מאמר שיטה

דיסקציה מיקרוכירורגית וניקוי רקמות להדמיית רשתית שלמה ברזולוציה גבוהה והזגוגית

DOI:

10.3791/61595

⸱

11 במרץ 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Anatomy, University of Texas Medical Branch, 3Biomedical Engineering and Imaging Sciences Group, University of Texas Medical Branch, 4Department of Ophthalmology, University of Texas Medical Branch

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית רשתית שלמה שלמה שבה השכבות החיצוניות האטומות/פיגמנטיות של גלגל העין מוסרות בניתוח, וניקוי אופטי מיושם כדי להפוך את הרשתית לשקופה המאפשרת הדמיה של הרשתית ההיקפית וכלי הדם ההיאלואידים ברשתית שלמה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות קלות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן לדמיין טוב יותר מבנים עצביים וכלי דם של הרשתית במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים על ידי שימוש בטכניקות הדמיה שלמות של רשתית שלמה בהשוואה לתכשירים וחתכים קונבנציונליים של הרכבה שטוחה ברשתית. עם זאת, הדמיה אימונו-פלואורסצנטית של רשתית שלמה שלמה מונעת על ידי הציפוי האטום של גלגל העין, כלומר, סקלרה, כורואיד ואפיתל פיגמנט רשתית (RPE) ותכונות פיזור האור של שכבות הרשתית המונעות הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה בעובי מלא. הלבנה כימית של שכבות הפיגמנט ופרוטוקולי ניקוי רקמות תוארו כדי להתמודד עם מכשולים אלה; עם זאת, השיטות המתוארות כיום אינן מתאימות להדמיה של מולקולות פלואורסצנטיות אנדוגניות כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ברשתית שלמה שלמה. גישות אחרות עקפו מגבלה זו על ידי הסרה כירורגית של שכבות פיגמנטיות והמקטע הקדמי של גלגל העין המאפשר הדמיית עין שלמה, אם כי הרשתית ההיקפית והמבנים ההיאלואידים שובשו. מוצג כאן פרוטוקול הדמיה אימונו-פלואורסצנטי שלם של רשתית שלמה וזגוגית המשלב דיסקציה כירורגית של שכבות אפיתל פיגמנט סקלרה/כורואיד/רשתית (RPE) עם שיטת ניקוי רקמות שונה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור (LSFM). הגישה החדשה מציעה מבט חסר תקדים על מרכיבי כלי הדם והעצבים של הרשתית כמו גם מערכת כלי הדם הזגוגית וההיאלואידית במצבים פתולוגיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציה בין האלמנטים העצביים וכלי הדם ברשתית במצבי בריאות וחולי נחקרת באופן מסורתי על ידי מחקרים אימונופלואורסצנטיים על חתכים פיזיים של רקמת רשתית קבועה בפרפין או קריו או על תכשירים שטוחים ברשתית1. עם זאת, חתך רקמות משבש את המשכיות העצבים וכלי הדם ברשתית, ולמרות ששחזור תלת מימדי של מקטעי הרשתית הסמוכים מוצע כפתרון אפשרי, הוא עדיין נתון לשגיאות וחפצים. תכשירי הרכבה שטוחה ברשתית מפריעים באופן ניכר גם לשלמות האלמנטים של כלי הדם והעצבים ברשתית ולקשר הגיאוגרפי בין אזורי הרשתית הסמוכים2. לחלופין, לאחרונה הוצגה הדמיית רשתית שלמה שלמה כדי להמחיש את ההקרנות התלת מימדיות של רכיבי עצב וכלי דם ברשתית במיקומם האנטומי הטבעי 2,3,4,5.

בהדמיית רשתית שלמה שלמה, אותות פלואורסצנטיים מהאלמנטים כלי הדם והעצביים של אזורי רשתית סמוכים (אריחים) של רשתית שלמה שלמה נלכדים באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור; לאחר מכן אריחים אלה "נתפרים" יחד כדי לשחזר תצוגה תלת מימדית של כל הרשתית 2,3,4,5,6. הדמיית רשתית שלמה שלמה מספקת מבט חסר תקדים על הרשתית לחקר הפתוגנזה של מחלות כלי דם, ניווניות ודלקתיות ברשתית 2,3,4,5,6. לדוגמה, פרהסט ועמיתיו חשפו מורפולוגיה מסוקסת "לא מוערכת" בעבר לציציות כלי דם פתולוגיות, תנועתיות תאים לא תקינה ודינמיקת פילופודיה משתנה במודל רטינופתיה המושרה על ידי חמצן (OIR) באמצעות הדמיה חיה של רשתית שלמהשלמה 2. באופן דומה, הנינג ואחרים, סינג ואחרים וצ'אנג ואחרים הדגימו את רשת כלי הדם התלת מימדית המורכבת ברשתית שלמה 3,4,6. Vigouroux et al. השתמשו בשיטת הדמיית עין שלמה שלמה כדי להראות את ארגון הרשתית וההקרנות החזותיות בתקופה סביב הלידה5. על מנת להיות מסוגלים ליצור תצוגות תלת מימדיות חסרות תקדים כאלה של הרשתית, פרוטוקולי הדמיית רשתית שלמה שלמים התגברו על שתי מגבלות עיקריות: 1) נוכחות של ציפויים אטומים ופיגמנטיים של גלגל העין (סקלרה, כורואיד ו-RPE) ו-2) החדירה המוגבלת של האור דרך עובי הרשתית המלא הנגרמת על ידי תכונות פיזור האור של שכבות הגרעין והפרספקס של הרשתית. הנינג ואחרים ו-Vigouroux et al. יישמו הלבנת H2O2 של פיגמנטים כורואידים/RPE כדי להיות מסוגלים לדמות רשתיתשלמה 3,5. עם זאת, הלבנה אינה מתאימה לזנים של בעלי חיים עם פלואורופורים אנדוגניים כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או לאחר צביעה אימונו-פלואורסצנטית in-vivo 3,5,7. בנוסף, השיטה של הנינג ועמיתיו לטיפול ב-H2O2 בוצעה בתנאים מימיים שעלולים ליצור מיקרו-בועות שגורמות להיפרדות רשתית. יתר על כן, הטיפול ב-H2O2 בוצע ב-55 מעלות צלזיוס, מצב שמדרדר עוד יותר את זיקת הנוגדנים לרקמות. יתר על כן, הלבנה עלולה להכניס אוטופלואורסצנטיות כבדה שמקורה במלניןמחומצן 8. פרוטוקולי דה-פיגמנטציה אחרים לחלקי עיניים באמצעות אשלגן פרמנגנט וחומצה אוקסלית הצליחו להסיר פיגמנטים RPE בחתכים עובריים, אך שיטת דה-פיגמנטציה זו הוכחה גם כמפחיתה את היעילות של תיוג חיסוני 9,10. כחלופה להלבנה, Prahst et al., Singh et al., ו- Chang et al. הסירו סקלרה וכורואיד וקרנית כדי להפוך רשתית שלמה לנגישה לאור מיקרוסקופ 2,4,6. עם זאת, הסרת הקרנית, העדשה והרשתית ההיקפית עלולה לעוות ולשבש את הרשתית ההיקפית וכלי הדם ההיאלואידים, מה שהופך את השיטות הללו לבלתי מתאימות לחקר הרשתית ההיקפית וכלי הדם ההיאלואידים.

כל פרוטוקולי הדמיית העין השלמה הזמינים כיום כוללים שימוש בשלב ניקוי אופטי של רקמות כדי להתגבר על תכונות פיזור האור של שכבות הרשתית 2,3,4,5. ניקוי אופטי של רקמות הופך את הרשתית לשקופה לאור מיקרוסקופ על ידי השוואת מקדם השבירה של רקמה נתונה, כאן הרשתית, על פני כל האלמנטים התאיים והבין-תאיים שלה כדי למזער את פיזור האור וספיגתו11. יש להסיר או להלבין כורואיד ו-RPE לפני החלת ניקוי אופטי של רקמות על הרשתית מכיוון שלא ניתן לנקות מספיק את הציפוי הפיגמנטי של גלגל העין (כורואיד ו-RPE) 6,12,13,14,15,16,17,18.

ההשתתפות והתרומה של מערכת כלי הדם הזגוגית וההיאלואידית במצבים פתולוגיים כגון רטינופתיה של פגות (ROP), כלי דם עובריים מתמשכים (PFV), מחלת נורי ומחלת סטיקלר נחקרת בצורה הטובה ביותר כאשר הרשתית וכלי הדם ההיאלואידים אינם מופרעים בהכנת הרקמות 19,20,21,22,23. השיטות הקיימות להדמיית רשתית שלמה מסירות את החלק הקדמי של העין, המשבש באופן טבעי את הזגוגית ואת כלי הדם שלה, או מורחות חומרי הלבנה, שעשויים להסיר פלואורופורים אנדוגניים. חסרות שיטות שפורסמו להמחשת גוף הזגוגית וכלי הדם במצבם השלם והבתולי. אנו מתארים כאן שיטת הדמיה שלמה של רשתית וזגוגית המורכבת מדיסקציה כירורגית של ציפויים פיגמנטיים ואטומים של גלגל העין, ניקוי אופטי של רקמות מותאמות לרשתית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות קלות. הכנת דגימה, ניקוי אופטי של רקמות, מיקרוסקופ גיליון אור ושלבי עיבוד תמונה מפורטים להלן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של הסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס (IACUC). השימוש והטיפול בבעלי חיים היו בהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. כל החומרים הנדרשים לביצוע הליך זה מפורטים בטבלת החומרים. ללבוש כפפות ללא אבקה בעת ביצוע כל שלב. לשלבים 6 ו-7, עיין גם במדריך ההפעלה הרשמי של המיקרוסקופ.

1. הכנת בעלי החיים

  1. המתת חסד של עכברי הניסוי בהתאם לפרוטוקול הרלוונטי שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (נעשה שימוש כאן בהרדמה עם שילוב של קטמין 60 מ"ג/ק"ג ודקסמדטומידין 0.5 מ"ג/ק"ג ואחריו פריקת צוואר הרחם). המשך מיד לייצוב החיה על פלטפורמה לדיסקציה וזלוף לב.
    הערה: חיות ניסוי נבחרות על סמך תכנון של מחקר פרטני.
  2. נתח את הבטן ובית החזה כדי לחשוף את הלב. בצע זלוף לב על ידי עירוי הלב באמצעות מחט 27 גרם המונחת בחדר השמאלי וצור חתך קטן (~1 מ"מ) בפרוזדור הימני כדי לאפשר יציאת דם24.
    1. ראשית, העבירו 30-50 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת פוספט קר כקרח (PBS) ולאחר מכן, 30-50 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד טרי (PFA).
    2. כדי לבדוק עירוי PFA מוצלח, בדוק אם יש עוויתות שרירים גלויות בכל הגוף והזנב. המשך לשלב ההוצאה.

2. העלאת גלגל העין וקיבוע

  1. השתמשו במלקחיים מעוקלים של תכשיטן כדי לדחוף בעדינות את העפעף העליון או התחתון כדי להוציא את גלגל העין מהארובה שלו. השתמש בסט אחר של תכשיטן או מלקחיים דומים כדי לנקב את הלחמית מהצד ולהחזיק את הגלובוס מצד עצב הראייה. הרם לאט את הגלובוס מהשקע שלו עד שהוא מנותק מעצב הראייה.
  2. העבירו את הגלובוס לצינור המכיל 4% PFA טרי קר כקרח. סמן את הצינור בהתאם. הניחו לגלובוס להישאר ב-4% PFA במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות (לילה).
    הערה: השתמש בפיפטת העברה מפלסטיק עם קצה חתוך כדי להעביר את הגלובוס. הרחב את פתח קצה החיתוך עם קצה פיפטה שני כדי למנוע פגיעה בדגימה עם קצוות חדים.

3. דיסקציה של המדגם (איור 1 ואיור 2)

  1. תחת סטריאומיקרוסקופ, אתרו את צומת הקרנית-סקלרה (איור 1A) והשתמשו בקצה החיתוך החד של מחט 30 G כדי לבצע חתך שטחי מאוד בסקלרה כ-0.5-1 מ"מ מאחורי צומת הקרנית-סקלרה (איור 1B).
  2. התקדמו באחד הלהבים של קצה חד שמנתח מספריים דרך החתך שזה עתה נעשה לתוך החלל הפוטנציאלי שבין הסקלרה/כורואיד/RPE והרשתית (איור 1C). התקדמו את המספריים וחתכו בצורה היקפית עד שניתן לקלף את הסקלרה/כורואיד/RPE מהמשטח החיצוני של הרשתית (איור 1D,E).
    הערה: חשוב לבצע שלב זה לאט ובעדינות כדי למנוע ניקוב הרשתית. החתכים הראשונים קריטיים במיוחד כדי למנוע חיתוך דרך הרשתית.
  3. במידת הצורך, בצע חתכים רדיאליים מרגיעים על הסקלרה/כורואיד/RPE כדי להקל על תהליך החיתוך ההיקפי והקילוף הבא של עצב הראייה והסקלרה/כורואיד/RPE. הסר טלאים קטנים של RPE (איור 1F) באמצעות מברשת ציור בגודל 1 ספוגה ב-PBS.
  4. העבירו את כל גלגל העין השלם לצינור המכיל PBS. המשך מיד לשלב הבא או שמור ב-4 מעלות צלזיוס לתיוג חיסוני.
    הערה: ניתן להניח סימנים על גלגל העין לאחר הוצאת העין ולאחר מכן, לאחר דיסקציה כדי לשמור על כיוון העין במידת הצורך. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, והדגימות עשויות להישמר למשך הלילה במקרר של 4 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך לשלבים הבאים.

4. מכתים בכלי הדם

  1. לחדור את הרקמה על ידי טבילתה ב-PBS המכיל 0.2% Tween-20 בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  2. שטפו את הדגימה עם PBS 3 פעמים על שייקר למשך 10 דקות.
  3. דגרו את הדגימה עם 5% סרום עיזים רגיל (NGS) ב-PBS המכיל 0.25% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר למשך שעה.
  4. יש לדגור עם הנוגדן הראשוני בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. כאן נעשה שימוש בנוגדני קולגן IV נגד עכברים (הריכוז הסופי הוכן ב-PBS המכיל 0.2% Tween-20).
  5. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS, למשך 5 דקות לכל כביסה.
  6. דגרו את הדגימה עם נוגדנים משניים המסומנים בפלואורסצנט. כאן, נעשה שימוש באנטי-ארנב Alexa Fluor 568 במשך 12 שעות ב-4 מעלות צלזיוס (דילול של 1:200 ב-PBS המכיל 0.2% Tween-20).
  7. שטפו עם PBS 3 פעמים, למשך שעה כל אחת, ולאחר מכן המשיכו בשלבי ניקוי הרקמות.

5. ניקוי אופטי עם 2,2′-תיודיתאנול (TDE)

  1. הכן ריכוזי TDE עובדים באמצעות תמיסת TDE מלאי עם PBS לריכוז סופי של 10%, 20%, 30%, 40%, 50% ו-60% נפח לנפח (v/v). הכן לפחות 2 מ"ל תמיסה לכל דגימת עין כדי לאפשר מספיק נפח עודף לחדור לרקמה.
  2. דגרו את הדגימות בצלחת של 6 או 12 בארות היטב בריכוז הולך וגדל של TDE. התחילו בטבילת גלגלי העיניים השלמים בתמיסת 10% TDE למשך 2-4 שעות על שייקר בטמפרטורת החדר. ברצף, העבירו את הדגימה לריכוז TDE גבוה יותר למשך 2-4 שעות בכל ריכוז TDE (איור 2C).
    הערה: הרשתית מתחילה להתנקות בריכוזים של 40%-50%, אך ניקוי מקסימלי מתרחש לאחר הדגירה בתמיסה של 60%. הרשתית הופכת פחות שקופה בריכוזים של 70% ומעלה (איור 2D).
  3. עצור את תהליך הסליקה בן לילה, במידת הצורך, בכל אחד משלבי חילופי הסליקה העוקבים.

6. הדמיית עין שלמה באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור

  1. הרכיב את דגימות העין השלמות בהתחשב בתצורה של פלטפורמת מיקרוסקופ גיליון האור המשמשת. עקוב אחר הוראות המיקרוסקופ ותוכנת הרכישה כדי להגדיר פרמטרי רכישה כולל יישור גיליון אור והארה וזיהוי נתיבים אופטיים.
    הערה: הדגימות ששימשו בניסוי הזה הודבקו מהצד של הקרנית לקצה של מחט תת-עורית במזרק אינסולין (איור 2E). לאחר מכן הדגימה הושעתה בתוך תא המיקרוסקופ.
  2. מלאו את תא המיקרוסקופ ב-60% TDE כתמיסת ניקוי.
  3. טבלו את הדגימה בתוך תא המיקרוסקופ של גיליון האור בתמיסת TDE של 60% (ריכוז הפינוי הסופי).
  4. דמיין את העין הצלולה באמצעות מגוון מיקרוסקופים קונפוקליים ויריעות אור מסחריות או מותאמות אישית. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במיקרוסקופ גיליון אור תאורה דו-צדדי.
  5. השתמש בהדמיה ברזולוציה נמוכה ובהגדלה נמוכה (5x, NA 0.16) כדי לדמות מורפולוגיה תאית ומעקב אחר תהליכים תאיים, במיוחד בשילוב עם אריחים. השתמש בהדמיה ברזולוציה גבוהה ובהגדלה (20x, NA 1.0) כדי לדמות הן מורפולוגיה תאית והן אברונים תת-תאיים גדולים כגון גרעינים ואשכולות מיטוכונדריה.

7. עיבוד תמונה לאחר רכישה

הערה: העיבוד לאחר הרכישה תלוי בסוג הקובץ ובתוכנה התואמים לקובצי ההדמיה.

  1. החל טשטוש או דה-קונבולוציה כדי להגדיל עוד יותר את התמונות הגולמיות לפני תפירת האריחים המצולמים. ניתן להחיל מסנן Weiner כדי לטשטש את התמונות. לחלופין, ניתן לבטל את הקונבולציה של תמונות באופן איטרטיבי לאחר דה-קונבולוציה של ריצ'רדסון-לוסי ו-PSF תיאורטי או נמדד באופן ניסיוני באמצעות כלי מידול כגון תוסף מחולל ImageJ PSF25.
  2. בצע תפירה של ערימות z מעובדות מראש וטרנספורמציות נפח אפין ולא קשיח ולאחר מכן רישום ומיזוג של אמצעי אחסון מרובי תצוגות באמצעות מגוון חבילות תוכנה מסחריות או ציבוריות (תוסף ImageJ – BigStitcher)26.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנה בזווית אפס של רשת כלי דם פריפפילרית ומיקרוגליה מוצגת באיור 3A. כמו כן, התפלגות מיקרוגליה שלמה ברשתית בעכבר CX3CR1-GFP מוצגת באיור 3B. יתרון מרכזי של השיטה המוצגת כאן, הוא היכולת שלה לדמות פלואורופורים מולדים. איור 3C,D מראה מיקרוגליה בהקרנות Z מייצגות (תעלה ירוקה) מדגימות שהוכנו בשיטה הנוכחית של הדמיית עין שלמה שלמה (איור 3C) ותכשירי הרכבה שטוחה (אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות רשתית וזגוגית ופתולוגיות נחקרות בצורה הטובה ביותר באמצעות טכניקות הדמיה שלמות של רשתית שלמה שבהן הרשתית אינה נחתכת למקטעים או לתכשירים שטוחים. שיטות הדמיה שלמות קיימות של עין שלמה משלבות הלבנת פיגמנט, המסירה פלואורופורים מולדים, או כרוכות בהסרה פיזית של הציפוי האטום של גלגל העין (RPE, כורואיד וסקלרה) יחד עם המקטע הקדמי של העין, מה שעלול להפריע לרשתית ההיקפית ולגוף הזגוגית. צ'אנג ואחרים ופרהסט ואחרים הסירו את הציפוי החיצוני של גלגל העין כמו גם את הקרנית ובכך אולי שיבשו את גוף הזגו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגוד עניינים מסחרי רלוונטי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נעשתה בשלוחה הרפואית של אוניברסיטת טקסס. המחברים מעריכים את האראלד
ד"ר יונג, דבורה פרינגטון, והיידי רוריך, מאוניברסיטת מינסוטה על עזרתם בהכנת איור 1 וסרט 2. LO נתמך על ידי NIEHS T32 Training Grant T32ES007254.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חיית ניסוי
CX3CR1-GFP עכברמעבדת ג'קסון5582
<חזק>חומר הרדמה
DexmedetomidinePar Pharmaceutical42023-146-25
קטמיןפרזניוס קאבי
<חזק>קצירת רקמות, קיבוע ודיסקציה של דגימה
לב משאבת זלוףפישר מדעיתNC9069235
דבק-על ציאנואקרילטamazon.com
מספריים עדינותחדות כלי מדע עדינים14160-10
פינצטהעדינה כלי מדע עדינים11412-11
פרפורמלדהיד (PFA)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710-S
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Gibco10010049
גודל 1 מברשת ציורdickblick.com
מספריים קפיציים ישריםFine Science Tools15000-03
מזרק, קצה מחט, 27 מד x 1.25 אינץ'
BD צינורות 1.5 מ"ל, 15 מ"ל, 50 מ"לThermo sceintific
Tween-20ThermoFisher85114
<חזק>צביעה אימונופלורסנט
קולגן IV נגד עכברAbcamab198081:200 דילול
אנטי ארנב Alexa Fluor 568InvitreogenA-110111:200 דילול
עז רגילה סרוםThermoFisher50062Zריכוז 10%
<חזק>ניקוי רקמות
2,2&פריים;-תיודיתנול (TDE)Fluka analyticaSTBD7772V
שייקר נדנדהפישר מדעי02-217-765
<חזק>מיקרוסקופיה
מיקרוספירות פלואורסצנטיותTetraSpeckT14792
מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM)ZeissZ1
<ספירת >מיקרוגליה
ImageJהמכון הלאומי לבריאות
נוגדן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Usui, Y., et al. Neurovascular crosstalk between interneurons and capillaries is required for vision. Journal of Clinical Investigation. 125, 2335-2346 (2015).
  2. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).
  3. Henning, Y., Osadnik, C., Malkemper, E. P. EyeCi: Optical clearing and imaging of immunolabeled mouse eyes using light-sheet fluorescence microscopy. Experimental Eye Research. 180, 137-145 (2019).
  4. Chang, C. C., et al. Selective Plane Illumination Microscopy and Computing Reveal Differential Obliteration of Retinal Vascular Plexuses. bioRxiv. , (2020).
  5. Vigouroux, R. J., César, Q., Chédotal, A., Nguyen-Ba-Charvet, K. T. Revisiting the role of DCC in visual system development with a novel eye clearing method. eLife. 9, 51275(2020).
  6. Singh, J. N., Nowlin, T. M., Seedorf, G. J., Abman, S. H., Shepherd, D. P. Quantifying three-dimensional rodent retina vascular development using optical tissue clearing and light-sheet microscopy. Journal of Biomedical Optics. 22, 076011(2017).
  7. Kim, S. Y., Assawachananont, J. A new method to visualize the intact subretina from retinal pigment epithelium to retinal tissue in whole mount of pigmented mouse eyes. Translational Vision Science and Technology. 5, 1-8 (2016).
  8. Kayatz, P., et al. Oxidation causes melanin fluorescence. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42, 241-246 (2001).
  9. Iwai-Takekoshi, L., et al. Retinal pigment epithelial integrity is compromised in the developing albino mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 524, 3696-3716 (2016).
  10. Alexander, R. A., Cree, I. A., Foss, A. J. The immunoalkaline phosphatase technique in immunohistochemistry: the effect of permanganate-oxalate melanin bleaching upon four final reaction products. British Journal of Biomedical Science. 53, 170-171 (1996).
  11. Ueda, H. R., et al. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  12. Hillman, E. M. C., Voleti, V., Li, W., Yu, H. Light-Sheet Microscopy in Neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 42, 295-313 (2019).
  13. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  14. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  15. Hohberger, B., Baumgart, C., Bergua, A. Optical clearing of the eye using the See Deep Brain technique. Eye. 31, London, England. 1496-1502 (2017).
  16. Kuwajima, T., et al. ClearT: A detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development (Cambridge). 140, 1364-1368 (2013).
  17. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14, 48(2014).
  18. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859-867 (2016).
  19. Hegde, S., Srivastava, O. Different gene knockout/transgenic mouse models manifesting persistent fetal vasculature: Are integrins to blame for this pathological condition. Life Sciences. 171 (15), 30-38 (2016).
  20. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and Management of Retinopathy of Prematurity. New England Journal of Medicine. 367, 2515-2526 (2012).
  21. Pierce, E. A., Foley, E. D., Smith, L. E. H. Regulation of vascular endothelial growth factor by oxygen in a model of retinopathy of prematurity. Archives of Ophthalmology. 114, 1219-1228 (1996).
  22. Ash, J., McLeod, D. S., Lutty, G. A. Transgenic expression of leukemia inhibitory factor (LIF) blocks normal vascular development but not pathological neovascularization in the eye. Molecular Vision. 11, 298-308 (2005).
  23. Reichel, M. B., et al. High frequency of persistent hyperplastic primary vitreous and cataracts in p53-deficient mice. Cell Death and Differentiation. 5, 156-162 (1998).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 3564(2012).
  25. Kirshner, H., Aguet, F., Sage, D., Unser, M. 3-D PSF fitting for fluorescence microscopy: Implementation and localization application. Journal of Microscopy. 249, 13-25 (2013).
  26. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  28. Tian, B., et al. Efficacy of novel highly specific bromodomain-containing protein 4 inhibitors in innate inflammation–driven airway remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60, 68-83 (2019).
  29. Zaman, R. T., et al. Changes in morphology and optical properties of sclera and choroidal layers due to hyperosmotic agent. Journal of Biomedical Optics. 16, 077008(2011).
  30. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  31. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  32. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808(2015).
  33. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PLoS One. 10, 0116280(2015).
  34. Icha, J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. Journal of Visualized Experiments. (110), e53966(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Light Sheet MicroscopySclera Choroid RPE DissectionRetinal Vascular ImagingNeuronal Structure ImagingEndogenous Fluorescent ImagingGFP Retina ImagingHigh Resolution Retina
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים