מאמר שיטה

מיצוי DNA אופטימלי באיכות גבוהה מנגעים טרשת עורקים אנושיים משובצים בפרפין קבוע בפורמלין

DOI:

10.3791/61452

⸱

12 בפברואר 2021

 ,  , 
1Department for Vascular and Endovascular Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technical University Munich, 2partner site Munich Heart Alliance, Deutsches Zentrum für Herz-Kreislaufforschung (DZHK), 3Department of Vascular Surgery, University Hospital Zurich, 4Department of Experimental Cardiology, German Heart Centre, Technical University Munich

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים פרוטוקול למיצוי DNA אוטומטי למחצה מנגעים משובצים בפרפין קבוע פורמלין בעורקי הצוואר האנושיים. ליזיס הרקמות מתבצע ללא קסילן רעיל, שלאחריו פרוטוקול מיצוי DNA אוטומטי, כולל שלב ליזה שני, קשירת DNA לחלקיקים פרמגנטיים לקשירה מבוססת תאית, שלבי שטיפה ופליטת DNA.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) מייצגות מקור רב ערך לניתוחים מולקולריים ומחקרים גנומיים קליניים. רקמות אלו לרוב דלות בתאים או קשות לעיבוד. לכן, יש לבודד בזהירות חומצות גרעין. בשנים האחרונות נקבעו שיטות שונות לבידוד DNA לרקמות ממחלות רבות, בעיקר סרטן. למרבה הצער, DNA גנומי המופק מרקמות FFPE מתפרק מאוד עקב הקישור הצולב בין גדילי חומצות גרעין וחלבונים, כמו גם שברים אקראיים ברצף. לכן, איכות ה-DNA מדגימות אלה מופחתת באופן ניכר, מה שהופך אותה לאתגר לניתוחים מולקולריים נוספים במורד הזרם. בעיות נוספות ברקמות קשות הן, למשל, מחסור בתאים בנגעים טרשת עורקים אנושית ורקמות שומן מסויידות, ביופסיות עור קטנות, וכתוצאה מכך זמינות נמוכה של חומצות הגרעין הרצויות כפי שקורה גם ברקמות ישנות או קבועות.

במעבדות שלנו הקמנו שיטה למיצוי DNA מנגעים טרשת עורקים קבועים בפורמלין, באמצעות מערכת בידוד חצי אוטומטית. השווינו שיטה זו לפרוטוקולי מיצוי אחרים הזמינים מסחרית והתמקדנו בניתוחים נוספים במורד הזרם. טוהר וריכוז ה-DNA נמדדו על ידי ספקטרומטריה ופלואורומטריה. מידת הפיצול והאיכות הכללית הוערכו.

כמות ואיכות ה-DNA הגבוהים ביותר הושגו עם פרוטוקול DNA הדם המותאם למערכת המיצוי האוטומטית, במקום פרוטוקול FFPE המסחרי. עם פרוטוקול שלב אחר שלב זה, תפוקות ה-DNA מדגימות FFPE היו בממוצע גבוהות פי ארבעה ופחות דגימות נכשלו בתהליך המיצוי, שהוא קריטי כאשר מתמודדים עם ביופסיות של כלי דם קטנים. ניתן היה לזהות גדלים של אמפליקונים בין 200 ל-800 bp על ידי PCR. מחקר זה מראה שלמרות שה-DNA המתקבל מרקמת ה-FFPE שלנו מקוטע מאוד, עדיין ניתן להשתמש בו להגברה וריצוף מוצלחים של מוצרים קצרים יותר. לסיכום, בידינו, נראה כי הטכנולוגיה האוטומטית היא המערכת הטובה ביותר למיצוי DNA, במיוחד עבור דגימת רקמת FFPE קטנה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קיבוע פורמלין ואחריו הטמעת פרפין (FFPE) הוא הליך סטנדרטי לשימור ארוך טווח של דגימה פתולוגית בבנקאות ביולוגית1. דגימות אלו מספקות מקור רב ערך למחקרים היסטולוגיים כמו גם לניתוחים מולקולריים, במיוחד מחקרים גנטיים2. יתרונות נוספים של רקמות FFPE הם אחסון טוב יותר לטווח ארוך, עלויות נמוכות יותר ותנאי אחסון קלים יותר. הכוונה שלנו כאן היא לספק פרוטוקול אמין וקל לשימוש לבידוד חומצות גרעין הניתן לשחזור מכמויות קטנות של קטעי FFPE, מכיוון שמיצוי DNA באיכות גבוהה הוא הצעד המכריע הראשון במגוון רחב של טכניקות מולקולריות ורקמות FFPE הן המקור הזמין ביותר לדגימות.

גישות מדעיות חדשות, כגון ריצוף הדור הבא (NGS) וגישות מחקר "אומיקס", דורשות איכות גבוהה של חומצות גרעין 3,4,5. חילוץ DNA מדגימות רקמת FFPE נותר מאמץ מאתגר. DNA מדגימות FFPE יכול להשתנות מאוד באיכותו ובכמותו בהתאם לגילו ולתנאי הקיבוע שלו. פורמלין, התרכובת הנפוצה ביותר, מובילה לקישור צולב של DNA-חלבון 6,7,8 וגורמת לשבירה אקראית לא ספציפית ברצף הנוקלאוטידים9. זה עשוי להשפיע באופן משמעותי על ניתוחים גנומיים במורד הזרם, מכיוון שקישור צולב יכול להשבית את הגברת תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) 6,10. בשל מזהמים בתהליך הקיבוע, טוהר ה-DNA המבודד מדגימות FFPE מוגבל לרוב. בשנים האחרונות נקבעו שיטות שונות לבידוד DNA, בעיקר מדגימות רקמה סרטנית 2,11,12,13.

באופן כללי, ניתן להבדיל בין פרוטוקולים למיצוי חומצות גרעין מרקמת FFPE לשלוש קבוצות עיקריות. קבוצת השיטות הראשונה והנפוצה ביותר כוללת מערכות עמודים מבוססות סיליקההזמינות מסחרית 14. הקבוצה השנייה כוללת שיטות מיצוי פאזה אורגניות ידניות עם פנול וכלורופורם, שתוארו לראשונה על ידי ג'וזף סמברוק ודיוויד ו. ראסל15. כקבוצה שלישית הוקמו בשנים האחרונות מערכות אוטומטיות כגון מערכות טיפול בנוזלים וכן מערכות מבוססות חלקיקים פרמגנטיות16. לכל אחת משלוש המערכות הנקובות יש יתרונות וחסרונות שונים כגון כימיקלים מסוכנים (כלומר, קסילן, פנול, כלורופורם), עלויות גבוהות17, כוח אדם18 וצריכת זמן19. במיוחד, עבור דגימת הרקמה הקשה כמו גם ניתוחי תפוקה גבוהים, סטנדרטיזציה, שחזור, צריכת זמן נמוכה יחסית, כוח אדם ועלויות הם המאפיינים הרלוונטיים ביותר במציאת שיטה מתאימה לבידוד חומצות גרעין20. שיטות מיצוי אוטומטיות ידועות כמציגות תוצאות טובות יותר הניתנות לשחזור והן רגישות יותר לביופסיות קטנות. יתר על כן, יש צורך בכמות קטנה יותר של רקמות או דם והסיכון לסתימת המערכת עקב כמויות גבוהות של פרפין מצטמצם. למרות שמכונות למיצוי אוטומטי של חומצות גרעין והערכות הדרושות יקרות יותר בהשוואה לשיטות ידניות, הן עדיין משכנעות בגלל תהליכי מיצוי פחות בעייתיים. חיפוש ספרות מספק פרסומים רבים הממחישים השוואה ישירה בין שיטות מיצוי DNA ו-RNA ידניות, מבוססות עמודות ואוטומטיות מרקמות ואורגניזמים שונים, כגון צמחים, בעלי חיים ובני אדם, כמו גם תאים בתרבית 20,21,22. ישנן גם עדויות קיימות בספרות המראות כי DNA ו-RNA שבודדו מרקמה קפואה בת 10 שנים יכולים לשמש לניתוחים במורד הזרם כגון PCR, PCR כמותי, NGS, ניתוחי מתילציה ושיבוט 9,23,24,25,26.

הבעיה העיקרית עם, למשל, רקמת כלי דם אנושית מזדקנת, כמו גם ביופסיות רקמות קטנות, במיוחד בנוגע לדגימות FFPE, היא היעדר תאים בנגעים טרשת עורקים מסויידים מאוד, מה שמוביל כתוצאה מכך לריכוזים נמוכים של חומצות גרעין1. למרות שמספר שיטות למיצוי DNA מרקמת FFPE כבר הוקמו ונמצאות בשימוש נרחב, שיטות הכנת הדגימה הידניות דורשות זמן מעשי ארוך27 וריאגנטים רעילים כגון קסילן או פנול נחוצים לדפרפיניזציה2. כפי שתואר, תהליך הדפרפיניזציה הוא שלב מכריע שלוקח זמן (למשל, בסביבות 30 דקות) המשפיע באופן ניכר על איכות וכמות ה-DNA המופק (למשל, השפעות רעילות על ה-DNA, כגון פיצול ופירוק של תמיסת דפרפיניזציה וטמפרטורות גבוהות)28. פרוטוקולי מיצוי DNA חדשים שפותחו לאחרונה מתמקדים בשימוש בפתרונות אחרים שאינם רעילים, אסטרטגיות תיקון וטכנולוגיות חרוזים אוטומטיות. בפרט, שיטות אוטומטיות ואוטומטיות למחצה הוכחו כמוצלחות במיצוי DNA עם התאוששות יעילה, היעדר זיהום צולב וביצועים קלים29. הקמנו פרוטוקול שמתגבר על המגבלות הללו. כתוצאה מכך, הטכניקה שלנו מאפשרת צמצום של עיבוד וזמן מעשי בסטנדרטים הכמותיים והאיכותיים הגבוהים ביותר.

במיוחד עבור ניתוחים בעלי תפוקה גבוהה הניתנים לשחזור כגון גנוטיפ, מחקרים אפיגנומיים וריצוף RNA, הטיפול בדגימת FFPE עם מערכות טיהור מבוססות עמודות הוא לרוב קשה וגוזל זמן (למשל, שלבי דה-פרפיניזציה ארוכים, סתימת עמודות וזמני עבודה ארוכים). סתימת ממברנות הסיליקה עקב כמות גבוהה של פרפין היא הבעיה העיקרית. נסיבות נוספות שעלולות להחמיר את הבידוד של חומצות גרעין איכותיות הן כמויות קטנות של רקמות כגון מיקרו-ביופסיות של העור, רקמת עכבר קטנה, רקמה שומנית מאוד או מסויידת כמו פלאק, רקמה מאובנת ודגימות מיושנות. במיוחד באבחון וזיהוי פלילי, מערכות אוטומטיות ואוטומטיות למחצה כגון טיפול בנוזלים או שיטות מיצוי מבוססות חלקיקים פרמגנטיים הפכו חיוניות יותר ויותר במהלך השנים האחרונות, בעיקר בשל זמני מעשיים נמוכים יחסית ואפשרות לסטנדרטיזציה. רוב הפרוטוקולים שכבר פורסמו עובדים בצורה מושלמת עבור רקמות חלקות עם כמויות גבוהות או בינוניות של תאים כגון ביופסיות גידול או רקמת צמח 13,22,32. ספרות על שיטות לשיטות מבוססות חלקיקים אוטומטיות למחצה המשמשות לבידוד DNA מרקמות קשות יחסית לטיפול כגון תאים בודדים קבועים, כלי דם מסויידים, רקמה עשירה בקולגן ורקמת שומן עם מספר תאים נמוך מתוארת רק בצורה גרועה33.

במחקר זה, מתוארת שיטה חצי אוטומטית אופטימלית לבידוד DNA מקטעים משובצים בפרפין כלי דם, המשווה אותה לשני פרוטוקולים ידניים מבוססי עמודות. כמות ה-DNA, הטוהר והיקף הפיצול שימשו לאימות. פרוטוקול ה-DNA של הדם הזמין מסחרית, שימש כנקודת התחלה והשלבים הידניים של המערכת האוטומטית למחצה עברו אופטימיזציה לשימוש ב-FFPE כמו גם דגימות רקמה קפואות טריות מרקמות אנושיות ובעלי חיים, בשילוב שלבים מ-FFPE ופרוטוקול הרקמות. השלב האוטומטי של פרוטוקול זה מותקן מראש על המכשיר ותלוי בערכה המשומשת (כאן, ערכת ה-DNA בדם). עם המערכת החצי אוטומטית מבוססת המחסניות המתוארת ניתן לבודד DNA מדם, רקמה קפואה טרייה, רקמה קבועה בפורמלין ואפילו תאים בודדים עם אותו פרוטוקול, מכונה, ערכה וחומרים מתכלים, במקום להשתמש בפרוטוקולים וערכות שונות עבור המכשיר, כפי שמומלץ על ידי החברה. ישנם רק הבדלים קלים בפרוטוקולים, כגון מאגר אחד וכמה זמני דגירה עבור היישומים השונים, מה שהופך את הפרוטוקול הזה לשימושי מאוד לחילוץ DNA מכל מיני רקמות. הפרוטוקול שלנו מותאם בעיקר למסויידים, עניים בתאים ורקמות כלי דם אנושיות סיביות, אך ניתן כמובן להשתמש בו ולבצע אופטימיזציה נוספת לכל מיני רקמות קשות שהוזכרו לעיל.

לסיכום, עבור חוקרים בתחום הלב וכלי הדם העובדים על טרשת עורקים (למשל, אבי העורקים, עורקי הצוואר, עורקים כליליים) אנו מספקים פרוטוקול קל לשימוש, נקודתי-אחר-נקודתי, למיצוי DNA אוטומטי למחצה מדגימות FFPE בכלי הדם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האישור לאסוף דגימות טרשת עורקים של צוואר אנושי בבנק הביולוגי שלנו אושר על ידי ועדת האתיקה המקומית של בית החולים (2799/10, Ethikkommission der Fakultät für Medizin der Technischen Universität München, Munich, Germany). הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים. הניסויים בוצעו בהתאם לעקרונות הצהרת הלסינקי.

1. הכנת רקמות

  1. הכן 5-8 קטעי רקמה של 10 מיקרומטר מדגימת ה-FFPE עם המיקרוטום והעביר אותו בצינור של 1.5 מ"ל. אין צורך להפחית את עודף הפרפין מהבלוק.
    הערה: חלקים בודדים דקים יותר במקום קטע אחד גדול מאיצים את תגובת המאגר. השלך את החלקים הראשונים עקב חשיפה O2 . עבור דוגמאות גדולות יותר, ניתן גם להשתמש בפחות חלקים.
  2. צנטריפוגה את הצינורות הללו בצנטריפוגה עליונה על ספסל, מוגדרת ל-5,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר כדי לאסוף כל דגימה בתחתית הצינור.
    זהירות: צנטריפוגה ארוכה מדי מובילה לקרישת הדגימה ומסבכת את הליזה.

2. פירוק שומנים ודפראפיניזציה

הערה: שלב זה נחוץ לדפרפיניזציה ועיכול שומנים. המאגר המשמש פחות רעיל מתמיסות מסחריות של דה-פרפיניזציה.

  1. הוסף 300 מיקרוליטר ממאגר הדגירה הזמין מסחרית ו-6 מיקרוליטר של 1-תיוגליצרול לכל צינור.
    הערה: אל תשתמש ביותר מ-300 מיקרוליטר מכיוון שזהו הנפח המרבי של מחסנית מערכת האוטומציה.
  2. מערבולת למשך 10 שניות ודגירת הדגימה למשך 10 דקות ב-80 מעלות צלזיוס ו-500 סל"ד בבלוק חימום כדי להמיס פרפין.
    זהירות: יש להמיס את הרקמה לחלוטין בסופו של דבר. במידת הצורך, מערבולת מספר פעמים במהלך הדגירה.

3. עיכול דגימה וחלבון

הערה: עיכול טבעי עם פרוטאז K הוא חיוני לקבלת תמציות DNA נקיות ללא חלבונים. זה גם מפחית את כל החלבונים המזהמים הקיימים. יתר על כן, נוקלאזות נהרסות גם כדי להציל את ה-DNA34. שלב לילה זה נחוץ גם לעיכול דגימה מלא.

  1. הניחו לדגימה להתקרר ל-60 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הוסיפו 30 מיקרוליטר מתמיסת Proteinase K המסופקת.
  2. מערבולת שוב ודוגרים על התערובת ב-65 מעלות צלזיוס ו-500 סל"ד למשך הלילה (4-20 שעות) בבלוק חימום. מערבל את הדגימות במהלך הדגירה מעת לעת לעיכול מלא של הדגימה.
    הערה: דגירה של לילה מובילה לתוצאות טובות יותר. מומלץ לבצע שלבי ערבוב כל 30-60 דקות. בסופו של דבר, לא צריכה להיות חתיכת רקמה חזותית בתוך הצינור.

4. ליזיס תאים

  1. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר הליזיס, המסופק בערכת הדם והמערבולת בקרוב.
  2. דגרו את הדגימה שוב ב-65 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם 500 סל"ד.
  3. תן לדגימה להתקרר לטמפרטורת החדר. הפרפין יתקשה מלמעלה.
    זהירות: אין לערבב שוב, כדי להפריד את הפרפין מהדגימה. אחרת, הפרפין מעורבב עם הרקמה, מה שהורס את הדגימה. הדגימה תיאסף בשלב 6.1.

5. הכנת המחסניות המחולקות מראש

  1. הפעל את המכונה, כמו גם את מחשב הלוח המשויך.
  2. הפעל את אפליקציית התוכנה ולחץ על כפתור הדלת כדי לפתוח את המכשיר.
  3. הסר את המתלה מהמכשיר והכנס את המחסנית המלאה מראש לתוך מתלה הבדיקה. ודא שהמחסנית נלחצת פעמיים כשהיא במקומה והסר את רדיד האיטום.
  4. הוסף את הבוכנה בבאר האחרונה (8) של המחסנית. הוא משמש כקצה פיפטה בכלי.
  5. מלאו את צינורות הפליטה המסופקים של 0.5 מ"ל במאגר פליטה של 65 מיקרוליטר המסופקים עם הערכה. השאר את הצינורות פתוחים והכנס אותם למצב הייעודי בחלק הקדמי של המתלה, אחרי המחסנית.
    הערה: הנפח המינימלי לפליטה הוא 60 מיקרוליטר. המערכת תאבד 5-10 מיקרוליטר מנפח הפליטה הנוסף.

6. מיצוי DNA אוטומטי

  1. נקב בזהירות את הפרפין על גבי צינור ה-1.5 מ"ל משלב 4.3 כדי להגיע לדגימה הנקייה בתחתית הצינור מבלי לערבב אותה שוב עם פרפין.
  2. מעבירים את כל התערובת (730 מיקרוליטר) של הדגימה המוכנה בבאר הראשונה של המחסנית.
  3. הכנס את המתלה למכונת מיצוי ה-DNA האוטומטית. ודא שהמתלה ננעל תחילה בחלק האחורי של המכונה ולאחר מכן בחזית.
  4. התחל את הריצה על ידי לחיצה על כפתור התחל הכתום השמאלי העליון בתוכנה. ייפתח חלון עם פרוטוקולים שונים שהותקנו מראש. בחר פרוטוקול DNA בדם במכשיר. אשר כי הבוכנה, צינור הפליטה והדגימה נוספו על ידי לחיצה על כן בתוכנה. דלת המכשיר תיסגר אוטומטית, והריצה תתחיל (הנורית תהפוך לירוקה). הריצה תימשך כ-38 דקות. אין צורך בכיול נוסף.
    הערה: צפה עד שהמערכת תאסוף את הבוכנות עבור כל הדגימות במתלה. אם זה לא קורה, המערכת נעצרת אוטומטית ויש להפעיל מחדש את פרוטוקול המכונה.
  5. ודא שהמערכת מבצעת את שלב הליזה האוטומטי בבאר הראשונה של המחסנית, ואחריו שלבי כביסה בבארות 3 עד 7. אין צורך בשלב תכנות נוסף. התוכנית המלאה מותקנת מראש על ידי החברה.
  6. לאחר שתסיים, ודא שהמערכת משחררת את ה-DNA בצינורות הפליטה המוכנים דרך הבוכנה הנוספת. החלקיקים המגנטיים נשארים בבוכנה. הבוכנה בסופו של דבר חוזרת לבאר האחרונה של המחסנית.

7. סיימו את הריצה

  1. בסיום הריצה (המכונה מציגה אור ירוק מהבהב), פתח את המכשיר על ידי לחיצה על כפתור הפתיחה (שלט דלת) והסר את המתלה מהמערכת.
  2. השלך את מכלי הדיו.
  3. הכנס מחדש את המתלה הריק למכשיר וסגור את הדלת באמצעות כפתור הדלת בפינה השמאלית העליונה. סגור את אפליקציית התוכנה וכבה את המכשיר, כמו גם את מחשב הטאבלט.
  4. אחסן ב-20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך או ב-4 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח קצר או השתמש בו ישירות לניתוח במורד הזרם או מדידות ריכוז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לצורך קביעת הפרוטוקול נעשה שימוש ב-5 בלוקים של רקמות FFPE מחולים עם טרשת עורקים בעורק הצוואר. ה-DNA בודד עם פרוטוקול חצי אוטומטי אופטימלי (ערכה C) וכן עם שני פרוטוקולים ידניים מבוססי עמודות זמינים מסחרית (ערכה A וערכה B, ראה טבלת חומרים). מיצוי DNA בערכה A ו-B בוצע על פי פרוטוקול היצרן. השינוי היחיד שנעשה בפרוטוקול של שתי הערכות הזמינות מסחרית (ערכה A וערכה B): דה-פרפיניזציה בהתחלה בוצע פעמיים עקב כמויות גבוהות של פרפין סביב החלקים. לאחר דה-פרפיניזציה עם קסילן, ה-DNA נקשר לקרום העמוד ונשטף שלוש פעמים. לא...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות מיצוי DNA עבור רקמת FFPE משתנות באיכות ובכמות ה-DNA המבודד, מה שמשפיע בהכרח על הביצועים של ניתוחים נוספים בהמשך הזרם. לפיכך, אוטומציה הופכת להיות הכרחית לשיפור זרימת העבודה והסטנדרטיזציה, כמו גם ניהול איכות. לכן, במחקר הנוכחי, הוערכה שיטה חצי אוטומטית למיצוי DNA מדגימות FFPE שהדגימה תוצאות טובות יותר משאר הפרוטוקולים הידניים מבוססי העמודות שנבדקו.

