הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

סיכום

בנייר שיטה זה, אנו מציגים אסטרטגיית סינון בתפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות כימיות, כגון אוסמוליטים, שיש להן השפעה משמעותית על התמדה חיידקית.

תקציר

מתמידי חיידקים מוגדרים כתת-אוכלוסיות קטנות של גרסאות פנוטיפיות עם היכולת לסבול ריכוזים גבוהים של אנטיביוטיקה. הם דאגה בריאותית חשובה כפי שהם קושרו עם זיהומים כרוניים חוזרים ונשנים. למרות הדינמיקה סטוכסטי ודטרמיניסטי של מנגנונים הקשורים ללחץ ידועים לשחק תפקיד משמעותי בהתמדה, מנגנונים שבבסיס המעבר פנוטיפי אל / ממצב ההתמדה אינם מובנים לחלוטין. בעוד גורמי התמדה המופעלים על ידי אותות סביבתיים (למשל, דלדול של מקורות פחמן, חנקן וחמצן) נחקרו בהרחבה, ההשפעות של osmolytes על התמדה עדיין לא נקבעו. באמצעות microarrays (כלומר, 96 לוחות באר המכילים כימיקלים שונים), עיצבנו גישה כדי להבהיר את ההשפעות של osmolytes שונים על Escherichia coli התמדה באופן תפוקה גבוהה. גישה זו היא טרנספורמטיבית כפי שהוא יכול להיות מותאם בקלות עבור מערכי הקרנה אחרים, כגון לוחות סמים וספריות נוקאאוט גנים.

מבוא

תרביות חיידקים מכילות תת-אוכלוסיות קטנות של תאים מתמידים הסובלניים באופן זמני לרמות גבוהות במיוחד של אנטיביוטיקה. תאים מתמידים זהים גנטית לקינס הרגישים לאנטיביוטיקה שלהם, והישרדותם יוחסה לעיכוב גדילה חולף¹. תאים מתמידים התגלו לראשונה על ידי גלדיס^{תחביב 2} אבל המונח שימש לראשונה על ידי ג'וזף ביגר כאשר הוא זיהה אותם בתרבויות פיוגנס סטפילוקוקוס שטופלו פניצילין³. מחקר מכונן שפורסם על ידי Balaban et al.⁴ גילה שני סוגים מתמידים: גרסאות מסוג I הנוצרות בעיקר על ידי מעבר דרך השלב הנייח, וגרסאות סוג II הנוצרות ברציפות במהלך הצמיחה המעריכית. מתמידים מזוהים על ידי מבחני הישרדות ....

פרוטוקול

1. הכנת מדיום צמיחה, פתרון אולוקסאצין ומניות תאי E. coli

1. מדיום לוריא-ברטני רגיל (LB): הוסף 10 גרם/ליטר של טריפטון, 10 גרם/ליטר של נתרן כלורי (NaCl) ו-5 גרם/ליטר של תמצית שמרים במים שעברו דה-יון (DI). לעקר את המדיום על ידי autoclaving.
2. צלחות אגר LB: להוסיף 10 גרם / ליטר של טריפטון, 10 גרם / L של NaCl, 5 גרם / L של תמצית שמרים ו 15 גרם / L אגר במים DI לעקר את המדיום על ידי autoclaving. בטמפרטורה הרצויה (~ 55 מעלות צלזיוס), יוצקים ~ 30 מ"ל של אגר בינוני לתוך צלחות מרובעות (10 x 10 ס"מ). יבש את הצלחות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
3. בינוני LB שונה: להוסיף 10 גרם / ליטר של טריפטון ו 5 g / L של תמצית שמרים במים DI. לעקר את המ....

תוצאות

איור 1 מתאר את הפרוטוקול הניסיוני שלנו. ניסויי מחזור הדילול/צמיחה (ראו פרוטוקול 2) הותאמו ממחקר שערכה קרן ואח'⁵ כדי לחסל את המתמידים שמקורם בתרבויות הלילה. איור 2A הוא תמונה מייצגת של לוחות אגר המשמשים לקביעת רמות CFU של תרביות תאים לפני ואחרי טיפול OFX. בניסויים אלה, תאים היו תרבית במדיום LB שונה עם osmolytes במחצית שטח 96 לוחות באר כמתואר בשלב 4.2. לאחר דגירה של הצלחת בשייקר מסלולי במשך 24 שעות, ההסתעפות המתמשכת בוצעה באמצעות צלחת גנרית.......

דיון

תפוקה גבוהה מתמיד assay המתואר כאן פותחה כדי להבהיר את ההשפעות של כימיקלים שונים על התמדה E. coli. בנוסף ללוחות PM מסחריים, microarrays ניתן לבנות באופן ידני כמתואר בשלב 4.2. יתר על כן, הפרוטוקול המוצג כאן הוא גמיש והוא יכול לשמש כדי לסנן microarrays אחרים, כגון לוחות סמים וספריות תאים, כי הם 96 פורמטים צלחת היטב. ניתן להתאים את התנאים הניסיוניים הכוללים את שלב הגדילה, קצב החיסון והבינוני לבדיקת ספריות אלה. לדוגמה, אם אחד רוצה להקרין ספריית תאים, כגון Keio E. coli אוסף נוקאאוט²³,.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מבחנה 14 מ"ל	פישר סיינטיפיק	14-959-1B
זן E. coli MG1655		פרינסטון	מושג ממעבדת Brynildsen
צלחת שטוחה עם 96 בארות	ארה"ב Scientific	5665-5161
קרום איטום חדיר גז	VWR	102097-058	מעוקר על ידי קרינת גמא וללא ציטוטוקסינים
אזור צלחת שטוחה עם תחתית 96 בארות	VWR	82050-062
LB אגר	פישר סיינטיפיק	BP1425-2	גנטיקה מולקולרית בדרגה
מלח אופלוקסצין	VWR	103466-232	HPLC ≥ 97.5
מיקרו-מערך פנוטייפ (PM-9 ו-PM-10)	ביולוג	N/A	PM-9 ו-PM-10 הכילו אוסמוליטים ומאגרים שונים בהתאמה
צלחת 96 בארות עגולה תחתונה	ארה"ב סיינטיפיק	5665-0161
נתרן כלורי	פישר סיינטיפיק	S271-500	נתרן חנקתי מוסמך ACS בדרגת ACS
		AC424345000
נתרן ניטריט	פישר סיינטיפיק	AAA186680B	98% טוהר
צלחת פטרי מרובעת	פישר סיינטיפיק	FB0875711A
טריפטון	פישר סיינטיפיק	BP1421-500	גנטיקה מולקולרית בדרגה
Varioskan lux multi mode microplate reader	Thermo Fisher Scientific	VLBL00D0	משמש למדידת צפיפות אופטית ב 600 ננומטר
תמצית שמרים	פישר סיינטיפיק	BP1422-100	כיתה גנטיקה מולקולרית

אוניברסיטת חצי צלחות