חקירת תפקוד גן המטרה במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40 באמצעות טכנולוגיות מבוססות CRISPR/Cas9

Sean Graham; Lei Gao; Rui Wang

doi:10.3791/61618

מאמר שיטה

חקירת תפקוד גן המטרה במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40 באמצעות טכנולוגיות מבוססות CRISPR/Cas9

DOI:

10.3791/61618

⸱

2 ביוני 2021

Sean Graham¹ , Lei Gao¹ , Rui Wang¹

¹AbbVie, Cambridge Research Center

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה להפיל גן מעניין במערכת החיסון באמצעות טכנולוגיות מבוססות אנדונוקלאז הקשור ל-CRISPR (CRISPR)/CRISPR (Cas9) והערכה של עכברים אלה במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים על ידי אשכול של התמיינות 40 (CD40).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת החיסון מתפקדת כדי להגן על בני אדם מפני פולשים זרים כמו חיידקים ווירוסים. עם זאת, הפרעות במערכת החיסון עלולות להוביל לאוטואימוניות, מחלות דלקתיות וסרטן. מחלות המעי הדלקתיות (IBD) - מחלת קרוהן (CD) וקוליטיס כיבית (UC) - הן מחלות כרוניות המאופיינות בדלקת מעיים חוזרת. למרות שמחלת המעי הדלקתית נפוצה ביותר במדינות המערב (1 ל-1,000), שיעורי האירועים עולים ברחבי העולם. באמצעות מחקרי אסוציאציה, חוקרים קישרו מאות גנים לפתולוגיה של IBD. עם זאת, הפתולוגיה המשוכללת מאחורי IBD והמספר הגבוה של גנים פוטנציאליים מציבים אתגרים משמעותיים במציאת המטרות הטיפוליות הטובות ביותר. בנוסף, הכלים הדרושים לאפיון תפקודי של כל קשר גנטי מציגים גורמים מגבילים רבים כגון יצירת עכברים מהונדסים גנטית עבור כל גן. כדי לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של גני המטרה, פותחה מערכת מודל המשתמשת בטכנולוגיות מבוססות אנדונוקלאז הקשור ל-CRISPR (CRISPR)/CRISPR (Cas9) ואשכול של נוגדנים אגוניסטיים התמיינות 40 (CD40). המחקר הנוכחי מראה כי ניתן להשתמש בעריכה בתיווך CRISPR/Cas9 במערכת החיסון כדי לחקור את ההשפעה של גנים in vivo. מוגבלת לתא ההמטופויאטי גישה זו עורכת באופן אמין את מערכת החיסון המחודשת המתקבלת. עכברים שנערכו ב-CRISPR/Cas9 נוצרים מהר יותר והם הרבה פחות יקרים מעכברים מסורתיים מהונדסים גנטית. יתר על כן, לעריכת CRISPR/Cas9 של עכברים יש יתרונות מדעיים משמעותיים בהשוואה לייצור וגידול עכברים מהונדסים גנטית, כגון היכולת להעריך מטרות קטלניות עובריות. תוך שימוש ב-CD40 כמטרה מודל במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40, מחקר זה מדגים את ההיתכנות של גישה זו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלות אוטואימוניות מתייחסות למצבים שבהם מערכת החיסון של המטופל תוקפת את התאים והאיברים שלו, וכתוצאה מכך דלקת כרונית ונזק לרקמות. כמעט 100 סוגים שונים של מצבים אוטואימוניים תוארו עד כה, המשפיעים על 3-5% מאוכלוסיית האדם¹. רבים מהמצבים האוטואימוניים, כולל זאבת אדמנתית מערכתית ו-IBD, חסרים טיפולים יעילים ומציגים צרכים רפואיים משמעותיים שלא נענו. כיום משפיעה על כ-1.5 מיליון אנשים בארה"ב לבדה, IBD היא מחלה הרסנית המאופיינת בדלקת מעיים מתקדמת, מתמשכת וחוזרת ללא תרופה זמינה. יש צורך בחשיפת הפתוגנזה והפתופיזיולוגיה הבסיסית כדי לספק את אסטרטגיות הטיפול והמניעה החדשות שחולי IBD זקוקים להן ^2,3.

