כאן, אנו מתארים שיטה מדויקת לאיסוף לימפוציטים צינור בית החזה והתבוננות בהגירה של לימפוציטים טרופיים במדבקות של עכברוש פייר במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות. טכניקה זו יכולה להבהיר כיצד הדינמיקה של לימפוציטים מושפעים בתנאים דלקתיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תצפית מיקרוסקופית של לימפוציטים דינמיקה במדבקות של עכברוש פייר
במאמר זה
סיכום
תקציר
לימפוציטים נאיביים recirculate מהדם לרקמות הלימפה במצב פיזיולוגי והוא מוכר בדרך כלל כתופעה חשובה בחסינות המעיים. הסטרומה של איברי הלימפה המשניים, כגון טלאים של פייר (PPs) או בלוטות לימפה mesenteric, הם המקום שבו לימפוציטים נאיביים חשים אנטיגנים. לימפוציטים נאיביים מסתובבים במחזור הדם כדי להגיע לצללים אנדותל גבוהים, שער הכניסה ל- PPs. כמה immunomodulators מוערך להשפיע על נדידת לימפוציטים, אבל הערכה מדויקת של דינמיקה microcirculation קשה מאוד, וקביעת שיטה להתבונן נדידת לימפוציטים vivo יכול לתרום בירור המנגנונים המדויקים. אנחנו מעודן השיטה של איסוף לימפוציטים מן צינור הלימפה והתבוננות הדינמיקה המפורטת של לימפוציטים tropic הבטן ב PPs חולדה. בחרנו מיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית כדי לצפות PPs חולדה vivo והקלטנו אותו באמצעות צילום זמן לשגות. עכשיו אנחנו יכולים להשיג תמונות ברורות שיכולות לתרום לניתוח של דינמיקה לימפוציטים.
מבוא
הטלאים של פייר (PPs) מורכבים ממאות זקיקי לימפואידים בפרופוריה למינה של המעי הדק. PPs מחולקים זקיקים, האזור interfollicular, ומרכזים נביטה הממוקמים בחלק התחתון של הזקיקים, שם לימפוציטים מגורים על ידי מצגת אנטיגן. אין כלי לימפה afferent, ואת האנטיגנים לפלוש פרופריה למינה מן לומן המעי דרך שכבת תא אפיתל. אזור האפיתל המכסה זקיקי הלימפה נקרא אפיתל הקשורים זקיק, שבתוכו תאי M משולבים מיוחדים ספיגת אנטיגנים ריר. תאי M לוקחים אנטיגנים מהצד הזוהר ואנטיגנים נלכדים לאחר מכן על ידי תאים דנדריטיים ומוצגים לכיוון לימפוציטים נאיביים הזורמים לתוך PPs דרך האנדותל של venules אנדותל גבוה (HEVs)1. PPs לשחק תפקיד חשוב חסינות מעיים קשורים עם השלב המוקדם של דלקת. אינטראקציות מולקולריות רבות כרוכות בכניסה של לימפוציטים לאיברים לימפואידיים משניים (SLOs), כולל מולקולות הידבקות, כימוקינים2,3, ו sphingosine-1-פוספט4; לכן, ישנם מטרות טיפוליות צפויות רבות. לכן, התבוננות בדינמיקה לימפוציטים בתוך PPs מאפשר לנו להציץ בשלב מוקדם מאוד של דלקת ולבחון את התועלת של כמה תרופות מבטיחות.
השיטה כאן מתמקדת בהגירה של לימפוציטים ב PPs, הכולל מספר הליכים (קנולציה לתוך צינור בית החזה5 ואיסוף לימפוציטים ותצפית לטווח ארוך לאחר ההזרקה לתוך לימפוציטים שנאספו). מכיוון שהליכים אלה מורכבים והיה קשה לראות בדיוק כיצד כל הליך בוצע בדוחות קודמים, הזכרנו כאן כמה טיפים להשגת התבוננות מוצלחת. לדוגמה, התבוללות של הצינורות לתוך צינור בית החזה היה קשה מאוד, ואת שיעור ההצלחה הראשונית של קנול היה פחות מ 50%. עם זאת, שיפרנו את השיטה והשגנו שיעור הצלחה העולה על 80%. הזכרנו כמה טיפים אחרים בכתב יד זה הדרושים לתצפית המוצלחת כדי לאפשר הערכה כמותית של הגירה טרנסנדותלאלית של לימפוציטים במספר תנאים.
בדיווחים קודמים, היה קשה להבין את השינויים התלת מימדיים לאורך זמן, כגון הזרקה תוך ורידי של דיו הודו כדי להכתים את מבנה כלי הדם של PPs6, או מיקרוסקופ להיות מונופוקלי7. בשנים האחרונות, שיטה תצפיתית באמצעות כמה בעלי חיים מהונדסים חלבון פלואורסצנטי פוטו-מונברט כגון עכברי קדה הבהירו תנועות תאיות שיטתיות ב vivo8. המחקר השני הבהיר CD69 כיבוי עצמאי של יציאת לימפוציטים מ PPs9. השתמשנו במיקרוסקופיית סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) בגלל היכולת האנליטית הגבוהה שלה. עכשיו אנחנו יכולים בקלות להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה ולהשתמש בהם כדי לנתח את הדינמיקה לימפוציטים.
בדו"ח זה, הדגמנו סדרה של שיטות להערכת נדידת לימפוציטים ב- PPs. ראשית, הראינו שיטות מעודנות של קנול צינור בית החזה כדי לאסוף לימפוציטים. שנית, שיפרנו את שיטות התצפית במספר דרכים לשמירה על איברים אובייקטיביים במידת האפשר תחת השגחה מיקרוסקופית, המאפשרת לנו להשיג תמונות באיכות גבוהה במשך 3 שעות. שלישית, כימתנו את התנועות התאיות של נדידת לימפוציטים כדי להעריך את ההשפעות של תרופות מסוימות. פרוטוקולים מותאמים אלה יתרמו לפיתוח הערכות אימונולוגיה ריר.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול הניסוי אושר על ידי הוועדה לחקר בעלי חיים של המכללה הלאומית לביטחון רפואי (מס' 16058). בעלי החיים נשמרו על צ'או מעבדה סטנדרטי (CLEA יפן Inc, טוקיו, יפן). חיות המעבדה טופלו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות.
1. איסוף והפרדה של לימפוציטים
הערה: מאז לימפוציטים חייב להיות טרי ולא ניתן לאחסן, הם חייבים להיאסף מעכברושים עבור כל ניסוי. בנוסף, לימפוציטים במעיים טרופיים חייבים להיאסף ישירות מן צינור בית החזה שבו הם מסתובבים. כל ההליכים צפויים להסתיים בתוך 6 שעות, וכל המכשירים, הכפפות והמשטחים נקיים. על מנת לשמור על בעלי החיים במצב יציב מבחינה פיזיולוגית, כל מלוחים ונוזלים אחרים המשמשים בניסוי צריך להישמר חם.
- יוצרים צינור קנולציה (בקוטר 1 מ"מ) כמו עקומת הפרין (רדיוס של כ-5 מ"מ) לאחר טבילתו במים חמים (כ-80-90 מעלות צלזיוס) וממקמים אותו ללוח פלסטיק באמצעות סרט הדבקה לכמה שעות מראש.
- הרדמה עכברוש Wistar זכר (8-12 שבועות) עם הזרקה תוך-אישית של תערובת של Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg) ו Betulphar (2.5mg/kg) לחתוך את שיער הגוף של הבטן באמצעות קוצץ שיער. הסר את השיער בחוזקה לאחר הגילוח, כך השיער לא נכנס לחלל הבטן.
- לאחר אישור כי עומק יציב של הרדמה הנדרש עבור ההליך מתקבל על ידי קמצוץ בוהן, לבצע חתך עם מספריים כירורגיים אופקית מקו האמצע לאזור subcostal שמאל. היזהר לא לפגוע בכלי הדם בצפק הקודקודי על ידי צפייה בכלי הדם תחת אור.
- לעטוף את הבטן עם גזה רטובה ולהעביר את הבטן בעדינות ימינה מחוץ לגוף כדי לחשוף את האיברים retroperitoneal. הכנס חריץ בין שרירי הזקפה של עמוד השדרה לבין רקמת השומן באמצעות מספריים כירורגיים ולהפריד אותם בבוטות עם האצבעות.
- בזהירות להסיר את רקמת החיבור סביב צינור בית החזה. רקמת החיבור העודפת עולה עם הגיל. לחשוף את צינור בית החזה ממש מתחת לצלב השמאלי של הסרעפת caudally עד אורך 20 מ"מ של צינור בית החזה היה גלוי. הפרד בעדינות הידבקויות בין צינור בית החזה לבין אב העורקים באמצעות פינצטה מדויקת או ספוגיות כותנה רטובות.
- בצע תהליך זה בזהירות כי כמה חולדות יש arterioles הסתעפות מן עורק הבטן חוצה מעל צינור בית החזה או צינור בית החזה קצר בשל מיקום גבוה יותר של מקלעת הלימפה (צינורות בית החזה קטן מתפשט כמו קורי עכביש). הימנע ממגע מיותר לצינור בית החזה כדי למנוע גרימת בצקת.
- החל קשירה על ידי מחרוזת (3-0 משי) על צינור בית החזה ממש מתחת לצלב השמאלי של הסרעפת. צינור בית החזה הקאודלי מתרוקן.
- לעשות חור (קוטר 5 מ"מ) בקיר הבטן על ידי דקירת חוד החנית של מספריים כירורגיים, לעבור את צינור הקנול מעוקל סיכת ראש, ו ligate הצינור על שריר iliopsoas בשלב מסוים. ממלאים את צינור הקנולציה בתמיסת מלח רגילה המכילה הפרין 10 U/mL.
- לאחר הנחת מחרוזת (3-0 משי) מתחת לצינור בית החזה המנופח, דקרו את צינור בית החזה עם הקצה החתוך בחדות של צינור קנולציה, קנול אותו לכיוון הזנב כ -5 מ"מ, ו ligate צינור בית החזה עם צינור קנולציה עבור קיבוע.
- כדי לספק מלוחים למניעת התייבשות, ליצור חור (קוטר 3 מ"מ) על הקיר האצילי של antrum של הבטן באמצעות פינצטה מדויקת ולהעביר את צינור הסיליקון (2 מ"מ קוטר) לתריסריון דרך הטבעת pyloric. לאחר תפירת פצע ותחזוקת בעלי החיים בכלובים של בולמן, מתחילים להחדיר מלוחים עמוסי סוכר לתריסריון של כל חולדה מצינור הסיליקון בקצב זרימה של 3 מ"ל / שעה. מכסים את הכלוב כולו במגבת נייר כדי לחמם אותו.
- תקן את צינור הקנולציה לחור במרכז המכסה של צינור חרוט 50 מ"ל על קרח המכיל 6 U / mL הפרין, 10% סרום שור עוברי, ו RPMI 1640 בינוני (pH 7.4; ראה את שולחן החומרים), ולאסוף לימפוציטים צינור בית החזה (TDLs) על קרח. היזהר לא ליצור קשר עם קצה הצינור לקיר הצינור החרוטי כדי למנוע חסימה צינור קנולד עקב היווצרות קריש פיברין בתוך הצינור. נוזל הלימפה (כ 20 מ"ל) כולל כ 1.0 x 108~10 9 לימפוציטים ניתן להשיג ב 6 שעות. כדי להשיג את הלימפוציטים תחת הרדמה מלאה, מישור ההרדמה מנוטר וזרימת הלימפה נצפית כראוי. אותו הרדמה מתווספים באותה מנה כ -3 שעות לאחר חולדות מכניסים לכלוב של בלמן כדי לקבל הרדמה עמוקה ברציפות במשך 6 שעות.
2. לימפוציטים תיוג עם קרבוקסיפלואורסצין דיאצטט succinimidyl אסתר (CFDSE)
- להמיס CFDSE (שולחן החומרים) ב דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ל 15.6 מ"מ (500 מיקרוגרם של CFDSE מומס ב 60 μL של DMSO).
- לימפוציטים דגירה (1 x 108~ 109) ב 50 מ"ל של RPMI 1640 עם 50 μL של פתרון CFDSE במשך 30 דקות ב 37 °C (60 °F) כפי שתואר קודם לכן10.
3. התקנה ניסיונית למחקרים מיקרו-וסקולריים
- הרדמה חולדות המטופל (8-12 שבועות) עם הזרקה תוך-אישית של תערובת של Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg), ו Betulphar (2.5mg/kg) ולאשר את עומק ההרדמה על ידי קמצוץ בוהן. הרטב את הבטן לפני טיפוח הפרווה כדי למזער את זיהום השיער. ואז לפתוח את הבטן של החולדה וסטר המטופל באמצעות חתך קו האמצע.
- שים חולדה על צלחת נירוסטה ניידת (כ 120 x 300 מ"מ) עם חור מלבן סביב המרכז מכוסה שקופית זכוכית (24 x 50 מ"מ). בחר כ 10 ס"מ של קטע ileal כולל PPs לתצפית.
- שמור על המעי חם ככל האפשר ולח עם מלוחים אגירה פוספט (PBS) מחומם ל 37 מעלות צלזיוס. להשרות גזה המשמשת לכיסוי המעי הדק עם PBS.
- תוך מתן הרדמה רציפה עם 2 % איזופלורן (ראה טבלה של חומרים), לשים את השקופית על הבמה של המיקרוסקופ ולבחור אזורים מתאימים לתצפית של microcirculation ב PPs שבו כמה HEVs פועלים דרך serosa. PPs טווח בגודל; גדולים יותר מתאימים לתצפית על המיקרו-סירקולציה באמצעות CLSM. המעי הדק אינו ישר במקומות; קטע ישר באורך של לפחות 2 ס"מ ללא כל מתח מתאים לתצפית.
- מכסים את קטע המעיים הסמוך ואת mesentery עם כותנה סופג ספוג PBS. מניחים את קטע המעי בין שני כדורי כותנה מגולגלים וממקמים אותו ככל האפשר מגופו של החולדה כדי למנוע ממנו להיות רטט על ידי פעימות הלב של החולדה ונשימה.
- באמצעות מזרק 1 מ"ל, להזריק לאט (מעל 1 דקות) CFSE שכותרתו TDLs (1 x 108 תאים) לתוך הווריד הצווארי של חולדות הנמען. זריקה תוך ורידי מהירה עשויה להשפיע על זרימת הדם המערכתית.
4. מיקרו-סירקולציה של לימפוציטים
- ניטור רציף TDLs microvasculature של PPs באמצעות CLSM ולהקליט במחשב במשך 3 שעות באמצעות צילום זמן לשגות במרווחי זמן של 30 s. העומק מהסרוסה ל- HEV של PPs הוא כ -25 מיקרומטר, המאפשר תצפית של סטרומה וכלי לימפה נימי לעומק של 30 מיקרומטר.
- הזרק טקסס אדום-dextran (25 מ"ג / קילוגרם) לתוך הווריד הצווארי של כל חולדה המטופל להכתים את זרם הדם Hoechest 33342 (5 מ"ג / קילוגרם) כדי להכתים את גרעיני התא.
- (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' כדי לכמת את הדינמיקה לימפוציטים, להגדיר לימפוציטים דבקים HEVs יותר מ 30 שניות כמו "לימפוציטים דבק" ולימפוציטים מהגרים מ HEVs כדי סטרומה כמו "'לימפוציטים נודדים". לאחר מכן לחשב את האחוז הממוצע של הגירה (לימפוציטים נודדים / לימפוציטים דבק + לימפוציטים נודדים) לכל שדה ראייה (כ 0.3 מ"מ2).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איסוף לימפוציטים מהלימפה
כדי להכין את החולדה לתעלת בית החזה, בצעו חתך בצינור בית החזה המתוח כפי שמוצג באיור 1 ולאחר מכן שמרו את החולדה בכלוב בולמן כפי שמוצג באיור 2.
כאשר לימפוציטים נאספים היטב, אנחנו יכולים להשיג על 20 מ"ל / 6 h נוזל הלימפה המכיל כ 107~ 108/ mL לימפוציטים. מתוך TDLs, 70% אקספרס CD4, ביניהם כ 90% תאים להביע CD62L, כלומר הרכב העיקרי של TDLs (>60%) מורכב לימפוציטים נאיביים במ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן תיארנו פרוטוקול לאיסוף לימפוציטים נאיביים במעיים ולהתבוננות בנדידתם בחולדות PPs. הליכים אלה יכולים לחשוף כיצד לימפוציטים לנוע microvasculature של PPs ומאפשרים להשוות חזותית את הדינמיקה שלהם תחת מצב נורמלי או תרופות. התצפית הישירה של דינמיקה זו יש הרבה ערך כדי לקבל רמז לשינוי חיסוני על ידי תרופות מסוימות, אם כי תקופת התצפית מוגבלת רק כמה שעות.
הזכרנו כמה טיפים בשיטות. ביניהם, אחד ההליכים העדינים ביותר הוא כי המפעיל חייב cannulate צינור בית החזה במהירות ובדיוק. אם ניתוח לוקח זמן רב כרוך נזק ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכללה הלאומית לביטחון רפואי ועל ידי מענק מחקר במדעי הבריאות והעבודה למחקר על מחלות עקשניות ממשרד הבריאות, העבודה והרווחה, יפן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| A1R+ | Nikon | Comfocal לייזר סריקת מיקרוסקופיה | |
| Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Isoflurane | Wako Pure Chemical Industries | 099-06571 | |
| RPMI 1640 בינוני | GIBCO | 11875093 | |
| טקסס רד– דקסטרן | תרמו פישר סיינטיפיק | D1863 |
מקורות
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
