מיקרו-רנ"א מעורבים בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. פיתחנו שיטה אמינה לאיתור רמות ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של עכבר נפרופתיה מסוג IgA (עכברי HIGA). שיטה חדשה זו תקל על בדיקת מעורבות miRNA בנפרופתיה מסוג IgA.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זיהוי ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות של אימונוגלובולין עכברים נפרופתיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
אימונוגלובולין A (IgA) נפרופתיה היא סוג של גלומרולונפריטיס ראשונית המאופיינת בתצהיר חריג של IgA, המוביל לאי ספיקת כליות סופנית. בשנים האחרונות דווח על מעורבות של מיקרו-רנ"א (miRNAs) בפתוגנזה של נפרופתיה מסוג IgA. עם זאת, אין שיטה מבוססת ליצירת פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA באמצעות מודלים של בעלי חיים קטנים. לכן, פיתחנו שיטה אמינה לניתוח miRNA בכליה של מודל עכבר IgA (עכבר HIGA). מטרת פרוטוקול זה היא לזהות את רמות הביטוי המשתנות של miRNA בכליות של עכברי HIGA בהשוואה לרמות בכליות של עכברי ביקורת. בקצרה, שיטה זו מורכבת מארבעה שלבים: 1) קבלת דגימות כליה מעכברי HIGA; 2) טיהור RNA כולל מדגימות כליה; 3) סינתזה של דנ"א משלים מרנ"א כולל; ו-4) תגובת שרשרת כמותית של פולימראז בשעתוק לאחור (qRT-PCR) של miRNA. באמצעות שיטה זו זיהינו בהצלחה את רמות הביטוי של מספר miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p) בכליות של עכברי HIGA. שיטה חדשה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אחרים פרופיל miRNA בנפרופתיה IgA.
מבוא
Immunoglobulin A (IgA) נפרופתיה היא סוג של glomerulonephritis ראשוני המאופיין על ידי תצהיר חריג של IgA באזור mesangial גלומרולרי הכליה 1,2. זהו הנפוץ ביותר של glomerulonephritis הראשוני ומוביל לאי ספיקת כליות סופנית ב 20%-40% מהחולים2. הסיבה עדיין לא ידועה, אך זיהום רירית מתמשך היה מעורב 1,3. קורטיקוסטרואידים, מדכאי חיסון ומעכבי מערכת רנין-אנגיוטנסין הוצעו כשיטות טיפוליות1,3, אך לא נקבעו לחלוטין3. לכן, נדרש מחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה ואת ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי חיים באוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י ועומדים בהנחיות השימוש והטיפול בחיות ניסוי של מדריך האוניברסיטה הרפואית ג'יצ'י לחיות מעבדה.
1. קבלת דגימות כליה מעכברי HIGA
הערה: עכברי HIGA מראים פנוטיפ יציב של נפרופתיה IgA לאחר 25 שבועות של גיל 8,9,10,11. עכברי Balb/c צריכים להיבחר כקבוצת הביקורת 8,9,10,11. התקבלו נקבות עכברי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
חקרנו את רמות הביטוי של miRNA בכליות של עכברי HIGA (n=10). תוצאה זו התקבלה לחלוטין על בסיס הפרוטוקול המתואר. הכליות של עכברי Balb/c נבחרו כקבוצת הביקורת (n=10). בשתי הקבוצות נבחרו בני 25 שבועות. רק נקבות עכברי HIGA היו זמינות מהספק. רמות הביטוי של שלוש miRNA (miR-155-5p, miR-146a-5p ו-miR-21-5p; איור 1) זוהו, אשר דווח בעבר להיות קשור עם נפרופתיה IgA15,16. רמות ביטוי miRNA יחסיות של שתי הקבוצות הושוו באמצעות מבחן t, כאשר P < 0.05 ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הצלחנו למדוד את רמות הביטוי של miRNA בכליות של מודל עכבר נפרופתיה IgA (עכברי HIGA) באמצעות שיטה חדשה זו. IgA נפרופתיה היא מחלה בלתי מוסברת הזקוקה למחקר נוסף כדי להבהיר את האטיולוגיה שלה ואת המטרות הטיפוליות 1,3. עם זאת, השגת דגימות כליה אנושיות היא פולשנית ביותר. טכניקה חדשה זו היא יתרון בכך שהיא מאפשרת מחקר של נפרופתיה IgA באמצעות בעלי חיים קטנים ואמורה להקל על מחקר עתידי של נפרופתיה IgA ו miRNAs. במחקר עתידי, שיטה זו יכולה להיות מיושמת במחקר של miRNA חדש לטיפול.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
תודות
אנו מודים לשרה ויליאמס, PhD, מקבוצת אדנץ (www.edanzediting.com) על עריכת טיוטה של כתב יד זה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| BALB/cCrSlc (בן 25 שבועות, נקבה) | Japan SLC, Inc. | ללא | עכבר לשליטה |
| HIGA/NscSlc (בן 25 שבועות, נקבה) | Japan SLC, Inc. | ללא | דגם עכבר נפרופתיה IgA |
| MicroAmp אופטי 96 באר צלחת תגובה עבור qRT-PCR | תרמו פישר | 4316813 | צלחת תגובה 96 בארות |
| מיקרואמפ סרט דבק אופטי | תרמו פישר סרט דבק מדעי | 4311971 | לצלחת תגובה 96 בארות |
| miScript II ערכת RT | Qiagen | 218161 | ערכה ניסיונית לסינתזה של cDNA |
| miRNeasy Mini ערכה | Qiagen | 217004 | ערכת ניסוי למיצוי סך כל ה-RNA |
| miScript Primer Assay (RNU6-2) | Qiagen | MS00033740-miScript | |
| Primer Assay (miR-155-5p) | Qiagen | MS00001701-miScript | |
| Primer Assay (miR-146a-5p) | Qiagen | MS00001638-miScript | |
| Primer Assay (miR-21-5p) | Qiagen | MS00009079 | פריימר miScript |
| ערכת PCR ירוקה | של Qiagen | 218073 | ערכה ניסיונית למגרסת PCR בזמן אמת |
| QIA Qiagen | 79654 | עמודת סיבוב גריסת ביופולימר | |
| QuantStudio 12K Flex Flex מערכת PCR בזמן אמת | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | מכשיר PCR בזמן אמת |
| תוכנת QuantStudio 12K Flex גרסה 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | תוכנת מכשיר PCR בזמן אמת |
| בתקן | Takara Bio | 9790B | הומוגנייזר סיליקון |
מקורות
- Rodrigues, J. C., Haas, M., Reich, H. N. IgA Nephropathy. Clinical Journal of the American Society of Nephrology. 12 (4), 677-686 (2017).
- Szeto, C. C., Li, P. K. MicroRNAs in IgA nephropathy. Nature Reviews Nephrology. 10 (5), 249-256 (2014).
- Wyatt, R. J., Julian, B. A.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