כדי לייעל את השיטה האוטומטית למחצה המתוארת, מטרתנו הייתה שיהיה פרוטוקול כללי אחד לכל סוג של רקמה ונוזל גוף, ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגוד אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקמת הפרוטוקול למיצוי DNA אוטומטי נתמכה על ידי ד"ר פול מושלר מחברת פרומגה. אנו מודים לפול מושלר על תמיכתו ותרומתו המדעית. אנו מודים גם לעמיתנו ד"ר מוריץ פון שיידט (מרכז הלב הגרמני במינכן) על שסיפק לנו את מכשיר מקסוול ועל תמיכתו בחלק הניסיוני. כל הניסויים בוצעו במעבדות של מרכז הלב הגרמני (מינכן, גרמניה) ו-Klinikum rechts der Isar (מינכן, גרמניה). המחקר מומן על ידי DFG (PE 900/6-1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות 1.5 מ"ל לדגירה דגימהאפנדורף, המבורג, גרמניה30120086
1-תיוגליצרולפרומגה, וולדורף, גרמניהA208
תוכנת תחנת קלטת Agilent 3.2Agilent, Waldbronn, גרמניה
dsDNA HS KitThermoFisher Scientific, Schwerte, גרמניהQ32851
ערכות טיהור DNA FFPE (ערכה A)Norgene Biotek, היידלברג, גרמניה47400
דגימות רקמה FFPE n=5Munich Vascular Biobank, מינכן, גרמניה
GeneRead DNA FFPE Kit (Kit B)Qiagen, Hilden, Germany180134
בלוקים לחימום, מוגדרים ל-80° C ו-65° CVWR, דרמשטדט, גרמניה460-0250
ריאגנטים D5000 רגישות גבוההAgilent, Waldbronn, גרמניה5067-5593
רגישות גבוהה D5000 ScreenTapeAgilent, וולדברון, גרמניה5067-5592
מאגר דגירהPromega, וולדורף, גרמניהD920
Maxwell Blood Kit RSC כולל: מאגר ליזיס, מאגר אלוטיון, פרוטאינאז KPromega, וולדורף, גרמניהAS1400
Maxwell RSC 48 InstrumentPromega, וולדורף, גרמניהAS8500
מיקרוצנטריפוגהEppendorf, המבורג, גרמניה
NanoDrop 2000c ספקטרומטרThermoFisher Scientific, Schwerte, גרמניהND-2000C
כובעים אופטייםAgilent, Waldbronn, גרמניה401425
רצועות צינור אופטיותAgilent, Waldbronn, גרמניה401428
פיפטורים וקצות פיפטהEppendorf, המבורג, גרמניה
פריזמה 6 לסטטיסטיקה, גרסה 6.01GraphPad Inc., סן דייגו, קליפורניה
Qubit 3.0 פלואורומטרThermoFisher Scientific, שוורטה, גרמניהQ33216
TapeStation 4200Agilent, Waldbronn, גרמניה
Tecan Infinite M200 ProTecan, Mä nnedorf, שוויץIN-MNANO

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pelisek, J., et al. Biobanking: objectives, requirements, and future challenges-experiences from the munich vascular biobank. Journal of Clinical Medicine. 8 (2), 251(2019).
  2. Goelz, S. E., Hamilton, S. R., Vogelstein, B. Purification of DNA from formaldehyde fixed and paraffin embedded human tissue. Biochemical and Biophysical Research Communications. 130 (1), 118-126 (1985).
  3. Busch, A., Eken, S. M., Maegdefessel, L. Prospective and therapeutic screening value of non-coding RNA as biomarkers in cardiovascular disease. Annals of Translational Medicine. 4 (12), (2016).
  4. Kandpal, R. P., Saviola, B., Felton, J. The era of 'omics unlimited. BioTechniques. 46 (5), 351-355 (2009).
  5. McDonough, S. J., et al. Use of FFPE-derived DNA in next generation sequencing: DNA extraction methods. PloS One. 14 (4), (2019).
  6. Gilbert, M. T. P., et al. The isolation of nucleic acids from fixed, paraffin-embedded tissues-which methods are useful when. PloS One. 2 (6), (2007).
  7. Williams, C., et al. A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. The American Journal of Pathology. 155 (5), 1467-1471 (1999).
  8. Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (19), 6470-6474 (1985).
  9. Gillio-Tos, A., et al. Efficient DNA extraction from 25-year-old paraffin-embedded tissues: study of 365 samples. Pathology. 39 (3), 345-348 (2007).
  10. Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
  11. van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Experimental and Molecular Pathology. 94 (1), 121-125 (2013).
  12. Sarnecka, A. K., et al. DNA extraction from FFPE tissue samples–a comparison of three procedures. Contemporary Oncology. 23 (1), 52(2019).
  13. Kalmár, A., et al. Comparison of automated and manual DNA isolation methods for DNA methylation analysis of biopsy, fresh frozen, and formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal cancer samples. Journal of Laboratory Automation. 20 (6), 642-651 (2015).
  14. McCormick, S. F. Multilevel adaptive methods for partial differential equations. (SIAM). , (1989).
  15. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol: chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 4455(2006).
  16. Berensmeier, S. Magnetic particles for the separation and purification of nucleic acids. Applied Microbiology and Biotechnology. 73 (3), 495-504 (2006).
  17. Petrigh, R. S., Fugassa, M. H. DNA extraction and a cost-effective detection method for Echinococcus granulosus protoscoleces. Veterinary Parasitology. 198 (3-4), 410-413 (2013).
  18. Lee, J. H., Park, Y., Choi, J. R., Lee, E. K., Kim, H. S. Comparisons of three automated systems for genomic DNA extraction in a clinical diagnostic laboratory. Yonsei Medical Journal. 51 (1), 104-110 (2010).
  19. Rohland, N., Siedel, H., Hofreiter, M. A rapid column-based ancient DNA extraction method for increased sample throughput. Molecular Ecology Resources. 10 (4), 677-683 (2010).
  20. Gutiérrez-López, R., Martínez-de la Puente, J., Gangoso, L., Soriguer, R. C., Figuerola, J. Comparison of manual and semi-automatic DNA extraction protocols for the barcoding characterization of hematophagous louse flies (Diptera: Hippoboscidae). Journal of Vector Ecology: Journal of the Society for Vector Ecology. 40 (1), 11-15 (2015).
  21. Seiler, C., et al. Nucleic acid extraction from formalin-fixed paraffin-embedded cancer cell line samples: a trade off between quantity and quality. BMC Clinical Pathology. 16 (1), 17(2016).
  22. Harada, S. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples. , Springer. 125-138 (2016).
  23. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PloS One. 12 (6), 0178706(2017).
  24. Fujii, T., et al. Evaluation of DNA and RNA quality from archival formalin-fixed paraffin-embedded tissue for next-generation sequencing-Retrospective study in Japanese single institution. Pathology International. , (2020).
  25. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Archiv: An International Journal of Pathology. 460 (2), 131-140 (2012).
  26. Niland, E. E., McGuire, A., Cox, M. H., Sandusky, G. E. High quality DNA obtained with an automated DNA extraction method with 70+ year old formalin-fixed celloidin-embedded (FFCE) blocks from the indiana medical history museum. American Journal of Translational Research. 4 (2), 198(2012).
  27. Riemann, K., et al. Comparison of manual and automated nucleic acid extraction from whole-blood samples. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 21 (4), 244-248 (2007).
  28. Steinau, M., Patel, S. S., Unger, E. R. Efficient DNA extraction for HPV genotyping in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of Molecular Diagnostics. 13 (4), 377-381 (2011).
  29. Dundas, N., Leos, N. K., Mitui, M., Revell, P., Rogers, B. B. Comparison of automated nucleic acid extraction methods with manual extraction. The Journal of Molecular Diagnostics. 10 (4), 311-316 (2008).
  30. Okello, J. B., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Analytical Biochemistry. 400 (1), 110-117 (2010).
  31. Witt, S., Neumann, J., Zierdt, H., Gébel, G., Röscheisen, C. Establishing a novel automated magnetic bead-based method for the extraction of DNA from a variety of forensic samples. Forensic Science International: Genetics. 6 (5), 539-547 (2012).
  32. Ivanova, N. V., Fazekas, A. J., Hebert, P. D. Semi-automated, membrane-based protocol for DNA isolation from plants. Plant Molecular Biology Reporter. 26 (3), 186(2008).
  33. Sengüven, B., Baris, E., Oygur, T., Berktas, M. Comparison of methods for the extraction of DNA from formalin-fixed, paraffin-embedded archival tissues. International Journal of Medical Sciences. 11 (5), 494(2014).
  34. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Research. 16 (3), 1215(1988).
  35. Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. BioTechniques. 22 (3), 474-481 (1997).
  36. Khokhar, S. K., Mitui, M., Leos, N. K., Rogers, B. B., Park, J. Y. Evaluation of Maxwell 16 for automated DNA extraction from whole blood and formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (CCLM). 50 (2), 267-272 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

FFPEDNADNADNAPCR
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים