זיהוי בעין בלתי של מוטציות נקודתיות נדירות ב-DNA

סיכום

פרוטוקול זה מאפשר זיהוי בעין בלתי של DNA שעבר מוטציה נקודתית בעודף של פי 200 של מולקולות DNA מסוג בר, על ידי ניצול ננו-חלקיקי זהב ומיקרו-חלקיקים פרמגנטיים.

תקציר

הפרוטוקול מתאר בדיקה קולורימטרית בעין בלתי לאיתור מוטציות נקודתיות סומטיות בעודף DNA מסוג פראי. היישום העתידי הצפוי של השיטה הוא זיהוי מוטציות נדירות ב-DNA נטול תאים במחזור מביופסיות נוזליות, עם רלוונטיות באבחון סרטן וריבוד של חולים אונקולוגיים לטיפול מותאם אישית. כהוכחת רעיון, הבדיקה תוכננה לזהות את המוטציה BRAF^V600E בגן BRAF, החשובה לזיהוי תת-הקבוצה של חולי מלנומה שיכולים להפיק תועלת מטיפולים ממוקדים עם מעכבי BRAF. עם זאת, ניתן להכליל בקלות בדיקה קולורימטרית זו למוטציות סומטיות אחרות בעלות רלוונטיות קלינית עקב השימוש בבדיקות זיהוי אוניברסליות, ובכך לספק פוטנציאל חזק באבחון אונקולוגי.

הבדיקה מגלה 0.5% מ-BRAF^V600E בעודף של BRAF^WT DNA, התואם את הרגישות של כמה בדיקות אינסטרומנטליות מסחריות. רגישות כזו רלוונטית מבחינה קלינית למטרות אבחון, ומאפשרת זיהוי מוקדם של חולים רגישים לתרופות. בניגוד לבדיקות מסחריות המבוססות על PCR בזמן אמת, בדיקה זו דורשת מכשור ועיבוד מינימליים, שכן ניתן לבצע אותה על DNA מוגבר עם PCR סטנדרטי (או טכניקות איזותרמיות) ומספקת קריאה בעין בלתי עם תגובה של צינור אחד של כמה צעדים תוך שעה אחת בלבד. נכון לעכשיו, הבדיקה משמשת רק על דגימות DNA סינתטיות. עם זאת, האחרונים תוכננו לחקות דגימה אמיתית המוגברת מ-DNA נטול תאים במחזור הדם, כדי להעדיף את תרגום הבדיקה לאבחון קליני.

מבוא

מטרת השיטה היא לזהות מוטציות נקודתיות לא מיוצגות בדגימת DNA עם מתודולוגיה מינימלית וקריאה בעין בלתי. המטרה הסופית היא לבצע מבחן הוכחת עקרונות, המתאים ליישומים עתידיים בבדיקות מהירות לאיתור מוטציות סומטיות ב-DNA נטול תאים במחזור (ccf-DNA) (למשל, מדגימות ביופסיית דם) לאבחון מוקדם וניטור סרטן¹. מוטציות סומטיות הקשורות לסרטן מייצגות סמן ביולוגי חשוב לסרטן² ונמצאות בחלק מינורי (אך משתנה מאוד)³ של ccf-DNA, מה שהופך את זיהוין למאתגר⁴. בחרנו, כמטרה למודל, את המוטציה האונקוגנית BRAF^V600E הגורמת להפעלה מכוננת של BRAF קינאז. מוטציה זו קיימת ב-80% מכלל סוגי הסרטן שעברו מוטציה ב-BRAF⁵ ומיוצגת בדרך כלל רק ב-<1% מה-DNA של הגידול^{במחזור 6}. זיהוי חולים הנושאים מוטציה זו חשוב מכיוון שהוא מנבא את התגובה הטיפולית למעכבי BRAF. לכן, פותחו מספר שיטות 7,8,9,10 להערכת מצב המוטציה של BRAF, עם רגישויות שנעות בין 0.01% ל-2%.

היתרון העיקרי של שיטה זו על פני השיטות המתקדמות הוא שהזיהוי שלה הוא ללא מכשירים (עין בלתי), בניגוד לזיהוי אינסטרומנטלי של מולקולות פלואורסצנטיות על ידי PCR בזמן אמת. יתרון נוסף הוא יעילותו בהבחנה בין מולקולת DNA אחת שעברה מוטציה בעודף של 200 מולקולות DNA מסוג בר. מקדם אפליה זה של 0.5% עדיף¹¹ או תואם¹² לזה של כמה ערכות מבוססות מעבדה או זמינות מסחרית, המבוססות על זיהוי אינסטרומנטלי ולכן הוא רלוונטי ליישומי אבחון קליני. מצד שני, כבדיקת אב טיפוס מעבדה, השיטה מסתמכת על בקרה ידנית של שלבים רגישים לטמפרטורה. עם זאת, מספר השלבים ומשך הזמן הכולל של הבדיקה מוגבלים, מה שהופך את יישומה העתידי במערכות מיקרופלואידיות אוטומטיות לאפשרי.

שיטת הוכחת היתכנות זו פותחה באמצעות מולקולות DNA סינתטיות. לצורך התרגום היעיל שלו למרפאות, יש לאמת אותו באמצעות דגימות מהעולם האמיתי המוגברות מביופסיות הדם של המטופלים. נציין כי תחום היישום העתידי של השיטה אינו מיועד להיות ניתוח ישיר של מטריצות ביולוגיות מורכבות לא מעובדות, כגון נוזלי גוף. מהאחרון, יש לחלץ DNA במתודולוגיות סטנדרטיות, ולאחר מכן להגביר ולטהר אותו. כתוצאה מכך, חומר המוצא לניתוח יהיה תמיד DNA מטוהר ומוגבר, הניתן להשוואה סבירה, מבחינת חומרים מפריעים אפשריים, לדגימת DNA סינתטית, כמו זו המשמשת לפיתוח שיטה זו.

פרוטוקול

1. סינתזה של בדיקות ננו-חלקיקי זהב

1. לסנתז ננו-חלקיקי זהב מצופים במכסה ציטראט 40 ננומטר, בשיטת גידול זריעה סטנדרטית דו-שלבית כמפורט להלן.
   1. לסנתז ננו-חלקיקי זהב מצופים ציטראט 15 ננומטר (זרעי AuNPs) בשיטת טורקביץ'-פרנס^{הקלאסית 13,14}.
      1. שטפו את כל כלי הזכוכית עם אקווה רג'יה (HCl:HNO₃ ביחס של 3:1 v/v).
      2. מחממים 250 מ"ל של 0.25 מ"מ HAuCl₄ לרתיחה תוך כדי ערבוב אחיד.
         אזהרה: HAuCl₄ הוא קורוזיבי ורעיל.
      3. הוסף מיד 25 מ"ל של 38.8 מ"מ Na₃∙ציטראט.
      4. המשיכו להרתיח ולערבב במשך 30 דקות, בעוד התמיסה הופכת לצבע אודם אדום.
      5. מסירים את התמיסה מהאש ומניחים להתקרר לטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב.
      6. סנן באמצעות מסנני מזרק ממברנה PTFE של 0.22 מיקרומטר.
      7. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בבקבוק זכוכית.
         הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן.
   2. לסנתז 40 ננומטר ציטראט ננו-חלקיקי זהב מכוסים (40 ננומטר AuNPs) על ידי גידול זריעה¹⁵.
      1. הכן תמיסה A: 390 מיקרוליטר של 0.1 M הידרוקסילאמין סולפט טרי עם 13 מ"ל זרעי AuNP בנפח כולל של 120 מ"ל ב- H₂O.
         הערה: כמות זרעי ה-AuNPs הדרושים להשגת הגודל הרצוי יכולה להשתנות; יש לטטר אותו עבור כל מלאי זרעים חדש של AuNPs.
         זהירות: הידרוקסילאמין סולפט הוא מאכל, רעיל, מוטגני ומסוכן לסביבה. לטיפול: יש לשטוף היטב לאחר הטיפול. הסר בגדים מזוהמים ושטוף לפני שימוש חוזר. השתמש עם אוורור נאות. צמצם את ייצור והצטברות האבק. יש להימנע ממגע עם העיניים, העור והבגדים. יש לשמור על המיכל סגור היטב. הימנע מנשימת אבק. אין להשתמש עם מרית מתכת או פריטי מתכת אחרים. לאחסון: יש לאחסן בכלי סגור היטב. יש לאחסן באזור קריר, יבש ומאוורר היטב הרחק מחומרים לא תואמים. הרחק ממתכות.
      2. הכן פתרון ב': 12.25 מ"ל של H₂O + 0.25 מ"ל של 0.1 מ' HAuCl₄.
      3. טען תמיסה B במזרק וטען את המזרק במשאבת מזרק.
      4. הגדר את פרמטרי משאבת המזרק: קוטר המזרק במ"מ; קצב זרימה: 90 מ"ל לשעה; נפח כולל: 10.80 מ"ל (מתוכם, 0.8 מ"ל הם העודף הדרוש לאיזון המערכת, כלומר מילוי צינורות).
      5. הפעל את משאבת המזרק. לאחר ש-0.8 מ"ל הראשונים של תמיסה B מילאו את הצינור ונשרו למיכל פסולת, מקם את הצינור על גבי בקבוק התגובה המכיל תמיסה A (נשמר תחת ערבוב מתון ואחיד) ותן לתמיסה B להיכנס טיפה.
      6. מכסים על ידי הוספת 2.65 מ"ל של 0.1 M Na₃∙citrate טרי, ומערבבים במשך 5 דקות.
      7. רכז את ה-AuNPs של 40 ננומטר שהתקבלו על ידי צנטריפוגה ב-2,460 x גרם למשך 18 דקות ב-10 מעלות צלזיוס.
      8. הסר את הסופרנטנט על ידי שאיבה עדינה. השעו בעדינות בנפח השיורי.
      9. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
         הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן.
2. פונקציונליזציה של ננו-חלקיקי זהב מצופים ציטראט 40 ננומטר על ידי כימיה סטנדרטית של תיול¹⁶.
   1. לעכל קשר דיסולפיד על ידי דגירה של אוליגונוקלאוטידים של בדיקה תיולטית (5′ T(30)–(O–CH₂–CH₂)₃–SH 3′) עם 10 מ"מ Tris(2-carboxyethil)phosphine (TCEP) בטמפרטורת החדר למשך 3 שעות תחת טלטול קל (400 סל"ד).
   2. דגרו עודף גדול של האוליגונוקלאוטידים המעוכלים למשך הלילה עם 10 ננומטר AuNPs, בטמפרטורת החדר תחת רעידות קלות (400 סל"ד).
   3. הביאו את תערובת AuNPs-DNA ל-0.3 M NaCl במאגר פוספט של 10 מ"מ, pH 7.4, 0.01% SDS, על ידי הוספת מלח בשלבים לאורך זמן של 10 שעות, תחת טלטול קל (400 סל"ד).
   4. דגירה למשך הלילה בטמפרטורת החדר תחת רעידות קלות (400 סל"ד).
   5. שטפו את ה-AuNPs המצומדים ל-DNA 3 פעמים עם 0.25 M NaCl במאגר פוספט של 10 מ"מ בתוספת 0.01% SDS, כדי להסיר את עודפי האוליגונוקלאוטידים הלא קשורים.
   6. אחסן את הבדיקות האוניברסליות שהתקבלו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
      הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן.
   7. קבע את צפיפות בדיקות ה-DNA ב-AuNPs באמצעות בדיקה מסחרית מבוססת פלואורסצנטי
   8. למדוד את ריכוז ה-AuNPs על ידי ספקטרוסקופיה UV-vis. על מנת לגזור את ריכוז ה-AuNPs מנתוני הספיגה, ניתן להשתמש בחוק למברט וביר (A=εbc) ובמקדמי הכחדה שפורסמו עבור 40 ננומטר AuNPs¹⁶ .
   9. אפיין בדיקות AuNPs על ידי פיזור אור דינמי (DLS), ומיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM).
      הערה: ניתן להשהות את הניסוי כאן.

2. אפליה קולורימטרית של מוטציה נדירה BRAF^V600E

1. הכן דגימות מטרה לניתוח: תערובות של DNA סינתטי BRAF^V600E ו-BRAF^WT DNA ביחסים שונים (BRAF^V600E:BRAF^WT 1:10, 1:100, 1:200, BRAF^V600E 100%, BRAF^wt 100%).
2. איזון מיקרו-חלקיקים פרמגנטיים על ידי שטיפתם פעמיים עם מאגר הכלאה (HB) (1x PBS pH 7.4, 5% w/v PEG 600) והשעייתם מחדש בנפח HB השווה לנפח ההתחלתי. לכביסה, הכניסו כמות של מיקרו-חלקיקים פרמגנטיים לצינור של 1.5 מ"ל (מקסימום 50 מיקרוליטר / צינור), הוסיפו 500 מיקרוליטר של HB וערבבו שלוש פעמים על ידי פיפטינג עדין, מרחו את המגנט, הפרידו את הסופרנטנט השקוף, הוסיפו מיד 500 מיקרוליטר HB וחזרו על ההליך לשלב כביסה שני. לאחר הסרת הסופרנטנט, הוסף מיד את ה-HB כדי למנוע ייבוש חרוזים, לפי המלצת היצרן.
3. עבור כל דגימה שתיבדק, הכינו צינור המכיל 2.5 מיקרוליטר של מיקרו-חלקיקים פרמגנטיים שטופים ב-HB.
4. פונקציונליזציה של מיקרו-חלקיקים פרמגנטיים על ידי דגירה של 2.5 מיקרוליטר של מיקרו-חלקיקים פרמגנטיים עם 10 מיקרוליטר של תמיסה של 10 מיקרומטר של בדיקה מבחינה ראשונה ביוטינילית (DP1), הנושאת מוטציה BRAF^V600E , למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
5. הפרד מגנטית את המיקרו-חלקיקים מבדיקות לא קשורות מפריעות והשהה אותם מחדש ב-12.5 מיקרוליטר של HB. למטרה זו, החל את המגנט על צד הצינור, והמתן עד שהתמיסה תהיה שקופה. הסר את התמיסה על ידי פיפטינג בזהירות, הוסף מיד HB ופיפטה בעדינות עד שהחרוזים מושעים מחדש בצורה הומוגנית.
6. הוסף לתרחיף 10 מיקרוליטר של תערובת של 10 מיקרומטר של דגימות המטרה של ה-DNA המתוארות בשלב 2.1.
7. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
8. במהלך הדגירה, יש לנער דגימות כל 3 דקות כדי למנוע שקיעה של המיקרו-חלקיקים הפרמגנטיים.
9. הוסף למתלה 10 מיקרוליטר של תמיסה של 2 מיקרומטר של בדיקה מבחינה שנייה (DP2), שתוכננה להיות בעלת חלק משלים למטרה וזנב פולי-A.
10. דוגרים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
11. במהלך הדגירה, יש לנער דגימות כל 3 דקות כדי למנוע שקיעה של המיקרו-חלקיקים הפרמגנטיים.
12. הפרד מגנטית עודף DP2 לאחר הדגירה.
13. הוסף מיד 300 fmol של AuNPs מצומדים עם בדיקות זיהוי ודגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
14. הפרד מגנטית סופרנטנט המכיל עודפי AuNPs ובצע את שלב^{הכביסה הראשון} על ידי הוספת 100 מיקרוליטר HB בטמפרטורת החדר.
15. הפרד מגנטית את הסופרנטנט ובצע^{שלב כביסה שני} על ידי הוספת 100 מיקרוליטר HB.
16. דגירה בטמפרטורה של 52 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
17. סופרנטנט מופרד מגנטית ב-52 מעלות צלזיוס.
18. השעו מחדש מיד ב-12.5 מיקרוליטר של HB לקריאת התוצאה הקולורימטרית.
19. צלם את התוצאות ואחסן את הדגימות ב-4 מעלות צלזיוס.

תוצאות

שיטה זו שימשה לאיתור מוטציה BRAF^V600E בעודף של BRAF^wt DNA סינתטי. איור 1 מציג את הפרטים של אסטרטגיית הזיהוי. הבדיקה נותנת תוצאת YES/NO קולורימטרית ^17,18 כאשר אדום מתאים לתוצאה חיובית (YES) וצהוב לתוצאה שלילית (NO).

בקצרה, מיקרו-חלקיקים פרמגנטיים סטרפטווידיניים צופו בבדיקות מבחינות ביוטיניליות (DP1) הנושאות מוטציה BRAF^V600E . דגימות המטרה שיש לנתח (תערובת של BRAF^wt

דיון

ההיבט המרכזי של השיטה הוא היכולת להבחין ב-DNA מטרה בהקשר של עודף של DNA מפריע שאינו מטרה, כאשר DNA יעד ולא מטרה נבדלים רק עבור נוקלאוטיד בודד אחד. לפיכך, תכנון הגשושיות ותנאי ההכלאה הם קריטיים להשגת אפליה רגישה. הבדיקה נועדה להשתמש בבדיקות קולורימטריות אוניברסליות כדי להיות מותאמות לזיהוי כל מוטציה נקודתית מעניינת. עם זאת, ייתכן שיש לבצע אופטימיזציה קלה של תנאי התגובה בכל פעם שזוג בדיקה חדש מתוכנן למוטציה חדשה.

השלב הקריטי היחיד בשיטה הוא שלב 2.17, שבו יש לבצע...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Bench Top Centrifuge- Allegra X 30	Beckman Coulter	A99473
DL-Dithiothreitol	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, דרמשטאדט, גרמניה	D0632-25G
Dynabeads M-280 סטרפטווידין מיקרו-חלקיקים פרמגנטיים	Invitrogen	11205D
הידרוקסילאמין סולפט	Sigma-Aldrich/ Merck KGaA, דרמשטאדט, גרמניה	379913-25G
KDS 100 משאבת מזרק מדור קודם	kdScientific	789100
NanoDrop OneC ספקטרופוטומטר	תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ, וולת'אם, MA, ארה"ב)
פוספט מאגר מלח	סיגמא-אולדריץ' / Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה	806552-500ML
פירס וסחר; TCEP-HCl, ללא שקילה וסחר; פורמט	Thermo Fisher Scientific Inc., וולת'ם, MA, ארה"ב)	A35349
פוליאתילן גליקול 600	סיגמא-אולדריץ' / Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה	202401
PTFE 0,22 ומיקרו; מסנני m, Fluoropore	Millipore	FGLP04700
Quant-iT™ OliGreen™ ערכת בדיקת ssDNA	תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ, וולת'ם, מסצ'וסטס, ארה"ב)	O11492
נתרן ציטראט דיהידראט	סיגמא-אולדריץ' / Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה	W302600
אוליגונוקלאוטידים סינתטיים	Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA)
חומצה טטרכלורואורית (III)	סיגמא-אולדריץ' / Merck KGaA, דרמשטדט, גרמניה	520918
בדיקות DNA של פוליט תיולד	טכנולוגיות DNA משולבות, בע"מ (IDT DNA)
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)מיקרוסקופ			JEOL JEM 1011
Zetasizer Nano S - מערכת פיזור אור דינמית	Malvern Panalytical