מאמר שיטה

בניית מוטנטים בסרוטיפ 1 סטרפטוקוקוס דלקת ריאות זן 519/43

DOI:

10.3791/61594

⸱

11 בספטמבר 2020

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Infections and Tropical Diseases, Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Division of Medicine, University College London, 3Division of Infection and Immunity, University College London UCL

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים זן סרוטיפ 1 של S. pneumoniae serotype 1 519/43 שניתן להנדס גנטית באמצעות יכולתו לרכוש באופן טבעי DNA ופלסמיד מתאבד. כהוכחה עקרונית נוצרה מוטציה איזוגנית בגן הפנאומוליזין (ply).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streptococcus pneumoniae serotype 1 נותר בעיה עצומה במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית, במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה. למרות חשיבותו, מחקרים בסרוטיפ זה עוכבו על ידי היעדר כלים גנטיים כדי לשנות אותו. במחקר זה אנו מתארים שיטה לשינוי גנטי של איזולט קליני של סרוטיפ 1 (זן 519/43). באופן מעניין, זה הושג על ידי ניצול יכולתו של הפנאומוקוק לרכוש דנ"א באופן טבעי. עם זאת, בניגוד לרוב הפנאומוקוקים, השימוש בדנ"א ליניארי לא היה מוצלח; כדי לשנות את הזן החשוב הזה, היה צורך להשתמש בפלסמיד מתאבד. מתודולוגיה זו סיפקה את האמצעים להבנה עמוקה יותר של סרוטיפ חמקמק זה, הן מבחינת הביולוגיה והן מבחינת הפתוגנים שלו. כדי לאמת את השיטה, הרעלן העיקרי הידוע של פנאומוקוק, פנאומוליזין, עבר מוטציה מכיוון שיש לו פנוטיפ ידוע וקל למעקב. הראינו שהמוטציה, כצפוי, איבדה את יכולתה ללדת תאי דם אדומים. על ידי היכולת לבצע מוטציה בגן חשוב בסרוטיפ המעניין, הצלחנו לצפות בפנוטיפים שונים לאובדן מוטציות תפקודיות בזיהומים תוך צפקיים ותוך אפיים מאלה שנצפו עבור סרוטיפים אחרים. לסיכום, מחקר זה מוכיח כי זן 519/43 (סרוטיפ 1) יכול להיות מהונדס גנטית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סטרפטוקוקוס דלקת ריאות (S. pneumoniae, הפנאומוקוקוס) הוא אחד הגורמים העיקריים לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם. עד לאחרונה התגלו קרוב ל-100 סרוטיפים של S. pneumoniae 1,2,3,4,5,6,7. מדי שנה, מחלת פנאומוקוק פולשנית (IPD) טוענת לכ -700,000 מקרי מוות, של ילדים מתחת לגיל5 שנים 8. S. pneumoniae הוא הגורם העיקרי לדלקת ריאות חיידקית, דלקת אוזניים, דלקת קרום המוח ואלח דם ברחבי העולם9.

בחגורת דלקת קרום המוח האפריקאית, סרוטיפ 1 אחראי להתפרצויות דלקת קרום המוח, כאשר סוג הרצף (ST) ST217, סוג רצף אלים ביותר, דומיננטי 10,11,12,13,14,15. חשיבותו בפתולוגיה של דלקת קרום המוח הושוותה לזו של Neisseria meningitidis בחגורת דלקת קרום המוח האפריקאית16. סרוטיפ 1 הוא לעתים קרובות הגורם העיקרי ל- IPD; עם זאת, הוא נמצא לעתים רחוקות מאוד בכרכרה. למעשה, בגמביה, סרוטיפ זה אחראי ל -20% מכלל המחלות הפולשניות, אך הוא נמצא רק ב -0.5% מהנשאים הבריאים 14,17,18,19. החלפה גנטית ורקומבינציה בפנאומוקוקים מוסמכים מתרחשת בדרך כלל בהובלה ולא במחלה פולשנית20. יתר על כן, סרוטיפ 1 הוכח כאחד משיעורי ההובלה הקצרים ביותר המתוארים בקרב פנאומוקוקים (9 ימים בלבד). לכן, הוצע כי סרוטיפ זה עשוי להיות בעל שיעור רקומבינציה נמוך בהרבה מאחרים21.

יש צורך במחקרי עומק כדי להבין את הסיבה לשיעור ההובלה הנמוך של זני סרוטיפ 1 ואת חשיבותו במחלות פולשניות באפריקה שמדרום לסהרה.

כאן אנו מדווחים על פרוטוקול המאפשר מוטגנזה כלל-גנומית של זן סרוטיפ 1 מסוים, 519/43. זן זה יכול בקלות לרכוש ולשלב מחדש דנ"א חדש בגנום שלו. שיטה זו עדיין אינה בין-זנית, אך היא יעילה מאוד כאשר היא נעשית ברקע 519/43 (מטרות אחרות עברו מוטציה, כתבי יד בהכנה). פשוט על ידי שימוש בזן 519/43, וניצול היכולת הטבעית שלו, כמו גם החלפת האופן שבו הדנ"א האקסוגני מסופק, הצלחנו לשנות את הגן pneumolysin (ply) בזן סרוטיפ 1 זה. שיטה זו מייצגת שיפור מזה שהוצג על ידי Harvey et al.22 כפי שהוא נעשה בשלב אחד ללא צורך להעביר את הדנ"א דרך סרוטיפ אחר. עם זאת, ובשל השונות בין הזנים, אף שיטה לא תוקנה לכל הזנים. היכולת לבצע מוטציה בגנים ספציפיים ולצפות בהשפעותיהם תאפשר הבנה מעמיקה של זני סרוטיפ 1 S. pneumoniae ותספק תשובות לתפקידם של זנים אלה בדלקת קרום המוח באפריקה שמדרום לסהרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יצירת אמפליקון מוטציה על ידי SOE-PCR23 והגברה של קלטת ספקטינומיצין

  1. התחל בביצוע PCR להגברה של זרועות ההומולוגיה (ply 5' (488 bp) ו- ply3' (715 bp) בהתאמה) של אזורי האיגוף של גן הרובד מזן 519/43. השתמש פריימרים plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGCCGGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTGGATCC GCGTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTC) ו- plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTACCTTATCCTCTACC).
  2. השתמש בתנאי ה-PCR הבאים עבור ply5': דנטורציה ב-94°C למשך 60 שניות, שלב 2: דנטורציה ב-94°C למשך 30 שניות, שלב 3: חישול ב-58°C למשך 30 שניות, שלב 4: הארכה ב-72°C למשך 30 שניות, שלב 5: חזור לשלב 2 וחזור על הפעולה במשך 35 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב-72°C למשך 30 שניות.
    1. השתמש באותם תנאי PCR עבור ply3' למעט זמן ההארכה בשלב 4 ושלב 6 שבו הוא אמור להיות 60 שניות.
  3. לנתח את מוצרי PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל הבלו את אמפליקון מן הג'ל.
  4. לטהר את אמפליקוני ה-PCR בהתאם לפרוטוקול המתואר בהוראות היצרן (טבלת חומרים).
  5. השתמש בכמויות שוות ערך של שתי זרועות ההומולוגיה כתבניות ב- SOE-PCR. התיך את שני האמפליקונים באמצעות פריימרים plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ו- plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTTTACCTTATCCTCTACC).
  6. השתמש בתנאי SOE-PCR הבאים (שלב 1: דנטורינג ב 94 ° C במשך 2 דקות, שלב 2: denaturing ב 94 ° C במשך 30 שניות, שלב 3: חישול 58 ° C עבור 30 שניות, שלב 4: הארכה ב 68 ° C עבור 60 שניות, שלב 5: לחזור לשלב 2 ולחזור במשך 25 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב 68 ° C עבור 90 שניות).
  7. לנתח את המוצר SOE-PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל. הבלו אותו מן הג'ל באמצעות ערכת מיצוי ג'ל ופעל לפי ההוראות שסופקו.
  8. הגבירו את קלטת הספקטינומיצין מפלסמיד pR412 באמצעות תנאי ה-PCR הבאים: שלב 1: דנטורינג ב-94 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 2: דנטורינג ב-94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, שלב 3: חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, שלב 4: הארכה ב-68 מעלות צלזיוס למשך 60 שניות, שלב 5: חזור לשלב 2 וחזור על הפעולה במשך 25 מחזורים, שלב 6: הארכה סופית ב-68°C למשך 60 שניות.
    1. השתמש פריימרים BamHI_SP2F2 (GGATCC, CTA, GAA, CTA, GTG, GAT, CCC CC) ו- BamHI_SP2R2 (GGATCC, AAT, TCT, GCA, GAT, TTT, AC, ATG ATC). פלסמיד pR412 נרכשה מד"ר מארק פרודהום (CNRS-Universite Paul Sabatier, טולוז, צרפת).
  9. לנתח את אמפליקונים PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל. הבלו ולטהר את אמפליקון PCR המתקבל כמתואר לעיל.

2. יצירת פלסמיד pSD1 וטרנספורמציה כימית של E. coli Dh5α

  1. ביצוע קשירה בהתאם להוראות היצרן של מערכת pGEMT-easy I (טבלת חומרים). בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסף 5 μL של 2x חיץ קשירה, 1 μL של pGEMTeasy, 2 μL של המוצר ply_SOE, 1 μL של T4 DNA ligase ומים לנפח כולל של 20 μL. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F). זה מייצר פלסמיד pSD1.
  2. הפוך E. coli Dh5α בעל יכולת כימית עם pSD1. התחל על ידי דגירה של 50 μL של E. coli Dh5α בעל כשירות כימית עם 3 μL של תגובת קשירה pSD1 למשך 15 דקות על קרח. לאחר מכן המשך על ידי חשיפת התאים להלם תרמי (42 ° C, 30 שניות). מניחים את התאים על קרח למשך 2 דקות.
  3. הסר את התאים מקרח והוסף 350 μL של מדיה S.O.C. לדגור את התרבות במשך 2 שעות ב 37 ° C, 120 סל"ד.
  4. צלחת את השינוי על לוריא ברטאני אגר (LBA) בתוספת 0.4 mM IPTG, 0.24 מ"ג / מ"ל X-Gal עבור בחירה כחול/לבן ו 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין כדי להבטיח שכל המושבות הגדלות בצלחת יש את עמוד השדרה פלסמיד. מושבות לבנות מכילות pSD1.
  5. בחרו שלוש מושבות לבנות והקימו גידולי לילה ב-10 מ"ל ליברות, בתוספת אמפיצילין של 100 מיקרוגרם/מ"ל. לדגור על התרביות במשך הלילה ב 37 °C (77 °F) עם רעידות.
  6. למחרת צנטריפוגו את התרביות בגודל 3,082 x גרם והשתמשו בגלולה להפקת פלסמיד.

3. מיצוי DNA פלסמיד, הגבלת עיכול הגן pSD1 וספקטינומיצין והרכבת pSD2

  1. לחלץ את DNA פלסמיד בהתאם להוראות שסופקו עם הערכה המסחרית (טבלה של חומרים).
  2. הגדר עיכול הגבלת BamHI הן עבור פלסמיד pSD1 והן עבור קלטת ספקטינומיצין שהוגברה וטוהרה בעבר. השתמש בתנאים ובכמויות הבאים המתוארים בטבלה 1.
  3. לדגור את הגבלת העיכול תגובות ובקרות ב 37 ° C במשך 3 שעות.
  4. לנתח את העיכול הגבלה על ידי אלקטרופורזה, הבלו את הרצועה ולטהר בהתאם להוראות שסופקו עם הערכה המסחרית (טבלה של חומרים).
  5. לאחר מכן, הכינו תגובת קשירה בהתאם להוראות היצרן (טבלת חומרים) באמצעות pSD1 וספקטינומיצין מעוכל BamHI (משלב 3.2). בצינור מיקרוצנטריפוגה, הוסף את רכיבי התגובה הבאים: 5 μL של 2x חיץ קשירה, 2 μL pSD1, 2 μL של קלטת ספקטינומיצין, 1 μL של T4 DNA ligase ודגור לילה ב 4 ° C. זה מייצר פלסמיד pSD2.
  6. הפוך פלסמיד pSD2 ל- E. coli Dh5α בעל יכולת כימית כמתואר בשלב 2.2.
  7. בחר את הטרנספורמנטים הנושאים פלסמיד pSD2 בהתבסס על יכולתם לגדול ב- LBA בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל של ספקטינומיצין ואמפיצילין.
  8. ביצוע מיצוי DNA פלסמיד (pSD2) כמתואר לעיל ובהתאם להוראות היצרן (μL).

4. טרנספורמציה של זן S. pneumoniae 519/43

  1. הכינו תרבית לילה של S. pneumoniae 519/43 ב- BHI ואפשרו לו לגדול באופן סטטי ב 37 °C, 5% CO2.
  2. למחרת לדלל את התרביות 1:50 ו 1:100 ב 10 מ"ל של מרק BHI טרי. לדגור על התרביות באופן סטטי ב 37 ° C עד OD595nm הוא בין 0.05 ל 0.1 (רכישה אופטימלית של DNA קרוב יותר 0.1 OD).
  3. ברגע שמגיעים ל-OD של 0.1, לוקחים 860 μL ומעבירים לצינור מיקרוצנטריפוגה. באותו צינור מיקרוצנטריפוגה להוסיף: 100 μL של 100 mM NaOH, 10 μL של 20% (w/v) BSA, 10 μL של 100 mM CaCl 2,2 μL של 50 ng/mL CSP124 ו 500 ng של pSD2.
  4. לדגור את התגובה באופן סטטי ב 37 ° C במשך 3 שעות.
  5. צלחת 330 μL על 5% צלחות אגר דם (BA) בתוספת ספקטינומיצין 100 מיקרוגרם / מ"ל, כל שעה במשך 3 שעות הדגירה.
  6. לדגור על צלחות לילה ב 37 ° C, 5% CO2. מושבות עמידות בפני ספקטינומיצין טלאי על צלחת BA אחרת בתוספת ספקטינומיצין של 100 מיקרוגרם/מ"ל וכן על לוחות BA בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין. יש לדגור על שתי מערכות הצלחות למשך הלילה בתנאים שצוינו לעיל. לוחות ampicillin הם לבדוק את נוכחותו של עמוד השדרה פלסמיד.
  7. אשר את נוכחותה של קלטת spectinomycin על ידי PCR באמצעות פריימרים plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) ו- SPEC_REV (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG). אשר את המוטציה על ידי PCR באמצעות פריימרים plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) ו- plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) המתחברים מחוץ לאזור שעבר מוטציה.
  8. אשר את האינטגרציה במיקום הנכון של הגנום על ידי ריצוף באמצעות פריימרים plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT), כמו גם פריימרים עם אתר הקישור שלהם בקלטת spectinomycin sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGG ) ו- spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מתחיל בשימוש ב- PCR כדי להגביר את זרועות ההומולוגיה השמאלית והימנית, תוך מחיקת 191 bp מהאזור האמצעי של גן הרובד . בעת ביצוע ה-PCR מציגים אתר BamHI ב-3' של זרוע ההומולוגיה השמאלית ובקצה ה-5' של זרוע ההומולוגיה הימנית (איור 1A). אחריו מגיע PCR-SOE, שבו זרועות הומולוגיה שמאליות וימניות מאוחות לאמפליקון אחד (איור 1B). אמפליקון SOE-PCR זה משובט לאחר מכן לתוך pGEMTeasy באמצעות שיבוט TA כדי ליצור פלסמיד pSD1 (איור 1C

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דלקת ריאות סטרפטוקוקוס, במיוחד סרוטיפ 1, ממשיכה להוות איום עולמי הגורם למחלת פנאומוקוק פולשנית ולדלקת קרום המוח. למרות הכנסת חיסונים שונים שאמורים להגן מפני סרוטיפ 1, באפריקה סרוטיפ זה עדיין מסוגל לגרום להתפרצויות שיובילו לתחלואה ותמותה גבוהה13. היכולת לבצע מניפולציה גנטית בסרוטיפ זה היא בעלת חשיבות קריטית בגלל הרלוונטיות הקלינית שלו. השיטה המתוארת במחקר זה מאפשרת מניפולציה גנטית של זן מייצג בתוך סרוטיפ זה. זן פולשני 519/43 (ST5316), מבודד קליני מחולה דלקת קרום המוח בדנמרק

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לקרן דלקת קרום המוח ול-MRC על מתן המימון לעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AccuPrime Pfx DNA פולימראזInvitrogen12344024משמש להגברה של השברים
Ampicillin נתרןמלח Sigma AldrichA9518משמש לבחירת חיידקים בשלב 1 (pSD1)
בסיס אגר דםOxoidCM0055משמש לצלחת S. pneumoniae טרנספורמטורים
סרום בקר אלבומיןסיגמא55470משמש עבור S. pneumoniae טרנספורמציה
מוח עירוי לבאוקסואידCM1135המשמש לגידול S. pneumoniae תאים
סידן כלוריד Cacl2Sigma449709המשמש עבור S. pneumoniae טרנספורמציה
יכולת מגרה פפטיד 1AnaSpecAS-63779משמש לS. pneumoniae טרנספורמציה
מרק לוריא אגרגיבקו22700025משמש לציפוי ובחירה של בסיס מרק לוריא pSD1 ו-pSD2
(הניסוח של מילר)Gibco12795027משמש לציפוי ובחירה של ערכת מיצוי ג'ל pSD1 ו-pSD2
MonarchNEBT1020Sמשמש לחילוץ הרצועות מג'ל ה-DNA
Monarch Plasmid ערכת MiniprepNEBT1010Sמשמשת לחילוץ פלסמיד מהתאים
pGEM T-easyPromegaA1360המשמש כפלסמיד התאבדות
S.O.C.Invitrogen15544034משמש לשחזור תאים לאחר טרנספורמציה
נתרן הידרוקסיד (NaOH)SigmaS0899המשמש לS.pneumoniae טרנספורמציה
ספקטינומיצין הידרוכלורידSigmaAldrichPHR1426משמש לבחירת חיידקים
יעילות תת-שיבוט DH5α תאים מוכשריםInvitrogenמשמשים18265017 ליצירת pSD1 ו- pSD2

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31(2006).
  2. Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
  3. Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
  4. Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
  5. Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
  6. Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
  7. Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
  8. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
  9. Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215(2013).
  10. Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
  11. Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
  12. Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81(2008).
  13. Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575(2016).
  14. Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198(2008).
  15. Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
  16. Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22(2010).
  17. Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
  18. Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90(2015).
  19. Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
  20. Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
  21. Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
  22. Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
  23. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
  24. Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
  25. Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
  26. Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
  27. Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
  28. Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
  29. Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122(2011).
  30. Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Streptococcus pneumoniaeSerotype 1Genetic ModificationPlasmid ConstructionNatural TransformationSuicide PlasmidPneumolysin MutationHemolytic Activity AssayBlue White SelectionRestriction Digestion

מאמרים קשורים