למעלה מ-230 מיקומים שונים של IBD זוהו באמצעות ניתוחי אסוציאציות כלל-גנומיים (GWAS)⁴. למרות שהאסוציאציות הללו הבהירו גנים חדשים שהם שחקנים חשובים פוטנציאליים במנגנונים ובמסלולים העיקריים של IBD, רק כמה גנים ממיקומים אלה נחקרו. חלק מהגנים היו מעורבים במסלולים ספציפיים. לדוגמה, מסלול חישת החיידקים נקשר לחלבון 2 המכיל אוליגומריזציה קושרת נוקלאוטידים (NOD2); מסלול האוטופגיה נקשר ל-16 הקשורים לאוטופגיה כמו 1 (ATG16L1), משפחת GTPase M הקשורה לחסינות (IRGM) ומשפחת תחום גיוס קספאז 9 (CARD9); והמסלול הפרו-דלקתי נקשר לתגובות תאי T מונעות אינטרלוקין (IL)-23⁴. מודלים שונים של עכברים in vivo שימשו לאפיון פונקציונלי של גנים שזוהו באמצעות GWAS ^5,6.

אחד המודלים המרכזיים המשמשים לחקר פתוגנזה של IBD ^7,8 הוא מודל CD40 של קוליטיס, הגורם לדלקת מעיים חיסונית מולדת לאחר הזרקת נוגדן אגוניסטי CD40 לעכברים חסרי חיסון (תאי T ו-B). משמש בעיקר לבחינת התרומה של חסינות מולדת להתפתחות IBD, בעיקר מקרופאגים ותאים דנדריטיים⁹, לא ברור אם ניתן לגרום למחלה בעכברים מסוג בר (WT) בעלי יכולת חיסונית מלאה. בנוסף למודלים של בעלי חיים, נדרשים גם כלים ספציפיים לגנים לאפיון תפקודי של גן, כולל תרכובות כימיות ותרופות ביולוגיות. חשוב מכך, בעלי חיים מהונדסים גנטית חיוניים לחשיפת תפקודו של גן מסוים. עם זאת, האסטרטגיות המשמשות בדרך כלל לייצור הזרקה והשבחה של עכברים מהונדסים גנטית - נמשכות לעתים קרובות יותר משנה וכרוכות בעלות כספית משמעותית. תהליך מגביל קצב זה מהווה אתגר משמעותי במסע להבהיר את התפקודים של הגנים הקשורים ל-IBD שזוהו על ידי GWAS.

הפרוטוקול המוצג כאן מספק אלטרנטיבה בת קיימא לגידול עכברים מהונדסים גנטית. ראשית, כפי שמוצג באיור 1 , תאי טירוזין קינאז חיוביים לאנטיגן 1, קולטן טירוזין קינאז חיובי לערכת (שושלת-Sca1+c-Kit+ או LSK) מבודדים ממח העצם של עכברי נוקין Cas9 (KI) הנושאים אלל ספציפי (CD45.2) כדי לאפשר מעקב אחר תאי חיסון של תורם. לאחר מכן, תאים אלה נחשפים ללנטי-וירוסים הנושאים RNA מנחים שונים (gRNAs) ולסמן פלואורסצנטי, חלבון פלואורסצנטי ירוק מעורר סגול (VexGFP), כדי לאפשר מעקב אחר תאים מותמרים. יומיים לאחר מכן, תאי VexGFP+ ממוינים ומוזרקים לעכברי Ly5.1 Pep Boy המוקרנים באופן קטלני, שהם עכברי C57Bl/6 הנושאים את האלל CD45.1 כדי לאפשר מעקב אחר תאי מערכת החיסון של המקבל. שנים עשר שבועות לאחר מכן, מערכת החיסון נבנתה מחדש במלואה, וניתן לרשום את העכברים למודלים in vivo.

בנוסף ליתרון של חיסכון בעלויות וזמן ייצור מהיר יותר בהשוואה לדור וגידול של בעלי חיים מהונדסים גנטית, מתודולוגיה זו אידיאלית למטרות קטלניות עובריות, מכיוון שהיא מכוונת ספציפית לתא ההמטופויאטי יתר על כן, עבור מטרות בהן אין כלים זמינים, כגון נוגדן, מערכת זו מספקת גישה ישימה. לסיכום, כדי להתמודד עם האתגרים שתוארו עד כה, פותחה פלטפורמת עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 in vivo כדי ליצור במהירות מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטית 10,11,12,13,14. מחקר זה מדגים כי דלקת מעיים בעכברי WT C57Bl/6 יכולה להיגרם על ידי נוגדן אגוניסטי CD40. CD40 הוא מווסת מרכזי של מחלות במודל זה ולכן שימש כמטרה מודל לאימות הנוקאאוט מבוסס CRISPR/Cas9 ואובדן תפקוד הגנים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים בהתאם לפרוטוקול זה חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי AbbVie IACUC.

1. יצירת נגיפי לנטי נדרשים ורכש של בעלי חיים תורמים ומקבלים

הערה: טבלת החומרים כוללת פרטי מקור ומספר הזמנה עבור כל בעלי החיים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

בנה את הפלסמידים באמצעות וקטור lentiGuide-puro ששונה ל-VexGFP או mCherry.
1. שיבוט ה-gRNA המקושקש שאינו מכוון (SgNone) או ה-gRNA המכוון ל-CD40 לתוך הווקטור ששונה.
  הערה: במחקר זה, הרצפים עבור כל gRNA היו כדלקמן: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; ו-SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
2. לייצר את החלקיקים הלנטי-ויראליים כפי שתואר קודם לכן¹⁵.
  1. העברה משותפת של הפלסמידים המקודדים ל-gRNA לתאי 293T עם פלסמידים של אריזות VSV-G ו-pLEX.
  2. שנו את מדיום התרבית לאחר 18 שעות של טרנספקציה, ואספו את הסופרנטנטים המכילים את הנגיף לאחר 24-48 שעות לאחר שינוי המדיום.
  3. כדי להעריך את יעילות CD40 gRNA, צור קו תאים יציב CD40 293T על ידי טרנספקציה של פלסמיד pcDNA3.1 המקודד ל-CD40.
3. העבירו את התאים באמצעות ה-lentiviruses המתוארים, והעריכו אותם על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) שבועיים לאחר מכן.
  הערה: עכברי Cas9 KI שימשו כעכברים תורמים. ודא שעכברי Cas9 KI נמצאים על רקע C57Bl/6 (ומבטאים את האלל CD45.2) בעת שימוש בעכברי C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy (המבטאים את האלל CD45.1) כנמענים, כך ש-GvHD נמנע וכדי לעקוב אחר תאים תורמים ומקבלים.
תכננו את הניסוי. עבור נוקאאוט של גנים (KO), השתמש ב-3-6 gRNAs לכל גן. עבור כל gRNA, הכינו 20% עכברים מושתלים נוספים כדי לקחת בחשבון אובדן בעלי חיים במהלך ההשתלה ולאחריה.
הערה: מודל הקוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40 דורש מינימום של 8 עכברים לקבוצה לצורך הפעלה סטטיסטית. לפיכך, 10 עכברים לכל gRNA הוכנו במחקר זה. מספר העכברים הדרושים לדגמי in vivo אחרים ישתנה בהתאם לדגם בו נעשה שימוש.
השתמש בעכברים מאותו מין תורם ומקבל בגילאי 8-12 שבועות.
הערה: עכברים הומתו על פי הנחיות IACUC שאושרו תוך שימוש במינימום 5% איזופלורן ואושרו עם פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית.

2. קצירת מח עצם והכנה למיון תאים

בעזרת מלקחיים ומספריים, קצרו עצמות מכל עכבר תורם (עצם הירך, השוקה, עצם הזרוע והאולנה), והסירו בזהירות כמה שיותר שריר/רקמה.
נקב את החלק התחתון של צינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.6 מ"ל עם מחט של 23 גרם, והנח את הצינור בתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הכינו 2 סטים לכל חיה.
חותכים קצה אחד של העצמות פתוח, ומניחים 4-8 עצמות בתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה עם קצוות פתוחים הפונים לכיוון חור המחט 23 G.
הערה: מספר העצמות בכל צינור תלוי בעצם, למשל, 8 עצם השוקה, עצם הזרוע והאולנה או 4 עצם הירך יתאימו.
צנטריפוגה את הצינורות (עם צינור המיקרו-צנטריפוגה 0.6 מ"ל המכיל את העצמות בתוך צינור הצנטריפוגה של 1.5 מ"ל) ב-300 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
השליכו את צינור המיקרו-צנטריפוגה של 0.6 מ"ל, המכיל כעת עצמות ללא מח, והשאירו רק את צינור הצנטריפוגה של 1.5 מ"ל מלא כעת במח. הוסף 1 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים (המכיל אמוניום כלוריד) לכל צינור צנטריפוגה, והשהה מחדש את גלולת התא על ידי פיפטינג. דגירה ב- RT למשך דקה. חזור על שלב הליזיס במידת הצורך.
העבירו את תרחיף התא לצינור חרוטי של 50 מ"ל, והוסיפו את תמיסת המלח הפוספטית של Dulbecco (DPBS) ללא סידן ומגנזיום (לפחות כפול מנפח תרחיף התא) כדי לנטרל את מאגר הליזיס. תאי גלולה במשקל 300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.
טען מסנן של 70 מיקרומטר על צינור חרוטי של 50 מ"ל, וסנן את התאים דרכו, באמצעות DPBS כדי לשטוף את הצינור והמסנן. השליכו את המסנן וספרו את התאים.
הערה: שימוש ב-30 עכברים תורמים (בני 12 שבועות) יניב 200-300 ×-^10-6 תאים בממוצע.

3. מיון תאים לבידוד תאי LSK לצורך התמרה

השעו מחדש את התאים שנספרו בשלב 2.7 במאגר מיון תאים מגנטיים (MACS) (DPBS, 2 מ"מ חומצה אתילנדיאמין טטראצטית, 0.5% אלבומין בסרום בקר, 10 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין) בנפח הרצוי (90 מיקרוליטר לכל 10⁷ תאים).
הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזי CD117+ לכל 10⁷ תאים. מערבבים היטב, מגנים מפני אור ודוגרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
הכן את עמודת MACS LS על ידי הצבת העמודה בשדה המגנטי ושטיפתה עם מאגר MACS.
שטפו את התאים משלב 3.2 עם נפח מתאים של מאגר MACS (לפחות כפול מהנפח שלכם), וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות.
שאפו את הסופרנטנט לחלוטין. השעו מחדש את הגלולה כך שהריכוז הסופי יהיה 10⁸ תאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS.
החל את מתלה התא על עמודת ה- LS. שטפו עם 3 פעמים עם 3 מ"ל של מאגר MACS.
הערה: עמודת LS אחת יכולה להכיל עד 10⁸ תאים עם תוויות ו- 2 × 10⁹ תאים בסך הכל.
הסר את העמוד מהמפריד המגנטי והנח אותו בצינור איסוף מתאים. הוסף 5 מ"ל של מאגר MACS, ושטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי דחיפה חזקה של הבוכנה לתוך העמודה.
גלולה את התאים בחום של 300 × גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.
השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר MACS לכל 10⁷ תאים, והוסיפו את הנוגדנים לצביעה לשושלת (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) ו-Sca-1.
הערה: שימוש ב-30 עכברים תורמים (בני 12 שבועות) יניב 100-180 ×-^10-6 תאים בממוצע.
מערבבים היטב, מגנים מפני אור ודוגרים בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
שטפו את התאים על ידי הוספת 5-10 מ"ל של מאגר MACS, וצנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.
השעיה מחדש עד 10⁸ תאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS
סנן את התאים עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר, ובצע FACS עבור אוכלוסיית שושלת-Sca1+.
הערה: כ-1.8-2.6% מהאוכלוסייה צריכים להיות שושלת-Sca1+.
אסוף את התאים במדיום תרבית LSK (100 מיקרוליטר לכל 10,000 תאים): מדיום התפשטות ללא סרום, 100 ננוגרם/מ"ל טרומבופויטין, גורם תאי גזע של עכבר, טירוזין קינאז 3 ליגנד הקשור ל-Fms, ו-IL-7 עם 100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.
תאי גלולה במשקל 300 × גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.

4. התמרה ותרבית LSK ליצירת תאי בקרה ונוקאאוט

השעו מחדש את התאים במדיום תרבית LSK.
זרע 10,000 תאים לבאר בלוחות תרבית רקמה שטוחה (TC) של 96 בארות במדיום תרבית LSK.
דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 ו-95% לחות בתנאים אספטיים.
הכן תמיסת רטרונקטין של 50 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS, והוסף 300 מיקרוליטר לכל באר של צלחת פוליסטירן 24 בארות שאינה מטופלת ב-TC. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
למחרת, השליכו את תמיסת הרטרונקטין, שטפו את הצלחת המצופה ב-300 מיקרוליטר DPBS וחזרו על הפעולה.
העבר 50,000 תאי LSK ב-500 מיקרוליטר של מדיום (5 בארות מלוח 96 הבארות בשלב 4.2) לכל באר מצופה רטרונקטין של צלחת הפוליסטירן בת 24 הבארות משלב 4.4.השתמש ב-100 מיקרוליטר נוספים של מדיום LSK לכל 5 בארות כדי לשטוף ולאסוף את כל התאים הנוספים שנותרו בצלחת 96 הבארות. ודא ש-600 מיקרוליטר הוא הנפח לבאר בצלחת 24 הבארות לאחר שלב זה (5 × 100 מיקרוליטר בארות מצלחת 96 בארות + 100 מיקרוליטר המשמשות לשטיפת 5 הבארות הללו).
הערה: לאחר ההעברה, הסתכל במיקרוסקופ על צלחת 24 הבארות הריקה כעת כדי לאשר שכל התאים נאספו. השתמש במדיום LSK כדי לאסוף תאים שלא הועברו כדי למזער את אובדן התאים מאוכלוסייה קטנה זו.
הוסיפו 300 מיקרוליטר של חומר וירוס לכל באר, ונערו את הצלחת בערך מוגדר של 500 למשך 5 דקות. סובבו את הצלחת בחום של 600 × גרם ו-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. השתמש לפחות ב-5 ×-^10-6 חלקיקים נגיפיים למ"ל.
הערה: במחקר זה, נעשה שימוש בווקטור שונה מ-pLentiPuro, שבו אלמנט ההתנגדות לפורומיצין הוחלף ל-VexGFP. הנגיף נוסף בריבוי הדבקות של 50-100.
דגירה למשך שעה. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום LSK מחומם מראש.
דגירה למשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ ו-95% לחות בתנאים אספטיים.

5. הקרנה לבעלי חיים כהכנה להשתלת תאי גזע מתורם

לאחר יומיים של דגירה, יש להקרין את בעלי החיים הנמענים ב-475 cGy פעמיים במרווח של 4 שעות. לאחר סבב ההקרנה השני, הכניסו את בעלי החיים לכלובים אוטוקלבים, והתייחסו אליהם כבעלי חיים חסרי חיסון למשך 12 שבועות. העכברים קיבלו העשרה, הידרוג'ל וניטור צד הכלוב כדי לספק טיפול תומך והתערבות לפי הצורך. עכברים עשויים לקבל מזון או מים אנטיביוטיים בנוסף לשיטות טיפול והתערבות תומכות.
הערה. מינוני ההקרנה עשויים להיות שונים עם רדיאטורים שונים. בצע טיטרציה של מינון של הרדיאטור כדי לזהות את המינון הטוב ביותר. מינונים בין 700 ל-1300 cGy עבור עכברי C57Bl/6 נמצאו יעילים בדוגמאות ספרות שונות¹⁷. בחר 3-4 מנות בטווח זה, והעריך 5 עכברים למנה להישרדות והשתלה. אם ההשתלה לא מוצלחת או שמינון הקרינה גבוה מדי, עכברים לא יחיו מעבר ל-3 שבועות לאחר ההשתלה. לאחר 4 שבועות לאחר ההשתלה, יש לדמם את העכברים ששרדו כדי להעריך את ההשתלה על ידי FACS. אנו מבצעים איסוף דם רטרו-אורביטלי (RO) של ~50-100 מיקרוליטר לעכבר כדי להעריך את ההשתלה. העכברים היו תחת הרדמה (2-3% איזופלורן) במהלך האיסוף וקיבלו חומר סיכה לעיניים ותמיסת מלח תת עורית של 1.0 מ"ל כטיפול תומך לאחר איסוף דם RO.

6. הכנת תאים והזרקה לבעלי חיים מושתלים מוקרנים

הוצא את התאים מכל באר משלב 4.9, תוך שמירה על הקבוצות נפרדות כעת לאחר שהתאים עברו התמרה עם gRNAs שונים, וגלולה אותם ב-300 × גרם למשך 10 דקות.
השעו מחדש את התאים במאגר MACS, סנן עם מסננת של 70 מיקרומטר ומיין את אוכלוסיית VexGFP+.
הערה: כ-10-15% מהתאים צריכים להיות VexGFP+.
גלולה את התאים בחום של 300 × גרם למשך 10 דקות. השעו אותם בתמיסת המלח המאוזנת של האנק: 5,000 תאים או יותר לעכבר ב-200 מיקרוליטר.
הערה: HBSS אינו באיכות פרמצבטית. אתה יכול גם לשקול להשתמש במי מלח סטריליים באיכות פרמצבטית להזרקה.
יש להזריק את התאים לווריד 3 שעות לאחר מנת ההקרנה האחרונה.
הערה: שנים עשר שבועות לאחר מכן, לעכברים תהיה מערכת חיסון מושתלת במלואה וניתן יהיה לרשום אותם למודלים in vivo.

7. מודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40 בעכברים מסוג בר

הערה: שקלו והעריכו את בעלי החיים מדי יום. לספק טיפול תומך לפי הצורך: 1.0 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי תת עורית בירידה של 10% במשקל או אם הם מיובשים. הבקרה החיובית למודל זה היא אנטי-p40 במינון תוך-צפקי של 25 מ"ג/ק"ג פעמיים בשבוע החל מהיום הראשון.

הערה: במחקר זה, קבוצות הניסוי כללו קבוצות ביקורת נאיביות, ביקורת רכב (שלילית) וקבוצות ביקורת נגד p40 (חיובי). יחד, קבוצות אלה שולטות בהתנהגות הנורמלית של מודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40. קבוצות וקטור, SgNone ו-SgRNA: בקרות הווקטור עבור הווקטור הלנטי-ויראלי הנפוץ, SgNone הוא בקרת מדריך מקושקשת שאינה ממוקדת, וקבוצות ה-SgRNA הן קבוצות ה"טיפול" הנושאות ביטוי מופחת של ה-gRNA המטרה.

יום 0: הזרקת נוגדן אגוניסטי CD40 במינון 10 מ"ג/ק"ג תוך צפקי ב-DPBS לכל בעלי החיים למעט בקרה נאיבית.
ימים 3 ו-6: בצע אנדוסקופיה בווידאו כדי להעריך את התקדמות המחלה כפי שתואר קודם לכן¹⁶.
1. להרדים את העכברים עם 2-3% איזופלורן. לספק תמיכה תרמית באמצעות מנגנון מכונת הרדמה פנימית ו/או כרית חום חיצונית במהלך ההתאוששות.
2. לאחר שהעכברים נמצאים תחת הרדמה, יש לתת חוקן DPBS (ללא סידן ומגנזיום) כדי להכין את המעי הגס לאנדוסקופיה.
  הערה: נדרשים כ-1-2 מ"ל לביצוע חוקן.
3. לאחר חוקן ובזמן הרדמה, העבר את העכבר לקונוס האף של מכונת ההרדמה.
4. הכנס בעדינות את האנדוסקופ למעי הגס, התקדם לאט למעי הגס הפרוקסימלי תוך שמירה על המצלמה במרכז והמעי הגס מנופח באוויר (באמצעות משאבת האוויר המצורפת או חבר צינור/מזרק לניפוח ידני), ואז משוך לאט את האנדוסקופ ואסוף סרטון ותמונות במרחק של 3 ס"מ, 2 ס"מ ו-1 ס"מ מפי הטבעת.
  הערה: כדי למזער את הגירוי של המעי הגס, ניתן להוסיף חומר סיכה סטרילי לקצה האנדוסקופ.
5. ציין כל תמונה בנפרד על סמך דפוס כלי הדם ועיבוי הרירית כמתואר בטבלה 1. שלב את הציונים מ-3 התמונות לכל עכבר כדי להקצות ציון סכום לכל חיה.
יום 7: המתת חסד של כל העכברים על ידי מנת יתר של איזופלורן או תא CO₂ , ואיסוף כמה שיותר דם על ידי ניקוב לב לסרום. שקלו את הטחול כדי למדוד טחול ואספו לזרימה ציטומטרית, ואספו את המעי הגס להיסטופתולוגיה.
הערה: קטעי רקמה קבועים בפורמלין ומשובצים בפרפין של המעי הגס של העכבר הוכנו ושימשו לאימונוהיסטוכימיה (IHC) כפי שתואר בעבר על ידי וואנג ואחרים¹⁹.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בעקבות ההליך שתואר לעיל, נוצרו עכברים המבטאים gRNA ממוקד CD40. בשבוע השני, תאי B, מקרופאגים CD11b+ ותאים דנדריטיים CD11c+ (DCs) הושתלו (איור 2). עם זאת, לתאי T, כצפוי בהתבסס על ספרות קודמת¹⁸, לקח זמן רב יותר להשתלה מלאה ונדרשו 12 שבועות לאחר ההשתלה כדי להגיע ל~90% (איור 2). לאיברי חיסון, כמו הטחול ובלוטות הלימפה, הייתה האוכלוסייה הבולטת ביותר של תאים שמקורם בתורם; אולם איברים אחרים כולל הכבד, הריאות והמעי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות המוצגות כאן מציגות פלטפורמת עריכת גנום חדשה מבוססת CRISPR/Cas9 המסוגלת לחקור את תפקוד הגנים במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40. מיון התאים העשיר את מאגר תאי ה-LSK המהונדסים גנטית, וכתוצאה מכך הפחתה של למעלה מ-90% בביטוי CD40 בקרב בעלי החיים ששוחזרו - תוך 4 חודשים בלבד. יתר על כן, לביטוי המופחת של CD40 במערכת החיסון הייתה השפעה עמוקה במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40, מה שהפחית משמעותית את נקודות הקצה של המחלה. על בסיס תוצאות אלו הוקמה פלטפורמה מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התכנון, ביצוע המחקר והתמיכה הכספית למחקר זה סופקו על ידי AbbVie. AbbVie השתתפה בפרשנות הנתונים, בסקירה ובאישור הפרסום. המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תודה לרוקי פנג, דונה מקארתי, ג'יימי אריקסון, ליז אוקונור, רוברט דאנסטן, סוזן ווסטמורלנד וטאריק גיור על מאמציכם לתמוך בעבודה זו. תודה למנהיגי הפרמקולוגיה כולל ראג'ש קמאת' ואחרים על מנהיגותם בהקמת מודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40 בעכברי WT C57Bl/6. בנוסף, תודה לכל אלה במרכז המחקר הביולוגי של AbbVie ובמרכז המחקר של קיימברידג' במחלקה המזרחית לרפואה השוואתית התומכים בניסויים in vivo.

אנו רוצים להודות למעבדת Zhang ממכון ברוד ולמכון מקגוורן לחקר המוח במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס על אספקת ריאגנטים של CRISPR [הנדסת גנום מולטיפלקס באמצעות מערכות CRISPR/Cas. קונג, ל, רן, FA, קוקס, ד, לין ס, בארטו, ר, חביב נ, סו PD, וו X, ג'יאנג וו, מראפיני לוס אנג'לס, ג'אנג פ מדע. 2013 ינואר 3].

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחות תרבית רקמות 6 בארות	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (מאגר ריצה autoMACS)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 ומיקרו; m יחידת מסנן	Millipore	#SLHV013SL
0.6 מ"ל מיקרוצנטריפוגה צינור	axygen	MCT-060-C-S
1.5 מ"ל צינור אפנדורף	Axygen	MCT-150-C-S
15 מ"ל חרוטי	VWR	21008-918
23 גרם מחט	VWR	#305145
24 באר צלחות שאינן TC	פלקון	#351147
24-בארות TC צלחות	Falcon	#353047
50 מ"ל צינור חרוטי	VWR	21008-951
5 מ"ל מזרק	BD Biosciences	#309647
70 µ m מסנן	Miltenyi	#130-098-462
96-Well צלחות תחתונות שטוחות	קורנינג	#3599
96-Well U-Bottom	Plates Corning / Costar	#3365
מכונת הרדמה	VetEquip - COMPAC5	#901812
נוגדן חד שבטי אנטי-CD40 אגוניסט	BioXcell	BE-0016
נוגדן חד שבטי נגד p40	BioXcell	BE-0051
B220 PE נוגדן	BioLegend	#103208
אלבומין סרום בקר	סיגמא אולדריץ'	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 רקע
CD117+ חרוזים	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE נוגדן	BioLegend	#101208
CD3 PE נוגדן	BD Biosciences	#553240
צנטריפוגה	בקמן קולטר	אלגרה 6KR צנטריפוגה
משטח צנטריפוגה	אפנדורף	5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
חומצה טטראצטית אתילנדיאמין (EDTA)	אנדוסקופ Invitrogen	AM9260G
	Karl Storz	N / A	מותאם אישית ציטומטר זרימה של מגדל Coloview
	BD Biosciences	FACS Aria II
הקשור ל- Fms טירוזין קינאז 3 ליגנד (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE נוגדן	BD Biosciences	#553128
תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
סרום בקר עוברי מומת בחום	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
קלסר חממה		#9040-0116
איזופלורן	הנרי שיין	#6679401710
LS טור	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy עכברי	מעבדות ג'קסון	#002014	C57Bl/6 גורם
תאי גזע של עכבר רקע (mSCF)	PeproTech	#250-03
נתרן כלורי (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM מדיה ללא סרום	Invitrogen	#31985-070
פניצילין-סטרפטומיצין (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
שייקר צלחות	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
פוליברין (10 ומיקרו; g/µ L)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
מאגר ליזה של תאי דם אדומים	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Antibody	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 נוגדן	PE eBioscience	#12-5921
תרומבופויטין (TPO)	PeproTech	#315-14
רנטגן אירדיאטור	רנטגן דיוק רנטגן	320

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wang, L., Wang, F. S., Gershwin, M. E. Human autoimmune diseases: a comprehensive update. Journal of Internal Medicine. 278 (4), 369-395 (2015).
Uhlig, H. H., Powrie, F. Translating immunology into therapeutic concepts for inflammatory bowel disease. Annual Review of Immunology. 36, 755-781 (2018).
Gajendran, M., Loganathan, P., Catinella, A. P., Hashash, J. G. A comprehensive review and update on Crohn's disease. Disease-a-Month. 64 (2), 20-57 (2018).
Uhlig, H. H., Muise, A. M. Clinical genomics in inflammatory bowel disease. Trends in Genetics. 33 (9), 629-641 (2017).
Sollid, L. M., Johansen, F. E. Animal models of inflammatory bowel disease at the dawn of the new genetics era. PLoS Medicine. 5 (9), 198(2008).
Jiminez, J. A., Uwiera, T. C., Douglas Inglis, G., Uwiera, R. R. Animal models to study acute and chronic intestinal inflammation in mammals. Gut Pathogens. 7, 29(2015).
Kiesler, P., Fuss, I. J., Strober, W. Experimental models of inflammatory bowel diseases. Cell Molecular Gastroenterology and Hepatology. 1 (2), 154-170 (2015).
Mizoguchi, A. Animal models of inflammatory bowel disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).
Uhlig, H. H., et al. Differential activity of IL-12 and IL-23 in mucosal and systemic innate immune pathology. Immunity. 25 (2), 309-318 (2006).
Dow, L. E. Modeling disease in vivo With CRISPR/Cas9. Trends in Molecular Medicine. 21 (10), 609-621 (2015).
Hochheiser, K., Kueh, A. J., Gebhardt, T., Herold, M. J. CRISPR/Cas9: A tool for immunological research. European Journal of Immunology. 48 (4), 576-583 (2018).
Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
Fellmann, C., Gowen, B. G., Lin, P. C., Doudna, J. A., Corn, J. E. Cornerstones of CRISPR-Cas in drug discovery and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 89-100 (2017).
Yin, H., et al. Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype. Nature Biotechnology. 32 (6), 551-553 (2014).
Bagley, J., Tian, C., Iacomini, J. Prevention of type 1 diabetes in NOD mice by genetic engineering of hematopoietic stem cells. Methods in Molecular Biology. 2008 (433), 277-285 (2008).
Becker, C., Fantini, M. C., Neurath, M. F. High resolution colonoscopy in live mice. Nature Protocols. 1 (6), 2900-2904 (2006).
Duran-Struuck, R., Dysko, R. C. Principles of bone marrow transplantation (BMT): providing optimal veterinary and husbandry care to irradiated mice in BMT studies. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48 (1), 11-22 (2009).
Haynes, B. F., Martin, M. E., Kay, H. H., Kurtzberg, J. Early events in human T cell ontogeny. Phenotypic characterization and immunohistologic localization of T cell precursors in early human fetal tissues. Journal of Experimental Medicine. 168 (3), 1061-1080 (1988).
Wang, R., et al. CRISPR/Cas9-targeting of CD40 in hematopoietic stem cells limits immune activation mediated by anti-CD40. PLoS One. 15 (3), 0228221(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

חקירת תפקוד גן המטרה במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40 באמצעות טכנולוגיות מבוססות CRISPR/Cas9

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים