הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

גישת זרימה ציטומטרית לאפיון תכונות פגוציטיות של מיקרוגליה בוגרת מבודדת חריפה ומקרופאגים במוח במבחנה

3.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61467

⸱

23 ביוני 2020

 ,  , 
1Department of Neurology, Emory University

במאמר זה

סיכום

הערכת התכונות הפגוציטיות של מיקרוגליה ומקרופאגים במוח יכולה לספק ממד תפקודי רב ערך למחקרי פרופיל מולקולרי. אנו מתארים פרוטוקול מאומת המשתמש בזרימה ציטומטרית כדי לכמת במהירות ובאמינות פגוציטוזיס של מיקרוספירות פלואורסצנטיות וסיבי בטא עמילואיד על ידי מיקרוגליה מבודדת באופן חריף ומקרופאגים במוח ממודלים של עכברים.

תקציר

מיקרוגליה ומקרופאגים חודרים למערכת העצבים המרכזית (CNS), הנקראים ביחד פגוציטים חד-גרעיניים של מערכת העצבים המרכזית (CNS-MPs), ממלאים תפקידים מרכזיים במחלות נוירולוגיות כולל ניוון עצבי ושבץ מוחי. CNS-MPs מעורבים בפינוי פגוציטי של חלבונים פתולוגיים, פסולת וסינפסות עצביות, כל אחד עם מסלולים מולקולריים בסיסיים מובחנים. אפיון תכונות פגוציטיות אלה יכול לספק קריאה פונקציונלית המחמיאה לפרופיל מולקולרי של מיקרוגליה באמצעות גישות ציטומטריית זרימה מסורתיות, טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה. פרופיל פגוציטי של מיקרוגליה הסתמך על הדמיה מיקרוסקופית ותרביות מבחנה של מיקרוגליה יילודים של עכברים. הגישה הראשונה סובלת מדגימה מוגבלת בעוד שהגישה השנייה משקפת באופן גרוע מטבעה את המצב האמיתי in vivo של חברי פרלמנט בוגרים במערכת העצבים המרכזית. מאמר זה מתאר פרוטוקולים אופטימליים לתכונות פגוציטיות פנוטיפיות של CNS-MPs של עכברים מבודדים באופן חריף על ידי ציטומטריית זרימה. CNS-MPs מבודדים באופן חריף ממוח עכבר בוגר באמצעות דיסוציאציה מכנית ואחריה צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, מודגרים עם מיקרוספירות פלואורסצנטיות או סיבי Aβ פלואורסצנטיים, נשטפים ולאחר מכן מסומנים בלוחות של נוגדנים כנגד סמני פני השטח (CD11b, CD45). באמצעות גישה זו, ניתן להשוות תכונות פגוציטיות של מיקרוגליה השוכנת במוח עם מקרופאגים חודרים למערכת העצבים המרכזית ולאחר מכן להעריך את השפעת ההזדקנות ופתולוגיה של מחלות על פנוטיפים פגוציטים אלה. שיטה מהירה זו טומנת בחובה גם פוטנציאל לפנוטיפ מבודד תפקודי של CNS-MPs אנושיים מדגימות מוח לאחר המוות או כירורגיות. בנוסף, ניתן לחקור מנגנונים ספציפיים של פגוציטוזיס על ידי תת-קבוצות CNS-MP על ידי עיכוב מסלולים פגוציטים נבחרים.

מבוא

תאי החיסון המולדים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מורכבים בעיקר ממיקרוגליה ומונוציטים/מקרופאגים חודרים, הנקראים יחד פגוציטים חד-גרעיניים של מערכת העצבים המרכזית (CNS-MPs)1. CNS-MPs מעורבים במחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), הפרעות נוירו-דלקתיות ושבץ מוחי 2,3,4. ל-CNS-MPs, יחד עם אסטרוציטים, פריציטים ותאים אפנדימליים, יש פונקציות פגוציטיות 5,6. במצבם ההומאוסטטי, CNS-MPs מעורבים במעקב מתמיד אחר המיקרו-סביבה המקומית, יחד עם פינוי פגוציטי של פסולת תאים אפופטוטית וחלבונים, וגיזום סינפטי לעיצוב מחדש של קשרים עצביים 7,8,9,10. במצבים ניווניים כמו אלצהיימר, CNS-MPs מאמצים פנוטיפים מולקולריים ותפקודיים מובהקים הקשורים למחלה שיכולים למלא תפקידים פתולוגיים כולל פינוי של עמילואיד-בטא מצטבר (Aβ) ואלמנטים עצביים, כמו גם ציטוקינים דלקתיים ושחרור גורמים, וכתוצאה מכך תפקידי הגנה פרו-דלקתיים, מזיקים כמו גם אנטי דלקתיים 11,12,13,14. פגוציטוזיס של חלקיקי מאקרו, פסולת תאית, חלבונים וחלקיקים זיהומיים אחרים על ידי CNS-MPs מתווכים על ידי קולטנים נפרדים המתבטאים על פני השטח שלהם9. שיבוש במסלולים פגוציטים אלה יכול להוביל לפינוי פגום ולהצטברות מתקדמת של Aβ מה שמוביל בסופו של דבר לנזק עצבי מתקדם ב-AD 4,9. בעוד שהתקדמות בפרופיל מולקולרי של CNS-MPs באמצעות גישות טרנסקריפטומיות ופרוטאומיות סיפקה תובנות יקרות ערך לגבי ההטרוגניות המולקולרית בתוך CNS-MPs במחלות נוירולוגיות15,16, אפיון פונקציונלי של התכונות הפגוציטיות של CNS-MPs ותת-הקבוצות שלהם לוקה בחסר כיום. אפיון פונקציונלי של התכונות הפגוציטיות של CNS-MPs יכול להשלים אסטרטגיות פרופיל מולקולרי, להקל על פנוטיפ תפקודי טוב יותר ולסייע בהערכת היעילות של טיפולים שיכולים לתקן פגוציטוזיס פגום במודלים של מחלות17.

מבחני פגוציטוזיס מסורתיים עבור CNS-MPs כוללים דגירה של מיקרוגליה ראשונית יחד עם מצעים פלואורסצנטיים כגון Aβ או חלקיקי לטקס/פוליסטירן. לאחר מכן נחקרת פגוציטוזיס כפונקציה של ספיגת המצע הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית 18,19,20. זה מבוסס היטב ש-CNS-MPs, כאשר הם נשמרים בתרביות ארוכות, יכולים לשנות באופן דרמטי את המורפולוגיה ואת פרופילי השעתוק שלהם21,22. זה מפריע לחקר התכונות הפגוציטיות של חברי הפרלמנט של מערכת העצבים המרכזית במצבם הייצוגי במערכת העצבים המרכזית. בדיקת ציטומטריית זרימה פונקציונלית לפרופיל CNS-MPs חיים מבודדים באופן חריף יכולה לספק הערכה מהירה של תכונות פגוציטיות ויכולה לדגום מאגר גדול בהרבה של CNS-MPs מאשר מיקרוסקופיה מתקרבת 9,23. יתר על כן, זרימה ציטומטרית מבטלת את הצורך בשמירה על ה-CNS-MPs בתרבית וכן מספקת פלטפורמה לחקר תכונות פגוציטוטיות בתת-אוכלוסיות שונות של CNS-MPs. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים אופטימליים לתכונות פגוציטיות פנוטיפיות של CNS-MPs עכברים מבודדים באופן חריף על ידי ציטומטריית זרימה. התאמת מבחני פגוציטוזיס באמצעות זרימה ציטומטרית מאפשרת ריבוב מהיר של הפנוטיפ הפגוציטי של CNS-MPs יחד עם פנוטיפ חיסוני, ובכך מספקת תובנות לגבי הטרוגניות של תכונות פגוציטיות בתוך CNS-MPs ברזולוציית התא הבודד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל המחקרים בעכברים נערכו לאחר קבלת אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אמורי, ובהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. היערכות ביום הבידוד

  1. הכן דלי קרח כדי לשמור על כל הריאגנטים, המאגרים ומתלי התאים קרים לאורך כל הליך הבידוד.
  2. הנח את הבקבוק של 1× מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) (לפחות 1 ליטר) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעה לפני הזלוף ושמור 1× PBS על קרח במהלך הליך הזלוף והבידוד.
  3. הכן את ריכוז העבודה של מדיום שיפוע הצפיפות (המכונה 35% SIP, ראה טבלת חומרים).
  4. סמן את כל הצינורות החרוטיים והזרימה ששימשו בניסוי לפני בידוד התאים כדי למנוע עיכובים בזמני העיבוד. בנוסף, אסוף את כל האספקה האחרת הדרושה לבידוד לפני הזלוף, כגון מסנני תאים של 40 מיקרומטר, מזרקים ומחטים.

2. בידוד חריף של מיקרוגליה של עכבר בוגר

  1. הרדמה של עכבר בוגר על ידי הנחת העכבר בתא אינדוקציה מזכוכית עם איזופלורן (5 מ"ל) עד שהעכבר מפסיק לנשום ואינו מגיב לצביטה בכף האחורית.
  2. השתמש במחט של 26 גרם ובמזרק של 10 מ"ל כדי לבצע זלוף לב עם 30 מ"ל של 1× PBS קר כקרח עד שאין דם חזותי.
  3. ערפו את ראשו של העכבר במספריים כירורגיים. השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את העור ולחשוף את הגולגולת. הסר את הגולגולת מבלי לפגוע ברקמת המוח כמתואר24. הסר את המוח מיד והעביר למסננת תאים סטרילית של 40 מיקרומטר המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל.
  4. השתמש בחלק האחורי של הבוכנה של מזרק 3 מ"ל כדי לדחוף את המוח דרך המסננת ולנתק מכנית את כל רקמת המוח. שטפו את מסננת התאים והבוכנה לסירוגין במהלך הדיסוציאציה עם 2 מ"ל של 1× PBS קר כקרח בכל פעם כדי להבטיח שכל הרקמה עוברת דרך המסננת.
  5. מגרדים את החלק התחתון של מסננת התאים בעזרת הבוכנה כדי לאסוף כל מתלה שנותר לתוך החרוט. יש לשטוף היטב את מסננת התאים עם 1× PBS קר כקרח ולשפוך את המתלה לתוך הצינור החרוטי של 50 מ"ל.
    הערה: בעת עיבוד מספר בעלי חיים בסדרה, הנח את מתלי התאים על קרח עד לעיבוד נוסף.
  6. הוסף 1× PBS קר כקרח כדי להביא את נפח מתלה התאים ל-30 מ"ל וצנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  7. שפכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה ותלו מחדש את הגלולה ב-6 מ"ל של 35% SIP עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. העבירו את מתלה התא + תערובת SIP 35% לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 25 דקות ב-15 מעלות צלזיוס ללא בלם.
    זהירות: היזהר במיוחד כדי להימנע מהכנסת בועות במהלך ההשעיה מחדש. בועות מוגזמות עלולות להזיק לתפוקת התאים.
  8. הסר בזהירות את הצינור החרוטי בנפח 15 מ"ל מהצנטריפוגה מבלי להפריע לשכבות ושאף את שכבת המיאלין הצפה העליונה.
  9. העבירו את תרחיף התאים + תערובת SIP 35% באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של 1× PBS קר כקרח וצנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שפכו בזהירות את הסופרנטנט, והשאירו מאחור את כדור התא יחד עם 500-800 מיקרוליטר של 1× PBS.
  10. השעו מחדש את כדור התא על ידי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטה p1000 והעבירו לצינור תחתון עגול של 5 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של 1× PBS קר כקרח לצינור התחתון העגול ולצנטריפוגה ב-1,400 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שפכו במהירות את הסופרנטנט, והשאירו את גלולת התא המכילה CNS-MPs בכ-100 מיקרוליטר של 1× PBS (איור 1).

3. הגדרת פגוציטוזיס וצביעה ציטומטרית זרימה

  1. העבירו 20 מיקרוליטר (≈200,000 תאים) של ה-CNS-MPs התלויים מחדש לצינור תחתון עגול טרי של 5 מ"ל והוסיפו 80 מיקרוליטר של 1× PBS קר כקרח. אל תוסיף לצינור זה מצעים פלואורסצנטיים או נוגדנים לזרימה ציטומטרית. תאים אלה משמשים כבקרה שלילית לקביעת פלואורסצנטיות רקע של CNS-MPs לניתוחי זרימה ציטומטרית.
  2. כדי לבסס את הכדאיות של ה-CNS-MPS המבודדים, השתמש בצבעים חיים/מתים מבוססי אמין (למשל, UV כחול ניתן לתיקון).
    1. השעו מחדש את שאר גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של 1× PBS והוסיפו 1 מיקרוליטר של הצבע המחודש לכל צינור דגימה למעט הבקרה השלילית.
    2. מערבולת בעדינות, מכסים את הצינורות בנייר כסף ודוגרים אותם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של 1× PBS לכל צינור ומערבולת בעדינות.
    3. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 1,400 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שפכו במהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של 1× PBS.
      הערה: צבעים מבוססי אמין ייקשרו לסיבי Aβ החוץ-תאיים ויבלבלו את תוצאות הפגוציטוזיס. אינדיקטורים חיים/מתים אחרים עשויים להפריע לפלואורסצנטיות של סיבי Aβ/מיקרוספרות. לפיכך מומלץ להשתמש במחוון חי/מת רק בניסויים ראשוניים כדי לקבוע את הכדאיות של CNS-MPS המבודדים.
  3. מערבל היטב את הצינור המכיל מיקרוספירות PE-פוליסטירן והוסף 2 מיקרוליטר (≈200 מיקרוספירות לתא) ל-100 מיקרוליטר של תרחיף תאים בצינורות זרימה למעט הבקרה השלילית. מערבל בעדינות כל צינור כדי להבטיח פיזור שווה של המצע עם התאים והנח את הצינורות התחתונים העגולים בחממה סטרילית לחה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
    1. מערבל בעדינות ודגר את צינור הבקרה השלילי כדי להבטיח תנאי ניסוי דומים בין דגימות חיוביות ושליליות.
      הערה: אם משתמשים בסיבי Aβ במקום במיקרוספירות PE, הכינו סיבי HiLyte488 Aβ פלואורסצנטיים כמתואר קודם לכן9. הריכוז הסופי של סיבי Aβ הוא 200 מיקרומטר אשר מדולל לאחר מכן להכנת מלאי טרי של 20 מיקרומטר ב-PBS של מונומרים Aβ פלואורסצנטיים. הוסף 12.5 מיקרוליטר ממונומרי Aβ של 20 מיקרומטר לכל צינור המכיל תאים מבודדים.
  4. הסר את התאים מהחממה והוסף 1 מ"ל של 1× PBS לכל צינור ומערבולת בעדינות. צנטריפוגה של התאים ב-1,400 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ושפכו במהירות את הסופרנטנט. חזור על הכביסה עם 1 מ"ל 1× PBS, צנטריפוגה ב-1,400 × גרם למשך 2 דקות, שפך את הסופרנטנט והשהה מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של 1× PBS.
    הערה: לאחר כל סיבוב, חשוב לשמור על התאים על הקרח כדי לעכב ספיגה פגוציטית מתמשכת.
  5. מערבל את נוגדני הזרימה-ציטומטריה וצנטריפוגה אותם במיקרו-צנטריפוגה למשך 10 שניות. לכל צינור תרחיף תאים הוסף 1 מיקרוליטר כל אחד מ-CD11b-APC/Cy7 ו-CD45-PE/Cy7 לבדיקת פגוציטוזיס Aβ, או CD45-FITC לפגוציטוזיס PE-microsphere. מערבלים בעדינות כל צינור ודוגרים בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: משתמשים יכולים גם לכלול צינור נפרד המכיל תאים פגוציטים חזקים כגון BV2 microglia מתורבת או מקרופאגים צפקיים כבקרה חיובית ולטפל בהם במיקרוספירות PE, ונוגדנים ציטומטריים זורמים כמתואר לעיל. ניתן להשתמש בנתונים ממדגם זה כדי להגדיר את הבקרה החיובית המציינת פגוציטוזיס אמיתית בניסויים ראשוניים.
  6. בזמן שהתאים נמצאים בדגירה, הגדר צינורות פיצוי באמצעות ארבעה צינורות זרימה תחתונים עגולים של 5 מ"ל. מערבל היטב את חרוזי הפיצוי והוסף טיפה אחת לכל צינור. הוסף 1 מיקרוליטר של CD11b-APC/Cy7 לצינור הראשון ו-CD45-FITC לשנייה לצינור. הוסף 1 מיקרוליטר של פוליסטירן PE לצינור השלישי ושמור חרוזי פיצוי לא מוכתמים בצינור הרביעי. השתמש בצינור הרביעי הזה כבקרה שלילית כדי להגדיר לוח פיצוי על ציטומטר הזרימה.
    הערה: כאשר משתמשים בסיבי Aβ לחקר פגוציטוזיס, הוסף CD45-PECy7 לצינור השני במקום CD45-FITC. הוסף 1 מיקרוליטר של נוגדן ציטומטריית זרימה מתויג FITC נפרד או נוגדן משני FITC (כל מין) לצינור הפיצוי השלישי. זה חשוב מכיוון שהחרוזים אינם יכולים להיקשר לסיבי Aβ והם יישטפו עם שטיפת צינורות הפיצוי.
  7. אפשר לחרוזי הפיצוי לדגור עם הנוגדנים שלהם למשך 10 דקות לפחות. לאחר הדגירה, הוסיפו 1 מ"ל של 1× PBS לכל צינור, צנטריפוגה ב-1,400 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ושפכו במהירות את הסופרנטנט. הניחו את צינורות הפיצוי על קרח וכסו אותם בנייר כסף עד לזרימה ציטומטרית.
  8. לאחר הדגירה עם נוגדנים לזרימה-ציטומטריה, יש לשטוף את התאים המוכתמים ב-1 מ"ל של 1× PBS. מערבולת וצנטריפוגה בעדינות של התאים בטמפרטורה של 1,400 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שפכו במהירות את הסופרנטנט וחזרו על הכביסה עם 1 מ"ל 1× PBS. לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-100 מיקרוליטר של 1× PBS.
  9. מניחים את צינורות הדגימה על קרח ומכסים אותם בנייר אלומיניום עד לזרימה ציטומטרית.
    הערה: השתמש ב-1× PBS (pH 7.0) ללא Ca2+/Mg2+ כמאגר זרימה לאורך כל הניסוי. הקפד לא לכלול סרום בקר עוברי (FBS) במאגר הזרימה כדי למנוע הפעלה אפשרית של מיקרוגליה.

4. ציטומטריית זרימה ואנליזה

  1. הגדרת מכשירים ופיצוי
    הערה: הניסויים בכתב יד זה בוצעו על ציטומטר זרימה עם לייזרים אולטרה סגולים, סגולים, כחולים, צהובים-ירוקים ואדומים. ניתן להתאים ניסוי זה גם לציטומטר זרימה תלת-לייזרי עם לייזרים כחולים, צהובים-ירוקים ואדומים בלבד. המשתמשים צריכים לעבור הכשרה רשמית לפני הטיפול במכשיר.
    1. מלא מחדש את מיכל חיץ נדן הזרימה והפעל את הציטומטר. "פריים" את הציטומטר עם צינור זרימה תחתון עגול של 5 מ"ל המכיל ddH2O. היכנס לתוכנת הניתוח במחשב המחובר לציטומטר הזרימה. צור "ניסוי" ובחר FSC, SSC, FITC, PECy7 ו-APC-Cy7 כפרמטרים. אם אתה משתמש במיקרוספירות PE, בחר PE במקום PECy7 בלוח הפרמטרים.
    2. צור לוח תגמול מתאים.
      הערה: בניסויים שלנו, בדרך כלל מתחי FSC/SSC עבור חרוזי פיצוי הם בסביבות 350/280, בעוד שמתחי FSC/SSC עבור CNS-MPs הם בסביבות 320/260. ערכים אלה יכולים להשתנות בין כל שני ציטומטרים שונים ויש לכייל אותם לפני הניסוי בפועל.
    3. הרכיבו מחדש כל צינור פיצוי ותרחיף תאים עם 500 מיקרוליטר של 1× PBS, מערבולת קצרה והניחו על קרח. הפעל את צינור החרוז השלילי/לא מוכתם כדי להגדיר מתחים מתאימים כך שהשיא בכל היסטוגרמה של פלואורופור יהיה מתחת ל-102. הפעל את צינורות הפיצוי האחרים בצבע יחיד כדי לזהות את הפסגות החיוביות המובהקות שלהם.
      הערה: צריך להיות לפחות חצי לוג הבדל (בסיס 10) בין הפסגות החיוביות והשליליות של כל פלואורופור.
    4. רשום 5000 אירועים מכל שפופרת פיצוי כדי לאפשר למחשב לחשב אוטומטית את הגדרת הפיצוי. קשר את מערך הפיצוי לניסוי הנוכחי25.
    5. צור "צינור" חדש תחת הכרטיסייה לדוגמה. מערבל בעדינות והפעל את צינור הבקרה השלילי המכיל CNS-MPs לא מוכתמים. כוונן את מתח הפיזור קדימה והצד כדי ללכוד את אוכלוסיית העניין. הקלט את האירועים ושער המשנה בשידור חי של חברי הפרלמנט של CNS כמפורט להלן.
    6. לכוד ורשום אירועים מכל הצינורות הבאים כקבצים נפרדים תוך שמירה על עקביות הפרמטרים והמתחים. מערבל בעדינות כל צינור לפני הפעלתם על ציטומטר הזרימה.
  2. אסטרטגיית שער ומדידת פגוציטוזיס
    1. צייר שער חד-גרעיני ראשוני כדי ללכוד את כל חברי הפרלמנט של מערכת העצבים המרכזית. תאים חד-גרעיניים חיים אלה חייבים להיות מגודרים בגרף הבא כדי לכלול רק תאים בודדים, למעט צמדים ושלישיות.
    2. הקרן את אוכלוסיית ה-CNS-MPs הבודדת והחיה על גרף עוקב המציג פלואורופורים CD11b ו-CD45.
      הערה: מיקרוגליה השוכנת במוח היא בדרך כלל CD11b+CD45בינונית, בעוד שמקרופאגים חודרים הם CD11b+CD45גבוהים. סמנים נוספים כגון Ly6c עשויים להיכלל בפאנל כדי להפריד בביטחון נוסף מונוציטים דלקתיים (Ly6cגבוה ו-CD45גבוה) ממיקרוגליה (Ly6cנמוך CD45ביניים).
    3. החל שערים מתאימים להמשך מחקר פגוציטוזיס באוכלוסיות המתאימות כפי שמוצג באיור 2F.
      הערה: פגוציטוזיס ב-CNS-MPs נמדד כפונקציה של ספיגת הקרינה Hilyte488/Alexa488 (Aβ) או PE (מיקרוספרה). שיא חיובי מובהק בהיסטוגרמות שלהם מצביע על כך ש-CNS-MPs ביצעו פגוציטוזציה של המצע. כמות החומר פגוציטוז עומדת ביחס ישר לעוצמת הקרינה. לפיכך, יש לפרש נוכחות של פסגות מרובות כפגוציטוזיס גבוה יותר. ניתן לאשש אותם לאחר מכן על ידי אימונוהיסטוכימיה.
    4. לאחר הקלטת כל צינורות הדגימה על ציטומטר הזרימה, ייצא את קבצי הנתונים בפורמט .fcs להמשך ניתוח.
  3. ניתוח נתונים סטטיסטיים
    1. השתמש בכל תוכנה לניתוח זרימה-ציטומטריה יחד עם גיליונות אלקטרוניים ותוכנת ניתוח סטטיסטי עבור כל ניתוחי הנתונים.
    2. הוסף את קבצי ה-.fcs לתוכנת הניתוח ולחץ פעמיים על הקובץ הראשון. גרף המציג את כל ההקלטות
      יופיעו. עקוב אחר אסטרטגיית שער דומה כפי שמוצג באיור 2 כדי לשער לאחר מכן תאים חד-גרעיניים בודדים חיים ולחקור פגוציטוזיס על אוכלוסייה ספציפית, למשל תאי מיקרוגליהביניים CD11b+CD45 (איור 2H).
      הערה: האינדקס הפגוציטי מוערך על סמך שיעור התאים המפנימים סיבי Aβ פלואורסצנטיים או מיקרוספרה ≥1. כפי שהוגדר קודם לכן, פגוציטוזיס ברמה נמוכה היא ספיגה של מיקרוספירה אחת לפחות ופגוציטוזיס ברמה גבוהה היא ספיגת חרוזים >1 8,9. בהתבסס על ניסויים קודמים, עיכוב תהליכים תלויי אקטין על ידי ציטוכלזין D מעכב לחלוטין את ספיגת החרוז >1 ומעכב חלקית ספיגת חרוז אחת9 וכן מעכב לחלוטין את ספיגת Aβ, ומאשר ספיגה פגוציטית תלויה באקטין במקום קשירה פסיבית לפני השטח של התא. אימונוציטוכימיה גם מאשרת שכל שיא עוקב בבדיקת המיקרוספירה מייצג עלייה יחידה במספר החרוזים שעברו פגוציטוז 8,9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי להדגים תוצאות אופייניות של קליטה פגוציטית של מיקרוספירות וסיבי Aβ42 על ידי CNS-MPs מבודדים באופן חריף, CNS-MPs מבודדים באופן חריף התקבלו מחצי הכדור המקביל לאחר חסימת עורקי מוח אמצעיים חולפת (MCAO)8. לפרטים לגבי תכונות פגוציטיות של CNS-MPS במודל MCAO, עיין בפרסומים קודמים8. בקצרה, לאחר התאוששות של 72 שעות, CNS-MPs בודדו באופן חד ממוח טרי באמצעות דיסוציאציה מכנית ואחריה צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, ודגירה עם מיקרוספירות פלואורסצנטיות או סיבי Aβ (איור 1<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זרימה-ציטומטריה היא טכניקה שיכולה לזהות ביטוי של חלבונים או סמנים מעניינים על פני התא או בתאים תוך-תאיים באמצעות בדיקות המסומנות פלואורסצנטיות (בדרך כלל נוגדנים) כדי לסמן את הסמנים המעניינים הללו. נוגדנים על פני התא או תוך-תאיים מצומדים בדרך כלל עם פלואורוכרומים הניתנים לריגוש לייזר בעלי ספקטרום פליטה ייחודי. ניתן לסווג תאים שהודגרו עם נוגדנים אלה למספר תת-אוכלוסיות על סמך דפוסי הביטוי של סמנים אלה. CNS-MPs מכילים בעיקר מיקרוגליה ומונוציטים/מקרופאגים חודרים למערכת העצבים המרכזית. למיקרוג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחקר נתמך על ידי פרסי NIH לד"ר רנגרג'ו (NINDS K08 NS099474-1 ו-R01 NS114130-01A1) ולד"ר ראיאפרולו (NIA F32AG064862). מחקר זה נתמך בחלקו על ידי Emory Flow Cytometry Core (EFCC), אחד ממתקני הליבה המשולבים של אמורי (EICF) והוא מסובסד על ידי בית הספר לרפואה של אוניברסיטת אמורי. תמיכה נוספת ניתנה על ידי ברית המדע הקליני והתרגומי של ג'ורג'יה של ה-NIH (UL1TR002378). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו משקף בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIH.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
10x תמיסת המלח המאוזנת של האנק (10x HBSS)ThermoFisher14065056 לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס משמש לייצור SIP כמתואר בפרוטוקול
1x תמיסת המלח המאוזנת של האנק (1x HBSS)ThermoFisher14175095לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס משמש לייצור 35% SIP כמתואר בפרוטוקול
1x מי מלח חוצץ פוספט (PBS)https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html לאחסן 10xPBS בטמפרטורת החדר. הכן 1xPBS טרי על ידי דילול חלק אחד 10xPBS לתשעה חלקים של MilliQ dH20 ואחסן אותו ב-4 מעלות; C למשך שעה לפני השימוש. ודא שה-pH של ה-1xPBS הוא 7.0 לפני הקירור.
35% SIPכדי לייצר 20 מ"ל של 35% SIP, השתמש ב-7 מ"ל SIP ו-13 מ"ל קר כקרח 1& פעמים; HBSS. שמור על קרח עד לעיבוד נוסף
APC-Cy7 חולדה אנטי-CD11bBD Pharmingen557657חנות ב-4 מעלות; C או לשמור על קרח בעת השימוש. שילד מאור. דילול ציטומטריית זרימה - 1:100
FITC חולדה אנטי עכבר CD145BD Pharmingen553080חנות ב-4 מעלות; C או לשמור על קרח בעת השימוש. שילד מאור. דילול ציטומטריית זרימה - 1:100
LIVE/DEAD ערכת כתמי תאים מתים כחולים הניתנים לתיקוןThermoFisherL34961חנות בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. הוסף 50ul של DMSO לצינור אחד של הצבע, מערבולת וצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת. L aliquots ואחסן אותם ב-20 מעלות צלזיוס. השתמש במנה טרייה לכל ניסוי והוסף לדגימות בדילול של 1:500.
חרוזי פיצוי של OneComp eBeadsThermoFisher01-1111-42חנות ב-4 מעלות; C, מערבל את הצינור בחוזקה לפני הוספתו לצינור הדגימה, שמור על קרח בעת השימוש.
PE-Cy7 חולדה אנטי עכבר CD145BD Pharmingen552848חנות ב 4 & deg; C או לשמור על קרח בעת השימוש. שילד מאור. דילול ציטומטריית זרימה - 1:100
Percoll pH8.5-9.5SigmaP1644חנות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. כדי לייצר 10 מ"ל של פרקול איזוטוני סטנדרטי (SIP): השתמש ב-9 מ"ל של פרקול קר ו-1 מ"ל של פרקול קר 10&פעמים; HBSS.
מיקרוספירות מצומדות פיקואריתריןThermoFisherF13083חנות ב-4 מעלות; C או לשמור על קרח בעת השימוש.
β-עמילואיד (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - מסומן, HumanAnaSpecAS-60479-01הריכוז הסופי של סיבי Ab הוא 200µ M אשר לאחר מכן מדולל לפני השימוש. אחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס הכן פתרון עבודה טרי לכל ניסוי.

מקורות

  1. Jordan, F. L., Thomas, W. E. Brain macrophages: questions of origin and interrelationship. Brain Research. 472 (2), 165-178 (1988).
  2. Heneka, M. T., et al. Neuroinflammation in Alzheimer's disease. Lancet Neurology. 14 (4), 388-405 (2015).
  3. Jin, R., Yang, G., Li, G. Inflammatory mechanisms in ischemic stroke: role of inflammatory cells. Journal of Leukocyte Biology. 87 (5), 779-789 (2010).
  4. Hickman, S., Izzy, S., Sen, P., Morsett, L., El Khoury, J. Microglia in neurodegeneration. Nature Neuroscience. 21 (10), 1359-1369 (2018).
  5. Bellesi, M., et al. Sleep Loss Promotes Astrocytic Phagocytosis and Microglial Activation in Mouse Cerebral Cortex. Journal of Neuroscience. 37 (21), 5263-5273 (2017).
  6. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 6(2013).
  7. Janda, E., Boi, L., Carta, A. R. Microglial Phagocytosis and Its Regulation: A Therapeutic Target in Parkinson's Disease. Frontiers in molecular neuroscience. 11, 144(2018).
  8. Gao, T., et al. Temporal profiling of Kv1. 3 channel expression in brain mononuclear phagocytes following ischemic stroke. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 116(2019).
  9. Rangaraju, S., et al. Differential Phagocytic Properties of CD45(low) Microglia and CD45(high) Brain Mononuclear Phagocytes-Activation and Age-Related Effects. Frontiers in Immunology. 9, 405(2018).
  10. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  11. Dubbelaar, M. L., Kracht, L., Eggen, B. J. L., Boddeke, E. The Kaleidoscope of Microglial Phenotypes. Frontiers in Immunology. 9, 1753(2018).
  12. Ransohoff, R. M., El Khoury, J. Microglia in Health and Disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8 (1), 020560(2015).
  13. Venegas, C., et al. Microglia-derived ASC specks cross-seed amyloid-beta in Alzheimer's disease. Nature. 552 (7685), 355-361 (2017).
  14. Sarlus, H., Heneka, M. T. Microglia in Alzheimer's disease. Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3240-3249 (2017).
  15. Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer's Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
  16. Keren-Shaul, H., et al. A Unique Microglia Type Associated with Restricting Development of Alzheimer's Disease. Cell. 169 (7), 1276-1290 (2017).
  17. Rangaraju, S., et al. Identification and therapeutic modulation of a pro-inflammatory subset of disease-associated-microglia in Alzheimer's disease. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 24(2018).
  18. Mutzke, E., Chomyshyn, E., Nguyen, K. C., Blahoianu, M., Tayabali, A. F. Phagocytosis-coupled flow cytometry for detection and size discrimination of anionic polystyrene particles. Analytical Biochemistry. 483, 40-46 (2015).
  19. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. Journal of Neuroscience. 25 (36), 8240-8249 (2005).
  20. Pul, R., Chittappen, K. P., Stangel, M. Quantification of microglial phagocytosis by a flow cytometer-based assay. Methods in Molecular Biology. 1041, 121-127 (2013).
  21. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), (2017).
  22. Haimon, Z., et al. Re-evaluating microglia expression profiles using RiboTag and cell isolation strategies. Nature Immunology. 19 (6), 636-644 (2018).
  23. Grasse, M., Rosenkrands, I., Olsen, A., Follmann, F., Dietrich, J. A flow cytometry-based assay to determine the phagocytic activity of both clinical and nonclinical antibody samples against Chlamydia trachomatis. Cytometry A. 93 (5), 525-532 (2018).
  24. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. Li, K. 57, (2011).
  25. Szalóki, G., Goda, K. Compensation in multicolor flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 982-985 (2015).
  26. Chen, M. J., et al. Microglial ERK activation is a critical regulator of pro-inflammatory immune responses in Alzheimer's disease. J bioRxiv. , 798215(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

CD11b CD45
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.