הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

קביעת פרופיל שעתוק של פסוריאסיפורם עורי במבחנה באמצעות תאי HaCaT מגורים בשילוב של ציטוקינים

5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61537

⸱

15 במרץ 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Biotherapy and Cancer Center, West China Hospital, West China Medical School, Sichuan University and Collaborative Innovation Center for Biotherapy, 2Department of Cardiovascular Medicine, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג שיטה להקמת מודל דלקתי עורי פסוריאסיפורמי במבחנה ברמת השעתוק באמצעות שילוב של חמישה ציטוקינים (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) על קו תאי HaCaT.

תקציר

פסוריאזיס היא מחלת עור דלקתית כרונית שכיחה המתווכת על ידי מערכת החיסון המולדת והנרכשת, המאופיינת בהתרבות והתמיינות חריגה של קרטינוציטים אפידרמיסיים וחדירה של תאים דלקתיים. קרטינוציטים ספציפיים לעור הם משתתפים מרכזיים במערכת החיסון המולדת, מגיבים לתאי מערכת החיסון ולגירוי סביבתי, ובכך ממלאים תפקיד חשוב באימונופתוגנזה של פסוריאזיס. כאן, אנו מציגים שיטה להשראת דלקת קרטינוציטים פסוריאסיפורמיים ברמת שעתוק עם קו תאי HaCaT באמצעות שילוב של חמישה ציטוקינים פרו-דלקתיים (שילוב M5), כולל IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α ואונקוסטטין M. התוצאות מדגימות כי תאי HaCaT המושרים בשילוב M5 הראו רמות מוגברות של פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (BD2, S100A7, S100A8 ו-S100A9), כימוקינים וציטוקינים (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 ו-IL-18). רמות ה-mRNA של סמני התמיינות קרטינוציטים (Keratin1, Keratin10, Filaggrin ו-Loricrin) היו מוסדרות כלפי מטה, מה שהיה עקבי עם נתוני הטרנסקריפטום שמקורם בקרטינוציטים דמויי פסוריאזיס. השיטה המתוארת כאן, אם כן, מבססת דלקת עורית פסוריאסיפורמית במבחנה ברמת השעתוק ותורמת למחקר לפתוגנזה מולקולרית של פסוריאזיס.

מבוא

פסוריאזיס היא מחלת עור דלקתית כרונית שאינה מדבקת המופעלת על ידי תגובה חיסונית לא מווסתת, הפוגעת בקרטינוציטים היוצרים בעיקר את האפידרמיס1, המאופיינת בהכפלה מהירה באופן חריג של קרטינוציטים עם היפרקרטוזיס ופרקרטוזיס. פסוריאזיס משפיעה על כ-3% מאוכלוסיית הבר בעולם2. נטל המחלה גדל עוד יותר על ידי מספר מחלות נלוות, כולל מחלות לב וכלי דם ותסמונת מטבולית הנגרמת על ידי התסמונת3.

האפידרמיס מורכב מחמש שכבות של קרטינוציטים ועובר שינוי מורפולוגי בתהליך התמיינות: השכבה הבסיסית, השכבה הספינוזום, השכבה הגרנולוסומית, השכבה הלוסידומית (המצויה על כפות הידיים והסוליות) ושכבת הקרנית המתוארת כאן מהמשטח הפנימי לחיצוני4. שינוי בהתמיינות האפידרמיס מוביל להפרעה במחסום העור, החשוב לפתוגנזה של מחלות דלקתיות בעור 5,6,7,8. קרטינוציטים ממלאים תפקיד חיוני בשמירה על מחסום אפידרמיס שלם למניעת אובדן מים ונגד טריגרים סביבתיים כגון חשיפה ל-UVB, אלרגנים ופתוגנים9. אנשים בריאים מראים איזון בין התפשטות תאי בסיס לבין דשדוש שכבת הקרנית, בעוד שמחלות עור מרובות כולל פסוריאזיס, מאופיינות בחוסר איזון של מנגנון מורכב זה10.

מעבר לתפקוד המחסום, קרטינוציטים הם גם מרכיב חיוני במערכת החיסון של העור. באימונופתוגנזה של פסוריאזיס, הפעלה של תאי T מסייעים מסוג 1 (Th1) ותאי T מסייעים מסוג 17 (Th17), מובילה לייצור מוגבר של IFN-γ ו-IL-17A, בהתאמה. ציטוקינים אלה גורמים לסינתזה מוגברת של כימוקינים (CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), פפטידים אנטי-מיקרוביאליים (BD2, LL37, S100A7/8/9/12) וגורמים דלקתיים אחרים (TNF-α, IL-6, IFN-β) בקרטינוציטים, מה שמוביל לגיוס של יותר Th1, Th17 ונויטרופילים לעור, מה שמגביר עוד יותר את ציר IL-17/IL23 11. הדיבור ההדדי בין קרטינוציטים לתאי חיסון אחראי על אינדוקציה ותחזוקה של פסוריאזיס11.

רשתות ציטוקינים מורכבות תוארו בפסוריאזיס, והתפקיד המרכזי של ציטוקינים פרו-דלקתיים (כגון IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, oncostatin M(OSM) ו-TNF-α) המיוצרים על ידי חדירת תאי חיסון הודגש12,13. ואכן, מחקרים קודמים הראו כי רמות מוגברות של IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α ו-OSM גרמו לפרופיל של פסוריאזי על קרטינוציטים אפידרמיסיים אנושיים רגילים במבחנה14.

קווי תאי קרטינוציטים בני אלמוות (HaCaT) הניתנים להשגה ולתרבית בקלות רבה יותר מאשר קרטינוציטים ראשוניים עם יכולת שחזור טובה יותר, היו בשימוש נרחב לחקר פסוריאזיס 15,16,17,18,19,20. בשונה מנגיף הפפילומה האנושי16 E6/E7 שהפך לתאי HEK001 ו-KerTr, קו תאי HaCaT מסוגל לבטא תוצרי גן התמיינות, כולל Keratin1 (KRT1), Keratin10 (KRT10), Loricrin, ו-filaggrin 20,21,22, ובכך מספק כלי מבטיח הדומה לקרטינוציטים ראשוניים לחקר ויסות הקרטיניזציה והפרו-דלקתי.

KRT5/14 הוא זוג הקרטין העיקרי מסוג I-סוג II המתבטא בקרטינוציטים בסיסיים מתרבים, בעוד שקרטינוציטים מובחנים בשכבות העל-בסיסיות מפחיתים את מווסת KRT5/14 ומבטאים את KRT1/10 כזוג הקרטין העיקרי23. בהשוואה של נגע פסוריאזיס לעור בריא, השינויים בביטוי הקרטין כללו ירידות ב-KRT1/1024,25 ועלייה ב-KRT5/14 באפידרמיס הפסוריאטי26, המאופיין בהתפשטות יתר ופרקרטוזיס27. לוריקרין הוא חלבון מבני מבדיל סופי המהווה יותר מ-70% מהמעטפת המקורנית, תורם לתפקוד מחסום ההגנה של שכבת הקרנית28, המווסתת כלפי מטה בעורם של חולי פסוריאזיס29. פילגרין מתבטא בשלבים הסופיים של התמיינות קרטינוציטים ומעורב בהצטברות של מעטפת קורניפייד דמוית פיגום30, ירידה בביטוי בעור נגע פסוריאזיס29.

בסך הכל, מטרתנו הייתה ליצור מודל קרטינוציטים דלקתיים בתאי HaCaT באמצעות שילוב ציטוקינים שיוכל לסכם באופן סינרגטי כמה מאפיינים של נגעי עור פסוריאזיס, כולל התחלת תגובה חיסונית, התפשטות קרטינוציטים והתמיינות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בצע את שלבים 1 עד 3 בתנאי סטרילי. כל מדיום התרבית הכיל 0.1 מ"ג/מ"ל פניצילין וסטרפטומיצין.

1. הכנת תאים

  1. זרעים 1 x 106 תאי HaCaT ב-10 מ"ל של מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) בצלחת תרבית תאים 100 מ"מ. דגרו את צלחת התרבות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% CO2 למשך יומיים.
  2. כאשר התרבית מגיעה לסביבות 80% מפגש, הסר בזהירות את המדיום מכלי התרבות ושטוף את התאים עם 5 מ"ל של מי מלח חוצץ פוספט 1x (PBS). נדנד בעדינות את צלחת התרבות באופן ידני.
  3. הסר PBS והוסף 2 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% לתאים. נענע בעדינות את צלחת התרבות כדי לתת לתמיסה לצפות לחלוטין את שכבת התאים החד-שכבתית.
  4. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% CO2 למשך 5 דקות עד שהתאים מנותקים באופן גלוי מפני השטח של צלחת התרבות במיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
    הערה: המורפולוגיה של התאים צריכה להופיע עגולה. אם התאים אינם מנותקים היטב, יש לדגור לתקופה נוספת של 5 דקות יחד עם תסיסה ידנית.
  5. לאחר ניתוק התאים, הוסף 5 מ"ל של DMEM בתוספת 10% FBS כדי לנטרל את הטריפסין ולאסוף את תרחיף התאים בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל באמצעות פיפטה.
  6. צנטריפוגה הצינור המכיל תרחיף תאים ב-180 x גרם למשך 5 דקות. לשפוך את הסופרנטנט.
  7. הוסף 10 מ"ל של DMEM בתוספת 10% מדיום FBS לגלולה ופיפטה בעדינות את המדיום למעלה ולמטה כדי להביא את התאים לתרחיף.

2. זריעת תאים בצלחת 6 בארות

  1. זרע את התאים בצפיפות של 2.0 x 105 תאים / באר בצלחת תרבית של 6 בארות.
  2. דגרו את צלחת התרבית בת 6 הבארות ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% CO2 למשך הלילה לפני גירוי משולב M5 כדי לאפשר לתאים להיצמד לצלחת.

3. גירוי M5 של תאי HaCaT

  1. הכן מדיום תערובת שילוב ציטוקינים M5 המכיל 10 ננוגרם/מ"ל של חלבון רקומביננטי IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α ואונקוסטטין M ב-DMEM המכיל 2% FBS.
    הערה: שילוב M5 כלל רקומבינציה של IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α ואונקוסטטין M. פעולה סינרגטית של שילוב M5 מסכמת כמה מאפיינים של פסוריאזיס, כמו ויסות מוגבר של כימוקינים וייצור פפטידים אנטי-מיקרוביאליים31.
  2. לאחר תרבית תאים למשך הלילה, הסר את הסופרנטנט, ופיפטה 2 מ"ל של שילוב M5 מערבבים בינוני לכל באר.
  3. המשך בתרבית התאים; ליזטים של תאים נאספו לאחר 24 שעות לכימות mRNA (שלב 4) או תרבית סופרנטנט נאספו לאחר 48-72 שעות לקביעת רמות הציטוקינים על ידי בדיקת ELISA 32,33,34,35,36,37 (שלב 6).

4. קציר mRNA של תאי HaCaT מגורים M5

  1. שאפו את תערובת השילוב M5 בינונית ושטפו פעם אחת עם 1-2 מ"ל PBS קר.
  2. שאפו PBS והוסיפו 1 מ"ל של תמיסת גואנידיום איזותיוציאנט הזמינה מסחרית ישירות לצלחת התרבית כדי ליז את התאים.
  3. פיפטה את הליזאט למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להומוגניזציה ולהעביר את הליזט של התא לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  4. מוסיפים 200 מיקרוליטר כלורופורם, מנערים את הצינור במרץ במשך כ-20 שניות ודוגרים את הדגימה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. צנטריפוגה ב-12,000 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  6. העבירו את השלב המימי לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי של 1.5 מ"ל.
  7. מוסיפים 500 מיקרוליטר איזופרופנול לשלב המימי ומערבבים בעדינות. השאירו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
  8. צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  9. שאפו איזופרופנול והוסיפו 1 מ"ל של 75% אתנול. שוטפים את הגלולה פעם אחת.
  10. צנטריפוגה ב-7,500 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יוצקים את האתנול ונותנים לכדורים להתייבש באוויר.
  11. הוסף 30 מיקרוליטר מים מטופלים DEPC לגלולת ה-RNA. התכוננו לזיהוי RT-PCR.

5. ניתוח ביטוי mRNA על ידי PCR בזמן אמת

  1. בצע סינתזת cDNA עם 1 מיקרוגרם של RNA כולל באמצעות ערכה זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: 1 מיקרוגרם של RNA כולל עבור בדיקת SYBR Green RT-PCR.
  2. הכן את תערובת תגובת ה-PCR. 12.5 מיקרוליטר של פרמיקס SYBR EX Taq II, 1 מיקרוליטר של פריימר PCR קדימה (10 מיקרומטר), 1 מיקרוליטר של פריימר הפוך PCR (10 מיקרומטר), 2 מיקרוגרם של cDNA ו-8.5 מיקרוליטר של dH2O. הנפח הסופי הוא 25 מיקרוליטר לתגובה.
    הערה: רשימת רצפי פריימר של גנים המשמשים לניתוח RT-PCR במחקר זה מוצגת בטבלה 1.
  3. דגירה במחזור תרמי. תנאי הרכיבה כללו מדרגת דנטורציה ב-95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 40 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 5 שניות, 60 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 20 שניות וניתוח עקומת התכה.
  4. נתח נתוני ניסוי RT-PCR על ידי חישוב הבדלים יחסיים בביטוי גנים מערכי Ct (מחזור סף) באמצעות משוואות 2-ΔΔCT. השתמש ב-β-actin כבקרה פנימית לסטנדרטיזציה של ביטוי גנים כמותי יחסי של RT-PCR.

6. קצירת תרבית תאים עבור ELISA

  1. הכניסו כל אמצעי תרבית תאים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
  2. צנטריפוגה ב-1500 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. יש לצרוך את הסופרנטנט ולאחסן מיד בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

7. ניתוח ביטוי ציטוקינים על ידי ELISA

  1. עקוב אחר הוראות היצרן כדי להכין את כל הריאגנטים, תקן העבודה והדגימות. דילול טורי פי שלושה של תקן עם דילול דגימה שנע בין 2,000 ל-2.74 pg/mL. דגימות מדללות 1:2 עם מדלל דגימה.
  2. הוסף 100 מיקרוליטר של תקן ודגימה לבאר. מכסים בארות במכסה ואוטמים את הצלחת בניילון פרפין. דגירה למשך 2.5 שעות בטמפרטורת החדר.
  3. לאחר 2.5 שעות, השלך את התמיסה. הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר כביסה לכל באר בצלחת למשך 3 דקות ושואב. חזור על התהליך ארבע פעמים נוספות. לאחר הכביסה האחרונה, הפוך את הצלחת והקש על נייר סופג כדי להסיר את הנוזלים שנותרו.
  4. הוסף 100 מיקרוליטר מתמיסת נוגדני הזיהוי לכל באר. דגרו את הצלחת על שייקר למשך שעתיים בחום של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: תמיסת נוגדנים לזיהוי ביוטיניל מוכנה בכל ערכות ELISA.
  5. שאפו ושטפו כל באר צלחת חמש פעמים באמצעות 300 מיקרוליטר של מאגר כביסה. לאחר הכביסה האחרונה, הפוך את הצלחת והקש על נייר סופג כדי להסיר את הנוזל שנותר.
  6. הוסף 100 מיקרוליטר של מצומד HRP-Streptavidin לכל באר. יש לדגור במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין.
  7. השליכו את התמיסה על ידי שאיבה עם פיפטה לאחר הדגירה. שטפו כל באר צלחת חמש פעמים באמצעות 300 מיקרוליטר של מאגר כביסה. לאחר הכביסה האחרונה, הפוך את הצלחת והקש על הנייר הסופג כדי להסיר את הנוזל שנותר.
  8. בצע גילוי על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מצע TMB לכל באר. יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחושך.
  9. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת עצירה, כאשר מתפתח צבע, לכל באר. הקש בעדינות על הצלחת כדי להבטיח ערבוב יסודי. קרא מיד ב -450 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

גירוי משולב M5 גרם לתגובה דלקתית של תאי HaCaT.
תאי HaCaT עוררו עם או בלי שילוב ציטוקינים M5 במשך 24 שעות. הוערך ביטוי mRNA של גנים הקשורים לפסוריאזיס, המעורבים בוויסות הכימוקינים החיסוניים והדלקתיים והפפטידים האנטי-מיקרוביאליים. כימוקינים נויטרופילים CXCL138, CXCL239, CXCL840 וכימוקינים של תאי T CCL20 41,42

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מתוארת כאן שיטה המשתמשת בשילוב של חמישה ציטוקינים (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) לקו תאי HaCaT כדי לבסס פרופיל דלקת עורית פסוריאסיפורמית במבחנה ברמת השעתוק. ניתן להתאים פרוטוקול זה למחקר על מנגנון הגנים בפתוגנזה של פסוריאזיס וכן לסינון תרופות טיפוליות לפסוריאזיס. דיווחים אחרונים הראו כי ביטוי יתר של תאי CD8 T המייצרים IL-17A ו-IL22 בעור הנגע מרמז על מעורבותם בפתוגנזה של פסוריאזיס61. IL-1α, IL-22 ו-IL-17A יכולים לגרום לדלקת בעור במודלים של בעלי חיים 62,63,64,65...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לא דווח על ניגוד עניינים פוטנציאלי על ידי המחברים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 ו-81601462]

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEM— Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
סרום בקר עובריGibco10100139C
תאי HaCaTהמרכז הסיני לתרבית סוגאוסףGDC0106פחות מ-15 דורות
IL-1 ובטא אנושיים; ELISA KitBeyotimePI305
Human IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253חלבון רקומביננטי
IL-17 HumanProspecCYT-250חלבון רקומביננטי
IL-22 HumanProspecCYT-328חלבון רקומביננטי
OSM HumanProspecCYT-231חלבון רקומביננטי
PBSGibco10010049pH 7.4
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140163
PrimeScrip RT Reagent KitTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF אלפא אנושיProspecCYT-223חלבון רקומביננטי
TRIzo ReagentInvitrogen15596018
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםGibco25200072

מקורות

  1. Lowes, M. A., Bowcock, A. M., Krueger, J. G. Pathogenesis and therapy of psoriasis. Nature. 445 (7130), 866-873 (2007).
  2. Gupta, R., Debbaneh, M. G., Liao, W. Genetic epidemiology of psoriasis. Current dermatology reports. 3 (1), 61-78 (2014).
  3. Boehncke, W. -H., Schön, M. P. Psoriasis. Lancet. 386 (9997), London, England. 983-994 (2015).
  4. Zaidi, Z., Lanigan, S. W. Dermatology in Clinical Practice. Lanigan, W. S., Zaidi, Z. , Springer. London. 1-15 (2010).
  5. Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: An indispensable barrier. Experimental Dermatology. 17 (12), 1063-1072 (2008).
  6. Van Smeden, J., Janssens, M., Gooris, G., Bouwstra, J. The important role of stratum corneum lipids for the cutaneous barrier function. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (3), 295-313 (2014).
  7. Wolf, R., Orion, E., Ruocco, E., Ruocco, V. Abnormal epidermal barrier in the pathogenesis of psoriasis. Clinics in Dermatology. 30 (3), 323-328 (2012).
  8. Proksch, E., Brasch, J. Abnormal epidermal barrier in the pathogenesis of contact dermatitis. Clinics in Dermatology. 30 (3), 335-344 (2012).
  9. Bäsler, K., Brandner, J. M. Tight junctions in skin inflammation. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 469 (1), 3-14 (2017).
  10. Hoffjan, S., Stemmler, S. On the role of the epidermal differentiation complex in ichthyosis vulgaris, atopic dermatitis and psoriasis. British Journal of Dermatology. 157 (3), 441-449 (2007).
  11. Lowes, M. A., Russell, C. B., Martin, D. A., Towne, J. E., Krueger, J. G. The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses. Trends in Immunology. 34 (4), 174-181 (2013).
  12. Saxena, A., Raychaudhuri, S. K., Raychaudhuri, S. P. Psoriatic Arthritis and Psoriasis. , Springer. 73-82 (2016).
  13. Lowes, M. A., Suárez-Fariñas, M., Krueger, J. G. Immunology of psoriasis. Annual Review of Immunology. 32, 227-255 (2014).
  14. Guilloteau, K., et al. Skin inflammation induced by the synergistic action of IL-17A, IL-22, oncostatin M, IL-1α, and TNF-α recapitulates some features of psoriasis. The Journal of Immunology. 184 (9), 5263-5270 (2010).
  15. Wang, Z., et al. Autophagy-based unconventional secretion of HMGB1 by keratinocytes plays a pivotal role in psoriatic skin inflammation. Autophagy. , 1-24 (2020).
  16. Choi, D. H., Hwang, H. S. Anti-inflammation activity of brazilin in TNF-α induced human psoriasis dermatitis skin model. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 46(2019).
  17. Teng, X., et al. IL-37 ameliorates the inflammatory process in psoriasis by suppressing proinflammatory cytokine production. Journal of Immunology. 192 (4), 1815-1823 (2014).
  18. Wu, S., et al. The potential of Diosgenin in treating psoriasis: Studies from HaCaT keratinocytes and imiquimod-induced murine model. Life Sciences. 241, 117115(2020).
  19. Katarzyna, B., Elwira, S., Marta, M., Joanna, J. -B., Magdalena, G. -C. Models in the Research Process of Psoriasis. International Journal of Molecular Ences. 18 (12), 2514(2017).
  20. Auewarakul, P., Gissmann, L., Cid-Arregui, A. Targeted expression of the E6 and E7 oncogenes of human papillomavirus type 16 in the epidermis of transgenic mice elicits generalized epidermal hyperplasia involving autocrine factors. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8250-8258 (1994).
  21. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Journal of Cell Biology. 106 (3), 761-771 (1988).
  22. Irma, C., et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators of Inflammation. 2017, 7435621(2017).
  23. Melino, G., et al. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Results & Problems in Cell Differentiation. 24 (4), 175(1998).
  24. Thewes, M., Stadler, R., Mischke, B. K. Normal psoriatic epidermis expression of hyperproliferation-associated keratins. Archives of Dermatological Research. , (1991).
  25. Ishida-Yamamoto, A., Senshu, T., Takahashi, H., Akiyama, K., Iizuka, H. Decreased deiminated keratin K1 in psoriatic hyperproliferative epidermis. Journal of investigative Dermatology. 114 (4), 701-705 (2000).
  26. Elango, T., et al. Methotrexate normalized keratinocyte activation cycle by overturning abnormal keratins as well as deregulated inflammatory mediators in psoriatic patients. Clinica Chimica Acta. , 329-337 (2015).
  27. Ghadially, R., Reed, J. T., Elias, P. M. Stratum corneum structure and function correlates with phenotype in psoriasis. Journal of investigative dermatology. 107 (4), 558-564 (1996).
  28. Nithya, S., Radhika, T., Jeddy, N. Loricrin - An overview. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 19 (1), (2015).
  29. Kim, B. E., et al. TNF-α downregulates filaggrin and loricrin through c-Jun N-terminal Kinase: Role for TNF-α antagonists to improve skin barrier. Journal of Allergy & Clinical Immunology. 127 (2), (2011).
  30. Gutowska-Owsiak, D., et al. IL-17 downregulates filaggrin and affects keratinocyte expression of genes associated with cellular adhesion. Experimental dermatology. 21 (2), 104-110 (2012).
  31. Guilloteau, K., et al. Skin inflammation induced by the synergistic action of IL-17A, IL-22, oncostatin M, IL-1α, and TNF-α recapitulates some features of psoriasis. Journal of Immunology. 184 (9), 5263-5270 (2010).
  32. Jeon, B., et al. Optimization and validation of a method to identify skin sensitization hazards using IL-1 α and IL-6 secretion from HaCaT. Toxicology In Vitro : An International Journal Published in Association with BIBRA. 61, 104589(2019).
  33. Lee, K. -M., Kang, J. H., Yun, M., Lee, S. -B. Quercetin inhibits the poly(dA:dT)-induced secretion of IL-18 via down-regulation of the expressions of AIM2 and pro-caspase-1 by inhibiting the JAK2/STAT1 pathway in IFN-γ-primed human keratinocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 116-122 (2018).
  34. Lee, N., Chung, Y. C., Kang, C. I., Park, S. -M., Hyun, C. -G. 7,8-dimethoxycoumarin attenuates the expression of IL-6, IL-8, and CCL2/MCP-1 in TNF-α-treated HaCaT cells by potentially targeting the NF-κB and MAPK pathways. Cosmetics. 6 (3), (2019).
  35. Smolińska, E., Moskot, M., Jakóbkiewicz-Banecka, J., Wgrzyn, G., Gabig-Cimińska, M. Molecular action of isoflavone genistein in the human epithelial cell line HaCaT. PLoS One. 13 (2), 0192297(2018).
  36. Ying, X., Yan, Y., Li, Y. Tripterine alleviates LPS-induced inflammatory injury by up-regulation of miR-146a in HaCaT cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 105, 798(2018).
  37. Zhang, M., et al. AIM2 inflammasome mediates Arsenic-induced secretion of IL-1 β and IL-18. Oncoimmunology. 5 (6), 1160182(2016).
  38. Lowes, M. A., et al. Immunology of Psoriasis. Annual Review of Immunology. 32, 227-255 (2014).
  39. Nedoszytko, B., Wojdyło, M. S., Dziurdzińska, K. -S., Roszkiewicz, J., Nowicki, R. J. Chemokines and cytokines network in the pathogenesis of the inflammatory skin diseases: atopic dermatitis, psoriasis and skin mastocytosis. Postepy Dermatologii i Alergologii. 31, 84-91 (2014).
  40. Glowacka, E., Lewkowicz, P., Rotsztejn, H., Zalewska, A. IL-8, IL-12 and IL-10 cytokines generation by neutrophils, fibroblasts and neutrophils- fibroblasts interaction in psoriasis. Advances in Medical Sciences. 55 (2), 254-260 (2010).
  41. Li, H., et al. Cyr61/CCN1 induces CCL20 production by keratinocyte via activating p38 and JNK/AP-1 pathway in psoriasis. Journal of Dermatological Science. 88 (1), 46-56 (2017).
  42. Kim, T. G., et al. Dermal clusters of mature dendritic cells and T cells are associated with the CCL20/CCR6 chemokine system in chronic psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 134 (5), 1462-1465 (2014).
  43. Kolbinger, F., et al. β-Defensin 2 is a responsive biomarker of IL-17A-driven skin pathology in patients with psoriasis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), (2017).
  44. Ekman, A., Vegfors, J., Eding, C., Enerbäck, C. Overexpression of psoriasin (S100A7) contributes to dysregulated differentiation in psoriasis. Acta Dermato-Venereologica. 97 (4), 441-448 (2016).
  45. Peric, M., et al. Vitamin D analog calcipotriol suppresses the Th17 cytokine-induced proinflammatory S100 "Alarmins" psoriasin (S100A7) and Koebnerisin (S100A15) in psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 132 (5), 1416-1424 (2012).
  46. Aochi, S., et al. Markedly elevated serum levels of calcium-binding S100A8/A9 proteins in psoriatic arthritis are due to activated monocytes/macrophages. Journal of the American Academy of Dermatology. 64 (5), 879-887 (2011).
  47. Krueger, J. G., et al. IL-17A is essential for cell activation and inflammatory gene circuits in subjects with psoriasis. Journal of Allergy Clinical Immunology. 130 (1), 145-154 (2012).
  48. Wilsmann-Theis, D., et al. Among the S100 proteins, S100A12 is the most significant marker for psoriasis disease activity. Journal of the European Academy of Dermatology & Venereology. 30 (7), 1165-1170 (2016).
  49. Wang, Z., et al. Systematic screening and identification of novel psoriasis-specific genes from the transcriptome of psoriasis-like keratinocytes. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1529-1542 (2018).
  50. Mizutani, H., Ohmoto, Y., Mizutani, T., Murata, M., Shimizu, M. Role of increased production of monocytes TNF-alpha, IL-1beta and IL-6 in psoriasis: relation to focal infection, disease activity and responses to treatments. Journal of dermatological science. 14 (2), 145-153 (1997).
  51. Pietrzak, A., Lecewicz-Torun, B., Chodorowska, G., Rolinski, J. Interleukin-18 levels in the plasma of psoriatic patients correlate with the extent of skin lesions and the PASI score. Acta Dermato-Venereologica. 83 (4), 262-265 (2003).
  52. Cai, Y., et al. A critical role of the IL-1β-IL-1R signaling pathway in skin inflammation and psoriasis pathogenesis. Journal of investigative Dermatology. 139 (1), 146-156 (2018).
  53. Arican, O., Aral, M., Sasmaz, S., Ciragil, P. Serum levels of TNF-α, IFN-γ IL-6, IL-8,IL-12, IL-17, and IL-18 in patients with active psoriasis and correlation with disease severity. Mediators of Inflammation. 2005 (5), 273-279 (2005).
  54. Grossman, R. M., et al. Interleukin 6 is expressed in high levels in psoriatic skin and stimulates proliferation of cultured human keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6367-6371 (1989).
  55. Nair, R. P., et al. Genome-wide scan reveals association of psoriasis with IL-23 and NF-kappaB pathways. Nature Genetics. 41 (2), 199-204 (2009).
  56. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. The Journal of Cell Biology. 106 (3), 761-771 (1988).
  57. Deyrieux, A. F., Wilson, V. G. In vitro culture conditions to study keratinocyte differentiation using the HaCaT cell line. Cytotechnology. 54 (2), 77-83 (2007).
  58. Micallef, L., et al. Effects of extracellular calcium on the growth-differentiation switch in immortalized keratinocyte HaCaT cells compared with normal human keratinocytes. Experimental Dermatology. 18 (2), 143-151 (2009).
  59. Wilson, V. G. Epidermal Cells. , Springer. 33-41 (2013).
  60. Ding, J., et al. Gene expression in skin and lymphoblastoid cells: Refined statistical method reveals extensive overlap in cis-eQTL signals. American Journal of Human Genetics. 87 (6), 779-789 (2010).
  61. Res, P. C., et al. Overrepresentation of IL-17A and IL-22 producing CD8 T cells in lesional skin suggests their involvement in the pathogenesis of psoriasis. PLoS One. 5 (11), (2010).
  62. Groves, R. W., Mizutani, H., Kieffer, J. D., Kupper, T. S. Inflammatory skin disease in transgenic mice that express high levels of interleukin 1 alpha in basal epidermis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (25), 11874-11878 (1995).
  63. Chan, J. R., et al. IL-23 stimulates epidermal hyperplasia via TNF and IL-20R2-dependent mechanisms with implications for psoriasis pathogenesis. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2577-2587 (2006).
  64. Zheng, Y., et al. Interleukin-22, a TH 17 cytokine, mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis. Nature. 445 (7128), 648-651 (2007).
  65. Ma, H. -L., et al. IL-22 is required for Th17 cell-mediated pathology in a mouse model of psoriasis-like skin inflammation. The Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 597-607 (2008).
  66. Lowes, M. A., Russell, C. B., Martin, D. A., Towne, J. E., Krueger, J. G. The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses. Trends Immunol. 34 (4), 174-181 (2013).
  67. Banno, T., Gazel, A., Blumenberg, M. Effects of tumor necrosis factor-α (TNFα) in epidermal keratinocytes revealed using global transcriptional profiling. Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32633-32642 (2004).
  68. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  69. Boniface, K., et al. Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. The Journal of Immunology. 178 (7), 4615-4622 (2007).
  70. Terui, T. Role of neutrophils in induction of acute inflammation in T-cell-mediated immune dermatosis, psoriasis: A neutrophil-associated inflammation-boosting loop. Experimental Dermatology. 9, (2000).
  71. Chiang, C. -C., Cheng, W. -J., Korinek, M., Lin, C. -Y., Hwang, T. -L. Neutrophils in psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 2376(2019).
  72. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. The Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 105-113 (2012).
  73. Morizane, S., Gallo, R. L. Antimicrobial peptides in the pathogenesis of psoriasis. The Journal of Dermatology. 39 (3), 225-230 (2012).
  74. Vandal, K., et al. Blockade of S100A8 and S100A9 suppresses neutrophil migration in response to lipopolysaccharide. The Journal of Immunology. 171 (5), 2602-2609 (2003).
  75. Ryckman, C., Vandal, K., Rouleau, P., Talbot, M., Tessier, P. A. Proinflammatory activities of S100: proteins S100A8, S100A9, and S100A8/A9 induce neutrophil chemotaxis and adhesion. The Journal of Immunology. 170 (6), 3233-3242 (2003).
  76. Nukui, T., et al. S100A8/A9, a key mediator for positive feedback growth stimulation of normal human keratinocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 104 (2), 453-464 (2008).
  77. Yang, D., et al. β-defensins: linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6. Science. 286 (5439), 525-528 (1999).
  78. Hsu, K., et al. Anti-infective protective properties of S100 calgranulins. Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents). 8 (4), 290-305 (2009).
  79. Nestle, F. O., Kaplan, D. H., Barker, J. Psoriasis. The New England journal of medicine. 361 (5), 496-509 (2009).
  80. Tsoi, L. C., et al. Identification of 15 new psoriasis susceptibility loci highlights the role of innate immunity. Nature Genetics. 44 (12), 1341(2012).
  81. Swindell, W. R., et al. RNA-seq identifies a diminished differentiation gene signature in primary monolayer keratinocytes grown from lesional and uninvolved psoriatic skin. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  82. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 328-340 (2005).
  83. Frost, P., Weinstein, G. D., Van Scott, E. J. The ichthyosiform dermatoses II. Journal of Investigative Dermatology. 47, 561-567 (1966).
  84. Reichelt, J., Furstenberger, G., Magin, T. M. Loss of keratin 10 leads to mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation, increased keratinocyte turnover, and decreased tumor formation in mice. Journal of Investigative Dermatology. 123 (5), 973-981 (2004).
  85. Hu, Z., et al. Loss-of-function mutations in filaggrin gene associate with psoriasis vulgaris in Chinese population. Human Genetics. 131 (7), 1269-1274 (2012).
  86. Giardina, E., et al. Characterization of the loricrin (LOR) gene as a positional candidate for the PSORS4 psoriasis susceptibility locus. Annals of Human Genetics. 68 (6), 639-645 (2004).
  87. Suga, H., et al. Skin barrier dysfunction and low antimicrobial peptide expression in cutaneous T-cell lymphoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4339-4348 (2014).
  88. Iotzova-Weiss, G., et al. S100A8/A9 stimulates keratinocyte proliferation in the development of squamous cell carcinoma of the skin via the receptor for advanced glycation-end products. PLoS One. 10 (3), (2015).
  89. Seo, M. -D., Kang, T. J., Lee, C. H., Lee, A. -Y., Noh, M. HaCaT keratinocytes and primary epidermal keratinocytes have different transcriptional profiles of cornified envelope-associated genes to T helper cell cytokines. Biomolecules & Therapeutics. 20 (2), 171-176 (2012).
  90. Soboleva, A. G., et al. Genetically predetermined limitation in the use of HaCaT cells that affects their ability to serve as an experimental model of psoriasis. Genetika. 50 (10), 1222-1231 (2014).
  91. Wang, Z., et al. Systematic screening and identification of novel psoriasis-specific genes from the transcriptome of psoriasis-like keratinocytes. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1529-1542 (2019).
  92. Inoue, K., et al. Mechanism underlying ATP release in human epidermal keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (5), 1465-1468 (2014).
  93. Harden, J. L., et al. CARD14 expression in dermal endothelial cells in psoriasis. PLoS One. 9 (11), 111255(2014).
  94. Krueger, J. G., et al. IL-17A is essential for cell activation and inflammatory gene circuits in subjects with psoriasis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (1), (2012).
  95. Hegyi, Z., et al. Vitamin D analog calcipotriol suppresses the Th17 cytokine-induced proinflammatory S100 "alarmins" psoriasin (S100A7) and koebnerisin (S100A15) in psoriasis. The Journal of Investigative Dermatology. 132 (5), 1416-1424 (2012).
  96. Schonthaler, H. B., et al. S100A8-S100A9 protein complex mediates psoriasis by regulating the expression of complement factor C3. Immunity. 39 (6), 1171-1181 (2013).
  97. Wilsmann-Theis, D., et al. Among the S100 proteins, S100A12 is the most significant marker for psoriasis disease activity. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology : JEADV. 30 (7), 1165-1170 (2016).
  98. Leuner, K., et al. Reduced TRPC channel expression in psoriatic keratinocytes is associated with impaired differentiation and enhanced proliferation. PLoS One. 6 (2), 14716(2011).
  99. Gao, L., et al. Ozone therapy promotes the differentiation of basal keratinocytes via increasing Tp63-mediated transcription of KRT10 to improve psoriasis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (8), 4819-4829 (2020).
  100. Kim, B. E., et al. TNF-α downregulates filaggrin and loricrin through c-Jun N-terminal kinase: role for TNF-α antagonists to improve skin barrier. The Journal of Investigative Dermatology. 131 (6), 1272-1279 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

In Vitro
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.