כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור אמצעי האחסון המינימלי של ויטריפיקציה של חתולים בלתי בוגרים עם מדיה מתוצרת מעבדה על תמיכות מסחריות. הוא מכסה כל צעד מ oocyte בידוד מ vivo גונדות לשעבר כדי ויטריפיקציה והתחממות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
בתוכניות השימור של חיות הבר, הבנקאות המגיים חיונית לשמירה על משאבים גנטיים של אנשים יקרי ערך ומינים נדירים ולקדם שימור ביולוגי. ב-felids, רוב המינים מאוימים בפני הכחדה, וגזעים ביתיים משמשים כמודל כדי להגביר את היעילות של פרוטוקולים עבור בנקאות germplasm. בין טכניקות הקפאת הקריוציט, ויטריפיקציה הוא יותר ויותר פופולרי ב אדם וטרינרי בסיוע רבייה. קריוטופ ויטריפיקציה, אשר פותחה לראשונה עבור האדם oocytes ועוברים, הוכיחה להיות מתאים היטב עבור החתול oocytes. שיטה זו מציעה מספר יתרונות, כגון הכדאיות בתנאי שדה ומהירות ההליך, שיכולה להועיל כאשר יש צורך לעבד מספר דגימות. עם זאת, היעילות תלויה מאוד בכישורי המפעיל, ובקביעת הסדר הפנים-מעבדה, ובהתאם לצורך בהכשרה לאנשי צוות. פרוטוקול זה מתאר כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים בתמיכה מסחרית בפרוטוקול צעד אחר צעד ידידותי לשדה, מאוסף oocyte להתחממות. בעקבות הפרוטוקול, שימור שלמות oocyte ויכולת הכדאיות בהתחממות (גבוה ככל 90%) ניתן לצפות, למרות שעדיין יש מקום לשיפור התבגרות שלאחר ההתחממות ותוצאות פיתוח עובריים.
מבוא
הקפאה הקריוגנית הפכה לשלב מפתח של טכניקות שעתוק בסיוע (אומנויות). בבני אדם, היא מאפשרת שימור פוריות או דחייה של ההורות מסיבות רפואיות או אישיות. בבעלי חיים, יש צורך להתגבר על מרחק וזמן במקצועות מתוכננים, בעיקר בבעלי חיים חקלאיים ובחיות מחמד, או לשמר חומר גנטי של נושאים יקרי ערך בתוכניות שימור, במיוחד במינים פראיים בסכנת הכחדה. שמירת המשחק היא הבחירה הטובה ביותר כאשר אנשים להיות מתרבה לא נבחרו עדיין או על מנת למנוע בעיות אתיות הקשורות לקיפאון העובר, במיוחד ברפואה האנושית1. הזרע קל יחסית לשמר ולתת תוצאות משביע רצון לאחר הפשרה, אבל oocytes, בשל התכונות הקונסטרוקטיביות שלהם, יכול להיות מורכב יותר לאחסן. ואכן, היחס הנמוך של פני השטח/נפח, כמו גם הנוכ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ההליכים מתוארים בזאת לא עברו אישור מוסרי מאז שחלות החתול נאספו במרפאות וטרינרי כמו תוצרי לוואי של הבעלים-כריתת שגרתית המבוקש או ovarioכריתת רחם.
1. אוסף אוקינטה
- לפני תחילת הניסויים, להכין פתרונות עבור שחלות ואוסף oocyte. הכנת הפתרון של אוסף שחלות עם מלוחים באגירה פוספט (PBS) עם תערובת של אנטיביוטיקה ו antimycotics (100 IU/mL של פניצילין G נתרן, 0.1 mg/mL של סטרפטומיצין סולפט, 0.25 μg/mL של אמפוריטיצין B). הכינו פתרון אוסף oocyte (כלומר, PBS/PVA) עם PBS עם 100 IU/mL של פניצילין G נתרן, 0.1 mg/mL של סטרפטומיצין סולפט ו 0.1% (w/v) פוליוויניל אלכוהול (PVA).
- לאחסן פתרונות עבור השחלה ואוסף oocyte ב 4 ° צ' עד השימוש.
- ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות החתול oocyte ויטריפיקציה ומתחמם בהתאם לפרוטוקול הנוכחי (איור 1 ומשלים איור 1), הרוב המכריע של גיים לשרוד. לאחר ויטריפיקציה, בין טכניקות אחרות, יכולת הכדאיות ניתן להעריך במיקרוסקופ אופטי כמו שלמות מורפולוגית22 או עם שימוש של כתמים חיוניים. אחד האחרונים הוא fluorescein diacetate/propidium יודיד (ה-FDA/PI), אשר מאפשר זיהוי של קיימא (פלואורסצנטית ירוק בהיר) ותאים מתים (זריחה אדומה). איור 2 מראה תמונה מייצגת של החתול הח.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הקפאה הקריוגנית היא טכניקת שימור מכרעת, במיוחד בתחום המינים בהם מינים רבים בסכנת הכחדה, כגון משפחת פליקס. בכתב יד זה, פרוטוקול פשוט וידידותי לשדה לויטריפיקציה של החתול הילדותי אוציטים הוצג. מדיה מתוצרת מעבדה, אמצעי אחסון מינימלי ויטריפיקציה תומך ועובדים מיומנים הם גורמי מפתח להצלחת שיטה זו, אשר מאפשר קבלת האוציטים קיימא בעקביות ושוב, כפי שמוצג על ידי תוצאות הנציגים דיווחו בזאת.
החל בהכנה תקשורתית, יש לעקוב אחר הפרוטוקול באופן מדויק כדי להבטיח את התוצאות הטובות ביותר, אך מיומנויות המפעיל הן הסו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
. למחברים אין מה לגלות
תודות
עבודה זו היתה נתמכת באופן חלקי על ידי EVSSAR (האגודה האירופית וטרינרית עבור רבייה בעלי חיים קטנים) גרנט 2016 ועל ידי אוניברסיטת הווסטאה degli Studi די מילאנו, פסנתר די Sostegno אלה Ricerca 2019 (לינאה 2 Azione A). כמו כן, אנו רוצים להודות לד ר מרידעגיה מורסלי על תרומתו לניסויים המתוארים בזאת ולרכישת תמונה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אמפוטריצין B | סיגמא-אולדריץ' | A2942 | / |
| פיפטות אוטומטיות וטיפים | / | דרוש לפיפטה 20, 100, 240 ו-300 ומיקרו; L | |
| אזמלים כירורגיים | / | / | מידה 10 זה בדרך כלל בסדר |
| מקור בונסן | / | / | / |
| מהדקים | / | / | חלקם קטנים (מהדק יתושים) לבידוד שחלות, חלקם גדולים יותר (מהדק קלמר) לעבודה בחנקן נוזלי |
| Cryotop | Kitazato (מפיץ: MBT - Medical Biological Technologies)01.CR | המפיצים והמספר הקטלוגי עשויים להשתנות במדינות שונות | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ' | D2650 | / |
| אתילן גליקול (EG) | סיגמא-אולדריץ' | E9129 | / |
| סרום בקר עוברי (FBS) | סיגמא-אולדריץ' | F9665 | / |
| פיפטות פסטר מזכוכית | / | אורך מומלץ 230 מ"מ (100+130) | |
| גובלט | / | על פי מיכלי מיכל האחסון | |
| חימום stage | / | / | כל החימום stage בסדר, כל עוד הם יכולים לשמור על 38&; C |
| חנקן נוזלי | / | / | / |
| בינוני 199 | סיגמא-אולדריץ' | M4530 | / |
| מי מלח חוצץ פוספט (PBS) | סיגמא-אולדריץ' | D8662 | / |
| פניצילין G נתרן | סיגמא-אולדריץ' | P3032 | / |
| אלכוהול פוליוויניל (PVA) | סיגמא-אולדריץ' | P8136 | / |
| צלחת | ReproKitazato (מפיץ: MBT - Medical Biological Technologies) | 01.K-2 | המפיצים והמספר הקטלוגי עשויים להשתנות במדינות שונות |
| סטריאומיקרוסקופ | / | כל עוד המפעיל יכול לבחור את הביציות, סטריאומיקרוסקופים אחרים בסדר | |
| מיכל אחסון | / | /כל מיכל מלא באופן קבוע הוא בסדר | |
| סטרפטומיצין סולפט | סיגמא-אולדריץ' | S9137 | / |
| קלקר / קופסה עמידה בחנקן | / | / | כל הקופסאות שיכולות להכיל חנקן נוזלי הן בסדר, כל עוד המפעיל מרגיש בנוח. קופסת Kitazato נקראת "מתלה קירור" |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | / |
| טיימרים | / | / | כל הטיימרים שניתן להגדיר בזמנים עד 9 דקות הם בסדר |
מקורות
- Bankowski, B., Lyerly, A., Faden, R., Wallach, E. The social implications of embryo cryopreservation. Fertility and Sterility. 84 (4), 823-832 (2005).
- Saragusty, J., Arav, A. Current progress in oocyte and embryo cryopreservation by slow freezing and vitrification.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
