטים כמסיכה כדי למדוד את עוצמת תמונות הפלורסנט.
   4. הפעל צינור עם תמונות tiff נבחרות כדי לחלץ את עוצמת הפלואורסצנס הממוצעת של תמונות טיפות פלואורסצנציה. לערוך את הניסוי בשלושה אנשים, כאשר כל קבוצה מורכבת מ-5,000 טיפות לניתוח.
   5. החל אתהאלגוריתם ' definetherain' (http://definetherain.org.uk/) כדי לזהות את אשכולות הטיפות החיוביים והשליליים. החיוביים צריכים להיות בתוך 3 סטיות תקן של ממוצע. פעולה זו קובעת את עוצמת הסף של טיפות חיוביות שישמש לספירה.
   6. השתמש שוב בתוכנה לניתוח תמונה כדי ליישם צינור חדש שבו סף הפלואורסצינציה עבור כל יעד גן מוגדר כהגדרה בשלב הקודם.
   7. העלה תמונות ברייטפילד ופלורסנט לצינור. הוסף מודולים 'ColorToGray', 'RescaleIntensity', 'סף', 'זיהויPrimaryObjects', 'MeasureObjectSizeצורה', 'סינוןמחזים', ו -ExportToSpreadsheet'. צור מודולים ייחודיים עבור תמונות brightfield וכל מסנן פלואורסץ עבור טיפות.
   8. שנה את קנה המידה של עוצמת התמונה מ- 0 ל- 1 עבור כל קבוצת תמונות פלואורסס לאחר מכן הגדר את הסף כדי לזהות ולספור את האובייקטים מעל הסף שנקבע. במידת הצורך, הוסף אתהמודול ' ExpandOrShrinkObjects' כדי לכווץ אובייקטים כדי להקל על ספירה וזיהוי של טיפות ב- brightfield.
   9. זהה אובייקטים בגודל נבחר בלבד של 20-30 פיקסלים וסנן את העצמים שסופרו כדי לשמור על עצמים אלה רק בקוטר מסוים (כלומר, טיפות בטווח של 75 μm) ומוזרות כדורית עגולה של 0.5 ומטה.
   10. יצא את התוצאות לטבלה המפרטת את ספירת הטיפות הכוללת מתמונות brightfield, כמו גם ספירות טיפות של כל ערוצי הפלואורסץ בהם נעשה שימוש; כלומר Cy5 עבור גן C-LESS, HEX עבור גן CD3Z מתילציה, ו FAM עבור גן FOXP3 מתילציה (ראה מידע משלים עבור נתונים ניסיוניים גלם שהושגו עבור edPCR שהוצגה בשם).
   11. חשב את היחס בין טיפות שליליות עבור כל יעד גן ולהחיל התפלגות Poisson כדי להשיג את העותקים המתאימים לכל טיפות (CPD) באמצעות משוואה 1:
       
       כאשר x מייצג את מספר הטיפות המכילות 0, 1, 2 או יותר מולקולות, ומייצג את ערך CPD.
   12. חשב, ריכוז היעד המוחלט על-ידי לקיחת היחס של ערך CPD ואת אמצעי האחסון droplet שהושג בשלב 5.20 עם משוואה 2:
       
       כאשר הערך (1-p) מייצג את השבר של טיפות שליליות.
   13. חשב את אחוז CD3⁺ T-תאים ו- CD4⁺ CD25⁺ T-Regs על-ידי חלוקת ערכי CPD בהתאמה של גנים CD3Z ו- FOXP3 מתילציה על-ידי C-LESS – או תא כולל – ערך CPD (ראה מידע משלים עבור חישובי CPD מנתונים גולמיים).
   14. השווה ערכי אחוזים אלה לאלה המתקבלים מהדמיית אימונו-לודרשים באמצעות נוגדנים עבור CD3⁺ T-Cell ו- CD4⁺ CD25⁺ ספירת T-Reg.

תוצאות

התקן מחולל טיפות microfluidic מבוסס TPE היה מפוברק באמצעות הפרוטוקול המתואר כפי המוצג איור 1. מסיכת שקיפות שימשה בפוטוליתוגרפיה כדי להשיג סיליקון (Si) מאסטר. ליתוגרפיה רכה בוצעה כדי להשיג עותק משוכפל PDMS הפוך של מאסטר Si אשר שימש לאחר מכן כדי לפברק את עובש אפוקסי. מבשר אפוקסי נשפך על PDMS ונרפא כדי crosslink והתקשות. עובש זה, המייצג את העותק המשוכפל המדויק של מאסטר Si היה עמיד יותר עבור תרמופורמציה עוקבות של תרמופלסטיקה באמצעות התגלמות חמה. ברגע שתבנית האפוקסי הושגה, אלסטומר תרמופלסטי היה מ...

דיון

הפרוטוקול הניסיוני שהוצג ושיטות לאפשר mdPCR בתוך הבית באמצעות גנרטור טיפות TPE מפוברק, מחזור תרמי, מיקרוסקופ פלואורסציט. המכשיר המפוברק באמצעות TPE רך כדי TPE מליטה מאפשר מאפייני פני השטח הידרופוביים כי הם אחידים על פני כל קירות הערוץ, כך המכשיר הסופי אינו דורש כל טיפול פני השטח לשימוש הבא כמחולל טיפות. חומר זה הועסק באופן שגרתי בפלטפורמות נקודת טיפול המחייבות תאימות עם ייצור תפוקה גבוהה^9,10,11,12

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Bio-Rad, מיסיסוגה, ON	TFI0201	צינור
RAN Biotechnologies, בוורלי, MA	008-FluoroSurfactant	פלואורו-פעילי שטח
סיליקון קווסט אינטרנשיונל, סנטה קלרה, קליפורניה
אוקספורד אינסטרומנטס, אבינגדון, בריטניה		מצלמת
תרמו פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA	MA5-16728
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	22-8425-71
CellProfiler		משמש לניתוח
ניקון, יפן		10x אובייקטיבי
American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	PCS-800-011
Ramé-Hart Instrument Co. (Netcong, NJ)	p/n 200-U1
פישר, קנדה
ויטרוקום, ניו ג'רזי, ארה"ב	5015 ו-5010	בורוסיליקט צינור
(http://definetherain.org.uk/)
המאמאטסו, יפן	LC-L1V5	DEL מקור
UV דולומיט	3200063	צינורות
דולומיט	3200302	צינורות נוזלים חד פעמיים
IDT, Coralville, IA
Nikon, Melville, NY		מיקרוסקופ
Cytec Industries, Woodland Park, NJ
EV Group, Schä rding, אוסטריה
Zymo Research , אירווין, CA	D5030
Photron , סן דייגו, CA
IDT, Coralville , IA
Gersteltec , Pully , שוויץ		SU-8 photoresist
Fineline Imaging, קולורדו ספרינגס, CO
Qiagen , הילדן, גרמניה
203603 תמונה J		משמשת להערכת אנכמיה בקוטר
, מונטריאול, QC
Excelitas, MA, ארה"ב		מנורת פלורסנט LED רחבת ספקטרום
MÅ l, שוודיה		אלסטומר תרמופלסטי (TPE)
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	13-400-518
Nikon, יפן		משמש לרכישת
3M, St Paul, MN		Carrier Oil
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA	R37605	כתם תא חי פלואורסצנטי כחול (DAPI)
IDEX בריאות & מדע, אוק הארבור, וושינגטון	P-881	אביזרי
סיגמא-אולדריץ', אוקוויל, ON	806552
דאו קורנינג, מידלנד, MI
Thinkyארה"ב, קליפורניה, ארה"ב	ARV 310
Ihc world, מרילנד, ארה"ב	IW-125-0
Zinsser NA, נורת'רידג', קליפורניה	2607808
Cetoni GmbHקורבוסן, גרמניה
סיגמא-אולדריץ', אוקוויל, ON	484431
Bio-Rad, מיסיסוגה, ON	1861096
Hitachi High-Technologies, מיסיסוגה, ON
ניקון, מלוויל, ניו יורק		מיקרוסקופ
ניקון, יפן
לוקטיט	AA 352