מאמר שיטה

זיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של אימונוגלובולין עכברים נפרופתיים

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61535

⸱

8 ביולי 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Nephrology, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 2Division of Intensive Care Unit, First Department of Integrated Medicine, Saitama Medical Center, Jichi Medical University, 3Department of Medical Physiology, Meiji Pharmaceutical University

במאמר זה

סיכום

מיקרו-רנ"א מעורבים בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. פיתחנו שיטה אמינה לאיתור רמות ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של עכבר נפרופתיה מסוג IgA (עכברי HIGA). שיטה חדשה זו תקל על בדיקת מעורבות miRNA בנפרופתיה מסוג IgA.

תקציר

אימונוגלובולין A (IgA) נפרופתיה היא סוג של גלומרולונפריטיס ראשונית המאופיינת בתצהיר חריג של IgA, המוביל לאי ספיקת כליות סופנית. בשנים האחרונות דווח על מעורבות של מיקרו-רנ"א (miRNAs) בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. עם זאת, אין שיטה מבוססת ליצירת פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים. לכן, פיתחנו שיטה אמינה לניתוח miRNA בכליה של מודל עכבר IgA (עכבר HIGA). מטרת פרוטוקול זה היא לזהות את רמות הביטוי המשתנות של miRNA בכליות של עכברי HIGA בהשוואה לרמות בכליות של עכברי ביקורת. בקצרה, שיטה זו מורכבת מארבעה שלבים: 1) קבלת דגימות כליה מעכברי HIGA; 2) טיהור RNA כולל מדגימות כליה; 3) סינתזה של דנ"א משלים מרנ"א כולל; ו-4) תגובת שרשרת כמותית של פולימראז בשעתוק לאחור (qRT-PCR) של miRNA. באמצעות שיטה זו זיהינו בהצלחה את רמות הביטוי של מספר miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p) בכליות של עכברי HIGA. שיטה חדשה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אחרים פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA.

מבוא

Immunoglobulin A (IgA) נפרופתיה היא סוג של glomerulonephritis ראשוני המאופיין על ידי תצהיר חריג של IgA באזור mesangial גלומרולרי הכליה 1,2. זהו הנפוץ ביותר של glomerulonephritis הראשוני ומוביל לאי ספיקת כליות סופנית ב 20%-40% מהחולים2. הסיבה עדיין לא ידועה, אך זיהום רירית מתמשך היה מעורב 1,3. קורטיקוסטרואידים, מדכאי חיסון ומעכבי מערכת רנין-אנגיוטנסין הוצעו כשיטות טיפוליות1,3, אך לא נקבעו לחלוטין3. לכן, נדרש מחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה ואת שיטות הטיפול של טיפול נפרופתיה IgA.

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הם רנ"א קטנים ולא מקודדים הממלאים תפקיד חשוב בוויסות ביטוי גנים 4,5. miRNA מדווחים כמעורבים בפתוגנזה של מחלות שונות, וחלקם זוהו כסמנים ביולוגיים של מחלות וסוכנים טיפוליים 4,5. בשנים האחרונות דווח גם על קשר בין miRNAs לבין הפתוגנזה של נפרופתיה IgA 2,6,7. לדוגמה, miR-148b הוכח כמעורב בהפרעות מבניות של IgA בחולים עם נפרופתיה IgA 2,6,7, בעוד miR-148b ו- let-7b תועדו כסמנים ביולוגיים חדשניים לגילוי נפרופתיה IgA7. למרות שהבנת ההשפעות של miRNA על נפרופתיה IgA עשויה לעזור להבהיר עוד יותר אטיולוגיה וטיפול 2, שיטות סטנדרטיות ליצירת פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים טרם נקבעו2.

כאן פיתחנו שיטה פשוטה ואמינה למדידת רמות ביטוי miRNA בכליות של עכבר נפרופתיה IgA (עכברי HIGA). עכבר HIGA הוא זן ddY אופייני המראה רמה גבוהה במיוחד של IgA בסרום ואת התצהיר החריג של IgA בגלומרולי כליות 8,9,10,11. לכן, עכברי HIGA יכולים לשמש כעכבר נפרופתיה IgA מודל 8,9,10,11. השיטה שלנו מורכבת מארבעה שלבים עיקריים: ראשית, קבלת דגימות כליה כירורגית מעכברי HIGA; שנית, הומוגניזציה של דגימות וטיהור הרנ"א הכולל באמצעות עמוד ספין מבוסס קרום סיליקה; שלישית, סינתזה של דנ"א משלים (cDNA) מסך הרנ"א באמצעות שעתוק הפוך; ורביעית, זיהוי רמות הביטוי של miRNA על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית בשעתוק לאחור (qRT-PCR). הרציונל לשיטה זו ומהימנות התוצאות מבוססים על דוחות קודמים12,13. אנו מראים כי זוהי טכניקה שימושית למדידה מדויקת של רמות ביטוי miRNA במודל עכבר נפרופתיה IgA, וכי ניתן להשתמש בה כדי להקל על מחקר עתידי של miRNA בנפרופתיה IgA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ועומדים בהנחיות השימוש והטיפול בחיות ניסוי של מדריך האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י לחיות מעבדה.

1. קבלת דגימות כליה מעכברי HIGA

הערה: עכברי HIGA מראים פנוטיפ יציב של נפרופתיה IgA לאחר 25 שבועות של גיל 8,9,10,11. עכברי Balb/c צריכים להיבחר כקבוצת הביקורת 8,9,10,11. התקבלו נקבות עכברי HIGA בנות 25 שבועות (n = 10) ועכברות Balb/c בנות 25 שבועות (n = 10). יש לקבוע מראש את מספר העכברים הדרושים לניסויים. שלב זה דורש כ-7-8 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי Balb/c.

  1. הכינו את הפריטים הבאים: עכברי HIGA (בני 25 שבועות, נקבה), עכברי Balb/c (בני 25 שבועות, נקבה), מכשיר הרדמה בשאיפה, איזופלורן, יריעת שעם, סיכה, מלח חוצץ פוספט (PBS), מזרקי הזרקה, מחטים, מספריים כירורגיים ומלקחיים.
  2. מרדימים עכבר HIGA באמצעות 4%-5% איזופלורן עם מכשיר הרדמה באינהלציה ומרכיבים אותו במצב גבי על יריעת השעם באמצעות פינים. להתאים את ריכוז isoflurane ל 2%-3% כמינון תחזוקה לאחר השראת הרדמה.
    הערה: עומק ההרדמה נשמר ברמה שבה הכאב הקשור להליך הפולשני נעלם לחלוטין. בפרט, ריכוז isoflurane צריך להיות מותאם ל 4-5% בעת כריתת רקמות כגון בית החזה. הסרת שיער ומשחת עיניים אינן חיוניות. אין צורך להרכיב את העכבר על כרית חימום אם ניתן לבצע את ההליך במהירות.
  3. בצע חתך קו אמצע של 3-4 ס"מ של דופן הבטן של העכבר עם מספריים כירורגיים ומלקחיים וזהה בזהירות את שני צידי הכליה.
  4. חותכים את הצלעות והסרעפת עם מספריים כירורגיים ומלקחיים כדי לחשוף את הלב. לאחר חיתוך האטריום הימני, יש להזריק PBS לחדר השמאלי עד שצבע הכליה משתנה לצהוב בהיר (הליך זה אומר שכל גוף העכבר מחורר עם PBS).
  5. חותכים את עורק הכליה, וריד הכליה והשופכן, ומוציאים את הכליה. מחלקים את הכליה לחתיכות של 30 מ"ג לשימוש בשלב הבא.
    הערה: הפתולוגיה של נפרופתיה IgA כוללת בעיקר את glomerulus בקליפת הכליה (החלק החיצוני של הכליה). למרות שקשה להבחין באופן מקרוסקופי ומוחלט בין קליפת המוח לבין המדולה, רצוי לאסוף בעיקר את החלק החיצוני של הכליה. דגימות אלה ניתן לאחסן ב -80 ° C במשך מספר חודשים.

2. טיהור RNA כולל מדגימות כליה

הערה: בשלב זה, ערכת בידוד miRNA זמינה מסחרית משמשת להפקת RNA כולל. בנוסף, ביופולימר גריסה עמוד ספין משמש. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים. ערכת בידוד miRNA מכילה עמוד ספין מבוסס קרום סיליקה, ריאגנטים ליזיס מבוססי פנול/גואנידין, חיץ שטיפה גואנידין/אתנול (חיץ שטיפה 1), חיץ שטיפה אתנול (חיץ שטיפה 2) ומים ללא נוקלאז. שלב זה דורש כ-3 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי ביקורת.

  1. הכינו את הפריטים הבאים: שפופרות איסוף של 1.5 או 2.0 מ"ל, 100% אתנול, כלורופורם, הומוגנייזר סיליקון, מיקרופיפטה, קצות פיפטה, צנטריפוגה, עמוד ספין לגריסת ביופולימר, עמוד ספין מבוסס סיליקה, ריאגנטים ליזיס מבוססי פנול/גואנידין, חיץ שטיפה גואנידין/אתנול (חיץ שטיפה 1), חיץ שטיפה אתנול (חיץ שטיפה 2) ומים ללא נוקלאז.
  2. הומוגניזציה של דגימות כליה של 30 מ"ג באמצעות הומוגנייזר סיליקון ו-700 מיקרוליטר של מגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין בטמפרטורת החדר.
    הערה: ה-miRNA בדגימה פגיעים עד שנחשפו למגיב ליזה מבוסס פנול/גואנידין, ולכן יש לבצע שלבים אלה בהקדם.
  3. מעבירים את הליזט לעמוד הספין הגורס ביופולימר וצנטריפוגות אותו במהירות של 15,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מוסיפים 140 μL כלורופורם לתסנין ומערבבים במרץ במשך 15 שניות. להשאיר במשך 2-3 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 12,000 x גרם ב 4 ° C במשך 15 דקות.
  5. מעבירים בעדינות את הסופרנאטנט השקוף מבלי לגעת בשכבה האמצעית לצינור איסוף חדש ומוסיפים את הנפח שנקבע (ראו להלן) של 100% אתנול. מערבולת במשך 5 שניות.
    הערה: נדרש 100% אתנול בנפח של פי 1.5 מהסופרנאטנט המתקבל.
  6. מעבירים את הדגימה (גבול עליון 700 μL) לעמוד ספין מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב-8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
  7. הוסף 700 μL של חיץ כביסה 1 לעמוד הספין מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה את העמוד בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב 8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
  8. הוסף 500 μL של חיץ כביסה 2 לעמוד הסחרור מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב 8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
  9. הוסף 500 μL של חיץ כביסה 2 לעמוד הסחרור מבוסס קרום סיליקה וצנטריפוגה אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 שניות ב 8,000 x גרם. יש להשליך את התסנין לאחר הצנטריפוגה.
  10. צנטריפוגו שוב את עמוד הסחרור המבוסס על קרום סיליקה מבלי להוסיף דבר כדי להסיר אתנול נוסף, בטמפרטורה של 15,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. לזרוק את התסנין לאחר צנטריפוגה.
  11. שנה את הצינור המחובר לעמודת הסחיטה לצינור איסוף חדש.
  12. הוסף 30 μL של מים נטולי נוקלאז לעמוד הסחרור מבוסס קרום הסיליקה וצנטריפוגה אותו ב 8,000 x גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר.
    הערה: תמיסת 30 μL המתקבלת מכילה ריכוז גבוה של RNA כולל. מדגם זה ניתן לאחסן ב -80 ° C במשך מספר חודשים.

3. סינתזה של cDNA מסך RNA

הערה: בשלב זה, נעשה שימוש בערכת תמלול לאחור הזמינה באופן מסחרי. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים. ערכה זו מכילה תערובת חומצות גרעין, תערובת שעתוק הפוך וחיץ. הליך זה חייב להתבצע על קרח כדי למנוע התקדמות של התגובה. שלב זה דורש כ-3 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי ביקורת.

  1. הכינו את הפריטים הבאים: צינורות איסוף 1.5 מ"ל, צינורות רצועת שמונה בארות, מיקרופיפטים, קצות פיפטה, ספקטרופוטומטר, מים ללא נוקלאז, קרח, תערובת חומצות גרעין, תערובת שעתוק הפוך, חיץ ומחזור תרמי.
  2. למדוד את ריכוז הרנ"א הכולל באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר מכן, חשב את הנפח הנדרש של מים ללא נוקלאז, כך 12 μL מכיל 1 מיקרוגרם של RNA כולל.
  3. הכינו תערובת אב עם התכולה הבאה: 2.0 μL של תערובת חומצות גרעין, 2.0 μL של תערובת שעתוק לאחור, ו- 4.0 μL של חיץ לסך של 8.0 μL לדגימה.
  4. הוסף 8 μL של תערובת האב לכל באר של שמונה צינורות רצועה באר.
  5. לדלל את סך הרנ"א בנפח המים נטולי הנוקלאז המחושב ב-3.2. לאחר מכן, הוסף 12 μL של תמיסת RNA הכוללת (המכילה 1 מיקרוגרם של RNA כולל) לכל באר של שמונה צינורות רצועה באר.
  6. לדגור את הדגימה ב 8 צינורות רצועת באר ב 37 ° C במשך 60 דקות באמצעות מחזור תרמי. לאחר מכן, לדגור ב 95 ° C במשך 5 דקות באמצעות מחזור תרמי.
    הערה: התמיסה לאחר הדגירה מכילה ריכוז גבוה של cDNA.
  7. העבר תמיסה זו לצינור של 1.5 מ"ל והוסף 200 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז.
    הערה: 200 μL המתקבל של פתרון יכול לשמש עבור qRT-PCR כמו cDNA תבנית. מדגם זה ניתן לאחסן ב -80 °C במשך כשנה.

4. qRT-PCR של miRNA

הערה: בשלב זה, נעשה שימוש בערכת PCR זמינה מסחרית. ראה טבלת חומרים לפרטים נוספים. ערכה זו מכילה תערובת PCR, פריימר אוניברסלי ומים ללא נוקלאז. דוגמאות צריך להיות מוכן כפול, ואת הדיוק של התוצאות צריך להיחשב בכל מקרה. רמות הביטוי של miRNA מכומתות בשיטת ΔΔCT. שלב זה דורש כ-4 שעות עבור מדגם בגודל של 10 עכברי HIGA ו-10 עכברי ביקורת.

  1. הכינו את הפריטים הבאים: שפופרת איסוף של 1.5 מ"ל, צלחת תגובה של 96 בארות, סרט דבק לצלחת התגובה של 96 בארות, מיקרופיפטה, קצות פיפטה, תערובת PCR, פריימר אוניברסלי, מים ללא נוקלאז, פריימרים ספציפיים ל-miRNA ומכשיר PCR בזמן אמת.
  2. הכן את תערובת האב עם התוכן הבא: 12.5 μL של תערובת PCR, 2.5 μL של פריימר אוניברסלי, 1.25 μL של 5 μM פריימר ספציפי miRNA, ו 6.25 μL של מים ללא nuclease עבור כל באר.
    הערה: בבדיקה זו נעשה שימוש בפריימרים ספציפיים ל-miRNA [RNA, U6 Small Nuclear 2 (RNU6-2), miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p]. RNU6-2 שימש כבקרה אנדוגנית14.
  3. הוסף 22.5 μL של תערובת האב לכל באר של צלחת התגובה 96 באר.
  4. הוסף 2.5 μL של cDNA שהוכן בשלב 3.7 לבאר בודדת של צלחת באר 96.
  5. כסו את צלחת התגובה של באר 96 בסרט הדבקה, ולאחר מכן צנטריפוגה במהירות של 1,000 x גרם למשך 30 שניות.
  6. הפעל את מכשיר ה- PCR בזמן אמת. תכנת את מכשיר ה- PCR באופן הבא: הפעלה ראשונית ב- 95 ° C למשך 15 דקות, לאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב- 94 ° C למשך 15 שניות, חישול ב- 55 ° C למשך 30 שניות, והרחבה ב- 70 ° C למשך 30 שניות.
  7. כימות ביטוי גנים בשיטת ΔΔCT. רמות ביטוי יחסיות נקבעות כ- 2–ΔΔCT.
    הערה: יש לשקול עקומות הגברה חריגות של PCR לצורך אי הכללה מהתוצאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

חקרנו את רמות הביטוי של miRNA בכליות של עכברי HIGA (n=10). תוצאה זו התקבלה לחלוטין על בסיס הפרוטוקול המתואר. הכליות של עכברי Balb/c נבחרו כקבוצת הביקורת (n=10). בשתי הקבוצות נבחרו בני 25 שבועות. רק נקבות עכברי HIGA היו זמינות מהספק. רמות הביטוי של שלוש miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p; איור 1) זוהו, אשר דווח בעבר להיות קשור עם נפרופתיה IgA15,16. רמות ביטוי miRNA יחסיות של שתי הקבוצות הושוו באמצעות מבחן t, כאשר P < 0.05 ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הצלחנו למדוד את רמות הביטוי של miRNA בכליות של מודל עכבר נפרופתיה IgA (עכברי HIGA) באמצעות שיטה חדשה זו. IgA נפרופתיה היא מחלה בלתי מוסברת הזקוקה למחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה שלה ואת המטרות הטיפוליות 1,3. עם זאת, השגת דגימות כליה אנושיות היא פולשנית ביותר. טכניקה חדשה זו היא יתרון בכך שהיא מאפשרת מחקר של נפרופתיה IgA באמצעות בעלי חיים קטנים ואמורה להקל על מחקר עתידי של נפרופתיה IgA ו miRNAs. במחקר עתידי, שיטה זו יכולה להיות מיושמת במחקר של miRNA חדש לטיפול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

אנו מודים לשרה ויליאמס, PhD, מקבוצת אדנץ (www.edanzediting.com) על עריכת טיוטה של כתב יד זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
BALB/cCrSlc (בן 25 שבועות, נקבה)Japan SLC, Inc.ללאעכבר לשליטה
HIGA/NscSlc (בן 25 שבועות, נקבה)Japan SLC, Inc.ללאדגם עכבר נפרופתיה IgA
MicroAmp אופטי 96 באר צלחת תגובה עבור qRT-PCRתרמו פישר4316813צלחת תגובה 96 בארות
מיקרואמפ סרט דבק אופטיתרמו פישר סרט דבק מדעי4311971לצלחת תגובה 96 בארות
miScript II ערכת RTQiagen218161ערכה ניסיונית לסינתזה של cDNA
miRNeasy Mini ערכהQiagen217004ערכת ניסוי למיצוי סך כל ה-RNA
miScript Primer Assay (RNU6-2)QiagenMS00033740-miScript
Primer Assay (miR-155-5p)QiagenMS00001701-miScript
Primer Assay (miR-146a-5p)QiagenMS00001638-miScript
Primer Assay (miR-21-5p)QiagenMS00009079פריימר miScript
ערכת PCR ירוקהשל Qiagen218073ערכה ניסיונית למגרסת PCR בזמן אמת
QIA Qiagen79654עמודת סיבוב גריסת ביופולימר
QuantStudio 12K Flex Flex מערכת PCR בזמן אמתThermo Fisher Scientific4472380מכשיר PCR בזמן אמת
תוכנת QuantStudio 12K Flex גרסה 1.2.1.Thermo Fisher Scientific4472380תוכנת מכשיר PCR בזמן אמת
בתקןTakara Bio9790Bהומוגנייזר סיליקון

מקורות

  1. Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
  2. Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
  3. Wyatt, R. J., Julian, B. A. IgA nephropathy. The New England Journal of Medicine. 368 (25), 2402-2414 (2013).
  4. Vishnoi, A., Rani, S. MiRNA Biogenesis and Regulation of Diseases: An Overview. Methods in Molecular Biology. 1509, 1-10 (2017).
  5. Rupaimoole, R., Slack, F. J. MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (3), 203-222 (2017).
  6. Serino, G., Sallustio, F., Cox, S. N., Pesce, F., Schena, F. P. Abnormal miR-148b expression promotes aberrant glycosylation of IgA1 in IgA nephropathy. Journal of the American Society of Nephrology. 23 (5), 814-824 (2012).
  7. Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
  8. Muso, E., et al. Enhanced production of glomerular extracellular matrix in a new mouse strain of high serum IgA ddY mice. Kidney International. 50 (6), 1946-1957 (1996).
  9. Kurano, M., Yatomi, Y. Use of gas chromatography mass spectrometry to elucidate metabolites predicting the phenotypes of IgA nephropathy in hyper IgA mice. Plos One. 14 (7), 0219403(2019).
  10. Hyun, Y. Y., et al. Adipose-derived stem cells improve renal function in a mouse model of IgA nephropathy. Cell Transplantation. 21 (11), 2425-2439 (2012).
  11. Katsuma, S., et al. Genomic analysis of a mouse model of immunoglobulin A nephropathy reveals an enhanced PDGF-EDG5 cascade. The Pharmacogenomics Journal. 1 (3), 211-217 (2001).
  12. Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. BioTechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
  13. Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nature Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
  14. Sauer, E., Babion, I., Madea, B., Courts, C. An evidence based strategy for normalization of quantitative PCR data from miRNA expression analysis in forensic organ tissue identification. Forensic Science International: Genetics. 13, 217-223 (2014).
  15. Wang, G., et al. Elevated levels of miR-146a and miR-155 in kidney biopsy and urine from patients with IgA nephropathy. Disease Markers. 30 (4), 171-179 (2011).
  16. Hennino, M. F., et al. miR-21-5p renal expression is associated with fibrosis and renal survival in patients with IgA nephropathy. Scientific Reports. 6, 27209(2016).
  17. Green, M. R., Sambrook, J. How to Win the Battle with RNase. 2019 (2), Cold Spring Harbor Protocols. (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

IgARNAcDNAqRT PCRHIGAmiR 155 5pmiR 21 5pDelta Delta CT

מאמרים קשורים