הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיצוי DNA אוטומטי למחצה מנגעים משובצים בפרפין קבוע פורמלין בעורקי הצוואר האנושיים. ליזיס הרקמות מתבצע ללא קסילן רעיל, שלאחריו פרוטוקול מיצוי DNA אוטומטי, כולל שלב ליזה שני, קשירת DNA לחלקיקים פרמגנטיים לקשירה מבוססת תאית, שלבי שטיפה ופליטת DNA.
רקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) מייצגות מקור רב ערך לניתוחים מולקולריים ומחקרים גנומיים קליניים. רקמות אלו לרוב דלות בתאים או קשות לעיבוד. לכן, יש לבודד בזהירות חומצות גרעין. בשנים האחרונות נקבעו שיטות שונות לבידוד DNA לרקמות ממחלות רבות, בעיקר סרטן. למרבה הצער, DNA גנומי המופק מרקמות FFPE מתפרק מאוד עקב הקישור הצולב בין גדילי חומצות גרעין וחלבונים, כמו גם שברים אקראיים ברצף. לכן, איכות ה-DNA מדגימות אלה מופחתת באופן ניכר, מה שהופך אותה לאתגר לניתוחים מולקולריים נוספים במורד הזרם. בעיות נוספות ברקמות קשות הן, למשל, מחסור בתאים בנגעים טרשת עורקים אנושית ורקמות שומן מסויידות, ביופסיות עור קטנות, וכתוצאה מכך זמינות נמוכה של חומצות הגרעין הרצויות כפי שקורה גם ברקמות ישנות או קבועות.
במעבדות שלנו הקמנו שיטה למיצוי DNA מנגעים טרשת עורקים קבועים בפורמלין, באמצעות מערכת בידוד חצי אוטומטית. השווינו שיטה זו לפרוטוקולי מיצוי אחרים הזמינים מסחרית והתמקדנו בניתוחים נוספים במורד הזרם. טוהר וריכוז ה-DNA נמדדו על ידי ספקטרומטריה ופלואורומטריה. מידת הפיצול והאיכות הכללית הוערכו.
כמות ואיכות ה-DNA הגבוהים ביותר הושגו עם פרוטוקול DNA הדם המותאם למערכת המיצוי האוטומטית, במקום פרוטוקול FFPE המסחרי. עם פרוטוקול שלב אחר שלב זה, תפוקות ה-DNA מדגימות FFPE היו בממוצע גבוהות פי ארבעה ופחות דגימות נכשלו בתהליך המיצוי, שהוא קריטי כאשר מתמודדים עם ביופסיות של כלי דם קטנים. ניתן היה לזהות גדלים של אמפליקונים בין 200 ל-800 bp על ידי PCR. מחקר זה מראה שלמרות שה-DNA המתקבל מרקמת ה-FFPE שלנו מקוטע מאוד, עדיין ניתן להשתמש בו להגברה וריצוף מוצלחים של מוצרים קצרים יותר. לסיכום, בידינו, נראה כי הטכנולוגיה האוטומטית היא המערכת הטובה ביותר למיצוי DNA, במיוחד עבור דגימת רקמת FFPE קטנה.
קיבוע פורמלין ואחריו הטמעת פרפין (FFPE) הוא הליך סטנדרטי לשימור ארוך טווח של דגימה פתולוגית בבנקאות ביולוגית1. דגימות אלו מספקות מקור רב ערך למחקרים היסטולוגיים כמו גם לניתוחים מולקולריים, במיוחד מחקרים גנטיים2. יתרונות נוספים של רקמות FFPE הם אחסון טוב יותר לטווח ארוך, עלויות נמוכות יותר ותנאי אחסון קלים יותר. הכוונה שלנו כאן היא לספק פרוטוקול אמין וקל לשימוש לבידוד חומצות גרעין הניתן לשחזור מכמויות קטנות של קטעי FFPE, מכיוון שמיצוי DNA באיכות גבוהה הוא הצעד המכריע הראשון במגוון רחב של טכניקות מולקולריות ורקמות FFPE הן המקור הזמין ביותר לדגימות.
גישות מדעיות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
האישור לאסוף דגימות טרשת עורקים של צוואר אנושי בבנק הביולוגי שלנו אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית של בית החולים (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Munich, Germany). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים. הניסויים בוצעו בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי.
1. הכנת רקמות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
לצורך קביעת הפרוטוקול נעשה שימוש ב-5 בלוקים של רקמות FFPE מחולים עם טרשת עורקים בעורק הצוואר. ה-DNA בודד עם פרוטוקול חצי אוטומטי אופטימלי (ערכה C) וכן עם שני פרוטוקולים ידניים מבוססי עמודות זמינים מסחרית (ערכה A וערכה B, ראה טבלת חומרים). מיצוי DNA בערכה A ו-B בוצע על פי פרוטוקול היצרן. השינוי היחיד שנעשה בפרוטוקול של שתי הערכות הזמינות מסחרית (ערכה A וערכה B): דה-פרפיניזציה בהתחלה בוצע פעמיים עקב כמויות גבוהות של פרפין סביב החלקים. לאחר דה-פרפיניזציה עם קסילן, ה-DNA נקשר לקרום העמוד ונשטף שלוש פעמים. לא.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
שיטות מיצוי DNA עבור רקמת FFPE משתנות באיכות ובכמות ה-DNA המבודד, מה שמשפיע בהכרח על הביצועים של ניתוחים נוספים בהמשך הזרם. לפיכך, אוטומציה הופכת להיות הכרחית לשיפור זרימת העבודה והסטנדרטיזציה, כמו גם ניהול איכות. לכן, במחקר הנוכחי, הוערכה שיטה חצי אוטומטית למיצוי DNA מדגימות FFPE שהדגימה תוצאות טובות יותר משאר הפרוטוקולים הידניים מבוססי העמודות שנבדקו.
כדי לייעל את השיטה האוטומטית למחצה המתוארת, מטרתנו הייתה שיהיה פרוטוקול כללי אחד לכל סוג של רקמה ונוזל גוף, .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים.
הקמת הפרוטוקול למיצוי DNA אוטומטי נתמכה על ידי ד"ר פול מושלר מחברת פרומגה. אנו מודים לפול מושלר על תמיכתו ותרומתו המדעית. אנו מודים גם לעמיתנו ד"ר מוריץ פון שיידט (מרכז הלב הגרמני במינכן) על שסיפק לנו את מכשיר מקסוול ועל תמיכתו בחלק הניסיוני. כל הניסויים בוצעו במעבדות של מרכז הלב הגרמני (מינכן, גרמניה) ו-Klinikum rechts der Isar (מינכן, גרמניה). המחקר מומן על ידי DFG (PE 900/6-1).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות 1.5 מ"ל לדגירה דגימה | אפנדורף, המבורג, גרמניה | 30120086 | |
| 1-תיוגליצרול | פרומגה, וולדורף, גרמניה | A208 | |
| תוכנת תחנת קלטת Agilent 3.2 | Agilent, Waldbronn, גרמניה | ||
| dsDNA HS Kit | ThermoFisher Scientific, Schwerte, גרמניה | Q32851 | |
| ערכות טיהור DNA FFPE (ערכה A) | Norgene Biotek, היידלברג, גרמניה | 47400 | |
| דגימות רקמה FFPE n=5 | Munich Vascular Biobank, מינכן, גרמניה | ||
| GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B) | Qiagen, Hilden, Germany | 180134 | |
| בלוקים לחימום, מוגדרים ל-80° C ו-65° C | VWR, דרמשטדט, גרמניה | 460-0250 | |
| ריאגנטים D5000 רגישות גבוהה | Agilent, Waldbronn, גרמניה | 5067-5593 | |
| רגישות גבוהה D5000 ScreenTape | Agilent, וולדברון, גרמניה | 5067-5592 | |
| מאגר דגירה | Promega, וולדורף, גרמניה | D920 | |
| Maxwell Blood Kit RSC כולל: מאגר ליזיס, מאגר אלוטיון, פרוטאינאז K | Promega, וולדורף, גרמניה | AS1400 | |
| Maxwell RSC 48 Instrument | Promega, וולדורף, גרמניה | AS8500 | |
| מיקרוצנטריפוגה | Eppendorf, המבורג, גרמניה | ||
| NanoDrop 2000c ספקטרומטר | ThermoFisher Scientific, Schwerte, גרמניה | ND-2000C | |
| כובעים אופטיים | Agilent, Waldbronn, גרמניה | 401425 | |
| רצועות צינור אופטיות | Agilent, Waldbronn, גרמניה | 401428 | |
| פיפטורים וקצות פיפטה | Eppendorf, המבורג, גרמניה | ||
| פריזמה 6 לסטטיסטיקה, גרסה 6.01 | GraphPad Inc., סן דייגו, קליפורניה | ||
| Qubit 3.0 פלואורומטר | ThermoFisher Scientific, שוורטה, גרמניה | Q33216 | |
| TapeStation 4200 | Agilent, Waldbronn, גרמניה | ||
| Tecan Infinite M200 Pro | Tecan, Mä nnedorf, שוויץ | IN-MNANO |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב