מאמר שיטה

דיסקציה מיקרוכירורגית וניקוי רקמות להדמיית רשתית שלמה ברזולוציה גבוהה והזגוגית

DOI:

10.3791/61595

⸱

11 במרץ 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Anatomy, University of Texas Medical Branch, 3Biomedical Engineering and Imaging Sciences Group, University of Texas Medical Branch, 4Department of Ophthalmology, University of Texas Medical Branch

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן פרוטוקול להדמיית רשתית שלמה שלמה שבה השכבות החיצוניות האטומות/פיגמנטיות של גלגל העין מוסרות בניתוח, וניקוי אופטי מיושם כדי להפוך את הרשתית לשקופה המאפשרת הדמיה של הרשתית ההיקפית וכלי הדם ההיאלואידים ברשתית שלמה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות קלות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתן לדמיין טוב יותר מבנים עצביים וכלי דם של הרשתית במצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים על ידי שימוש בטכניקות הדמיה שלמות של רשתית שלמה בהשוואה לתכשירים וחתכים קונבנציונליים של הרכבה שטוחה ברשתית. עם זאת, הדמיה אימונו-פלואורסצנטית של רשתית שלמה שלמה מונעת על ידי הציפוי האטום של גלגל העין, כלומר, סקלרה, כורואיד ואפיתל פיגמנט רשתית (RPE) ותכונות פיזור האור של שכבות הרשתית המונעות הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה בעובי מלא. הלבנה כימית של שכבות הפיגמנט ופרוטוקולי ניקוי רקמות תוארו כדי להתמודד עם מכשולים אלה; עם זאת, השיטות המתוארות כיום אינן מתאימות להדמיה של מולקולות פלואורסצנטיות אנדוגניות כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ברשתית שלמה שלמה. גישות אחרות עקפו מגבלה זו על ידי הסרה כירורגית של שכבות פיגמנטיות והמקטע הקדמי של גלגל העין המאפשר הדמיית עין שלמה, אם כי הרשתית ההיקפית והמבנים ההיאלואידים שובשו. מוצג כאן פרוטוקול הדמיה אימונו-פלואורסצנטי שלם של רשתית שלמה וזגוגית המשלב דיסקציה כירורגית של שכבות אפיתל פיגמנט סקלרה/כורואיד/רשתית (RPE) עם שיטת ניקוי רקמות שונה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של יריעות אור (LSFM). הגישה החדשה מציעה מבט חסר תקדים על מרכיבי כלי הדם והעצבים של הרשתית כמו גם מערכת כלי הדם הזגוגית וההיאלואידית במצבים פתולוגיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האינטראקציה בין האלמנטים העצביים וכלי הדם ברשתית במצבי בריאות וחולי נחקרת באופן מסורתי על ידי מחקרים אימונופלואורסצנטיים על חתכים פיזיים של רקמת רשתית קבועה בפרפין או קריו או על תכשירים שטוחים ברשתית1. עם זאת, חתך רקמות משבש את המשכיות העצבים וכלי הדם ברשתית, ולמרות ששחזור תלת מימדי של מקטעי הרשתית הסמוכים מוצע כפתרון אפשרי, הוא עדיין נתון לשגיאות וחפצים. תכשירי הרכבה שטוחה ברשתית מפריעים באופן ניכר גם לשלמות האלמנטים של כלי הדם והעצבים ברשתית ולקשר הגיאוגרפי בין אזורי הרשתית הסמוכים2. לחלופין, לאחרונה הוצגה הדמיית רשתית שלמה שלמה כדי להמחיש את ההקרנות התלת מימדיות של רכיבי עצב וכלי דם

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של הסניף הרפואי של אוניברסיטת טקסס (IACUC). השימוש והטיפול בבעלי חיים היו בהתאם להצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה. כל החומרים הנדרשים לביצוע הליך זה מפורטים בטבלת החומרים. ללבוש כפפות ללא אבקה בעת ביצוע כל שלב. לשלבים 6 ו-7, עיין גם במדריך ההפעלה הרשמי של המיקרוסקופ.

1. הכנת בעלי החיים

  1. המתת חסד של עכברי הניסוי בהתאם לפרוטוקול הרלוונטי שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (נעשה שימוש כאן בהרדמה עם שילוב של קטמין 60 מ"ג/ק"ג ודקסמדטומידין 0.5 מ"ג/ק"ג ואחריו....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנה בזווית אפס של רשת כלי דם פריפפילרית ומיקרוגליה מוצגת באיור 3A. כמו כן, התפלגות מיקרוגליה שלמה ברשתית בעכבר CX3CR1-GFP מוצגת באיור 3B. יתרון מרכזי של השיטה המוצגת כאן, הוא היכולת שלה לדמות פלואורופורים מולדים. איור 3C,D מראה מיקרוגליה בהקרנות Z מייצגות (תעלה ירוקה) מדגימות שהוכנו בשיטה הנוכחית של הדמיית עין שלמה שלמה (איור 3C) ותכשירי הרכבה שטוחה (אי.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות רשתית וזגוגית ופתולוגיות נחקרות בצורה הטובה ביותר באמצעות טכניקות הדמיה שלמות של רשתית שלמה שבהן הרשתית אינה נחתכת למקטעים או לתכשירים שטוחים. שיטות הדמיה שלמות קיימות של עין שלמה משלבות הלבנת פיגמנט, המסירה פלואורופורים מולדים, או כרוכות בהסרה פיזית של הציפוי האטום של גלגל העין (RPE, כורואיד וסקלרה) יחד עם המקטע הקדמי של העין, מה שעלול להפריע לרשתית ההיקפית ולגוף הזגוגית. צ'אנג ואחרים ופרהסט ואחרים הסירו את הציפוי החיצוני של גלגל העין כמו גם את הקרנית ובכך אולי שיבשו את גוף הזגו.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין ניגוד עניינים מסחרי רלוונטי.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נעשתה בשלוחה הרפואית של אוניברסיטת טקסס. המחברים מעריכים את האראלד
ד"ר יונג, דבורה פרינגטון, והיידי רוריך, מאוניברסיטת מינסוטה על עזרתם בהכנת איור 1 וסרט 2. LO נתמך על ידי NIEHS T32 Training Grant T32ES007254.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חיית ניסוי
CX3CR1-GFP עכברמעבדת ג'קסון5582
<חזק>חומר הרדמה
DexmedetomidinePar Pharmaceutical42023-146-25
קטמיןפרזניוס קאבי
<חזק>קצירת רקמות, קיבוע ודיסקציה של דגימה
לב משאבת זלוףפישר מדעיתNC9069235
דבק-על ציאנואקרילטamazon.com
מספריים עדינותחדות כלי מדע עדינים14160-10
פינצטהעדינה כלי מדע עדינים11412-11
פרפורמלדהיד (PFA)מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710-S
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)Gibco10010049
גודל 1 מברשת ציורdickblick.com
מספריים קפיציים ישריםFine Science Tools15000-03
מזרק, קצה מחט, 27 מד x 1.25 אינץ'
BD צינורות 1.5 מ"ל, 15 מ"ל, 50 מ"לThermo sceintific
Tween-20ThermoFisher85114
<חזק>צביעה אימונופלורסנט
קולגן IV נגד עכברAbcamab198081:200 דילול
אנטי ארנב Alexa Fluor 568InvitreogenA-110111:200 דילול
עז רגילה סרוםThermoFisher50062Zריכוז 10%
<חזק>ניקוי רקמות
2,2&פריים;-תיודיתנול (TDE)Fluka analyticaSTBD7772V
שייקר נדנדהפישר מדעי02-217-765
<חזק>מיקרוסקופיה
מיקרוספירות פלואורסצנטיותTetraSpeckT14792
מיקרוסקופ פלואורסצנטי של גיליון אור (LSFM)ZeissZ1
<ספירת >מיקרוגליה
ImageJהמכון הלאומי לבריאות
נוגדן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Usui, Y., et al. Neurovascular crosstalk between interneurons and capillaries is required for vision. Journal of Clinical Investigation. 125, 2335-2346 (2015).
  2. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in spa....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Light Sheet MicroscopyRPEGFP
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים