אנו מציגים שיטה ללא הנדסה גנטית (ללא GM) כדי להשיג תאים עם פנוטיפ עצבי מתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש. הפעלה של מסלול איתות המקושר לחלבון חדשני הקשור ל- GPI אנושי חושפת שיטה יעילה ללא GM להשגת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
הפרעות נוירולוגיות אנושיות רבות נגרמות על ידי ניוון של נוירונים ותאי גליה במוח. בשל מגבלות באסטרטגיות פרמקולוגיות וטיפוליות אחרות, אין כיום תרופה זמינה למוח הפגוע או החולה. החלפת תאים מופיעה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה לתנאים ניווניות. עד היום, תאי גזע עצביים (NSCs) נוצרו בהצלחה מרקמות עובריות, תאים עובריים אנושיים (ES) או תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC). תהליך של דיפרנציה יזם על ידי הפעלה של גליקופרוטאין אנושי חדשני הקשור ל- GPI, המוביל ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטים. תאי גזע פלוריפוטנטים אלה שמקורם בדם (BD-PSCs) מבדילים במבחנה לתאים עם פנוטיפ עצבי כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיה brightfield ו- immunofluorescence. ניתוח אולטרה-מבני של תאים אלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים מאשר את המבנה הפרימיטיבי שלהם, כמו גם מורפולוגיה דמוית נוירונים ומאפיינים תת-תאיים.
מבוא
פיתוח שיטות מחקר בסיסיות ופרה-קליניות של תאי גזע מעודד יישום קליני של טיפולים מבוססי תאי גזע למחלות נוירולוגיות. טיפול פוטנציאלי כזה תלוי באופן קריטי בשיטה ליצירת תאים עצביים אנושיים המובילים להתאוששות תפקודית1.
תאי גזע עצביים (NSCs) מחדשים ומבדילים לנוירונים חדשים לאורך החיים בתהליך הנקרא נוירוגנזה בוגרת. רק אזורי מוח מוגבלים מאוד מכילים NSCs המוכשרים ליצור נוירונים שזה עתה נולדו בבגרות. NSCs כאלה יכולים להוליד נוירונים בוגרים, המעורבים בלמידה ובזיכרון, ובכך להחליף נוירונים אבודים או פגומים. למרבה הצער, NSCs אלה נמצאים בכמויות מוגבלות זה neurogenesis מוגבל פוחתת במהירות במהלך התפתחות לנוער2. לכן, מקורות אחרים של תאים עצביים חייבים להיחשב במטרה טיפול בתא.
מחלות נוירולוגיות ניווניות קשה לרפא באמצעות גישות פרמקולוגיות סטנדרטיות. אסטרטגיות טיפוליות חדשות לאימוץ הפרעות נוירולוגיות רבות שאינן ניתנות לחיסון מבוססות על טיפולים בתחליפי תאים של רקמה חולה ופצועה. השתלת המל"ל יכולה להחליף תאים פגומים ולספק השפעות מועילות. מקורות אחרים להחלפת תאים עצביים כוללים תאי גזע עובריים אנושיים (ESC), הנגזרים ממסת התא הפנימית של הבלסטוציסטות של היונקים3, כמו גם IPSCs4, אשר יש יכולת התחדשות עצמית נרחבת כמו ESCs ומסוגלים להבדיל לתוך שושלות תאים שונות. NSCs יכול גם להיווצר על ידי תכנות מחדש ישיר מפיברובלסטים אנושיים הימנעות מצב pluripotent5.
טיפול בתחליפי תאים הוא עדיין נושא מאתגר. למרות ש- ESC, עוברי או IPS יכולים להיות מקור ליצירת תאים עצביים לטיפול במחלות נוירולוגיות רבות חשוכות מרפא, החלפת תאי SCs למבוגרים אוטולוגיים של רקמות פגומות היא חלופה טובה יותר שעוקפת חששות אימונולוגיים, אתיים ובטיחותיים.
הפעלה של חלבון הקשור ל- GPI אנושי על ידי קישור נוגדנים באמצעות זרחן של PLCγ / PI3K / Akt / mTor / PTEN יוזמת דיפרנציאציה של תאי צאצא דם ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטים שמקורם בדם (BD-PSCs)6. תאים אלה מבדילים במבחנה כלפי תאים עצביים כפי שאושרו באמצעות ניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים בהירה, אימונופלואורסצנטיות ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM).
בעבודה זו אנו מתארים את הדור ללא GM של מחשבי BD-PSCs ואת ההבחנה מחדש המוצלחת שלהם לתאים עם פנוטיפ עצבי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
אישורים אתיים התקבלו בעת ביצוע הניסויים.
1. בידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMNCs)
- ודא שכל התורמים חתמו על הסכמה מדעת לפני נסיגת דם בהתאם להנחיות המוסדיות.
- קח 30 מ"ל של דם מתורמים בריאים על ידי צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.
- בודד מחשבי PBMNCs לפי מדיית מעבר צבע בצפיפות. השתמש 10 מ"ל של מדיה עם 25 מ"ל של דם 1:1 מדולל עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), וצנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 30 דקות.
- בודדו את השכבה הבין-ביזה בין הפלזמה למדיה ההדרגתית בצפיפות על-ידי צנרת. לשטוף את התאים המבודדים עם 5 מ"ל של PBS סטרילי וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות. חזור פעמיים.
- ספירת מספר התאים בשיטות סטנדרטיות באמצעות תא ספירה.
2. הפעלה של גליקופרוטאין מעוגן GPI אנושי על ידי קישור נוגדנים על פני השטח של PBMNCs
- מקם את 6 x 106 תאים מונונוקלאריים (MNCs) בצינורות 15 מ"ל ולבצע שיתוף בין נוגדנים על ידי הדגירה של התאים עם נוגדן ספציפי לחלבון ממברנה הקשור ל- GPI אנושי (30 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 30 דקות ב- PBS עם אלבומין סרום בקר 1% (BSA) ב 37 °C (37 °F).
- החלף מדיום דגירה במדיום Dulbecco המותאם של Iscove בתוספת סרום בקר עוברי 10%.
- לגדל תאים ב 15 mL צינורות פוליסטירן, לשים את הצינורות באינקובטור ב 37 °C ו 5% CO2 במשך 8-10 ימים (ללא רועד). על D5, להוסיף 1-2 מ"ל נוספים של מדיום של Iscove בתוספת עם 10% FBS לכל צינור 15 מ"ל.
3. מיון של תאים שהופקו לאחרונה
- ספירת תאים עם מונה תאים אוטומטי (השעיית תא 18 μL + 2 μL פלואורסצנטיות צבע) או בתא ספירה.
- מתלה תא בתרבית צנטריפוגה (5-7 x 106) ב 300 x g במשך 10 דקות ושאף את supernatant וכתוצאה מכך עם פיפטת פסטר סטרילי.
- להשעות מחדש את גלולה התא ב 90 μL של PBS מקורר מראש pH 7.2, 0.5% BSA ו 2 mM EDTA.
- הוסף CD45 חרוזים מגנטיים בגודל ננו חיובי (80 μL) השעיית התא ודגרה על קרח במשך 15 דקות.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חוצץ PBS צנטריפוגה ב 300 x g במשך 10 דקות.
- להשעות מחדש את התאים ב- 500 μL של מאגר PBS.
- לשטוף את העמודה עם 500 μL של חוצץ PBS מקורר מראש ומניחים אותו בשדה המגנטי.
- מקם את מתלה התא על העמודה ולשטוף אותו עם 500 μL של מאגר PBS (פעמיים) ואת זרימת הצנטריפוגה המכילה CD45 תאים שליליים. לאסוף אותם במדיום של Iscove בתוספת עם 1% BSA.
- תספור את התאים בתא הספירה.
4. הכנת מנות תרבית תאים לבידול עצבי של תאי גזע חדשים שנוצרו
- מצופים את כלי התרבות עם פולי-L-אורניתין ולמינין לגידול תאים עצביים.
- מניחים את כיסויי הזכוכית בצלחות 4-well ומצופה אותו עם 1:5 פולי-L-אורניתין מדולל (0.1 מ"ג / מ"ל ב ddH2O) ב ddH2O. מניחים את כיסויים לתוך אינקובטור 37 °C במשך 1 שעה. ואז לשטוף עם ddH2O.
- מפשירים לאט למינין (0.5-2.0 מ"ג/מ"ל) ומוסיפים לראש כיסויים. לדגור אותו ב 37 °C (55 °F) במשך 2 שעות.
- הכן אינדוקציה עצבית בינוני N2 המורכב 49 מ"ל של D-MEM / F12, 500 μL של תוספת N2, 400 μL של חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA), פתרון FGF בסיסי בריכוז סופי 20 ננוגרם / מ"ל (מוכן מ 100 תמיסת מלאי מיקרוגרם / מ"ל), והפרין בריכוז סופי 2 ng / mL.
- הסר למינין עודף על ידי pipetting ולהוסיף N2 בינוני עצבי מנות תרבות.
5. פולחן של תאי דם נוירונים מפוזרים
- תרבית BD נגזר CD45 תאים שליליים על למינין / אורניתין מצופה מכסה במשך יומיים באינקובטור ב 37 °C (5% CO2 במדיום N2 ליזום בידול עצבי של תאים חדשים שנוצרו על ידי BD.
- תאי תרבות עוד יותר במדיום בידול עצבי המורכב 48 מ"ל של בינוני Neurobasal, 500 μL של L-גלוטמין, 1 מ"ל של תוספת B27, 500 μL של NEAA, 50 μL של גורם נוירוטרופי גליה אנושי רקומביננטי (GDNF) ב 5 מיקרוגרם / 250 μL ב PBS / 0.1% BSA, ו 50 μL של המוח האנושי רקומביננטי נגזר גורם נוירוטרופי (BDNF) ב 5 מיקרוגרם / 200 μL ב PBS / 0.1% BSA ו 50 μL של פתרון חומצה אסקורבית 2.9 גרם / 50 מ"ל ב- PBS. מניחים צלחות באינקובטור ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
6. ניתוח מיקרוסקופיה חיסונית של תאים עצביים שמקורם בדם
- תרבית את התאים כמתואר לעיל במשך 16 ימים ולהסיר את המדיה.
- דגירה עם קיבוע מחמם מראש המורכב 75 מ"ל של מים סטריליים, 4 גרם של paraformaldehyde. מוסיפים 10 N NaOH לפי הצורך ומערבבים עד שהפתרון מתפנה. לאחר מכן להוסיף 10 מ"ל של 10x PBS, 0.5 מ"ל של MgCl2, 2 מ"ל של 0.5 M EGTA, ו 4 גרם של סוכרוז. טיrate ל- pH 7.4 עם 6 N HCl, ולהביא ל 100 מ"ל של מים סטריליים במשך 15 דקות, על פי Marchenko ואח'7.
- להשליך את הקיבעון ולשטוף את התאים 3 פעמים במשך 5 דקות בכל פעם. הוסיפו מיד תמיסה טריה של טריטון X 0.3% וחלחלו לתאים למשך 5 דקות. יש לשטוף 3 פעמים עם PBS ולהוסיף פתרון חסימה שנעשה על ידי PBS ו- 5% BSA.
- לחסום את התאים בטמפרטורת החדר על צלחת רוקר במשך שעה אחת.
- הכן דילול מתאים של נוגדנים ב 1% BSA / PBS ודגר את התאים עם דילול נוגדנים על צלחת רוקר במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד, לדגור על התאים עם DAPI ולהעלות את כיסויים עם מדיה הרכבה להדמיה על מיקרוסקופ.
הערה: נוגדנים המסומנים ישירות המשמשים בניסוי זה מפורטים בטבלת החומרים.
7. ניתוח מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור של תאים שנוצרו לאחרונה
- זרע את התאים עבור TEM בשקופיות תא 8-well.
- תקן את התאים ב 3.5% גלוטרדהיד עבור 1 שעות ב 37 °C (55 °F), לאחר תיקון ב 2% OsO4 במשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר וכתם 2% אצטט אורניל בחושך ב 4 °C (50 °F) במשך 2 שעות 30 דקות.
- לבסוף, לשטוף את התאים במים מזוקקים, לייבש אותו באתנול ולהטביע שרף אפוקסי לילה. למחרת להעביר את הדגימות לתנור 70 מעלות צלזיוס עבור 72 שעות עבור התקשות שרף.
- נתק את תרביות התא המוטבעות מהשקופית התאית והדבק לבלוקי ארלדיט.
- חותכים מקטעים טוריים דקים למחצה (1.5 מיקרומטר) עם מכונה, נטענים על מגלשות זכוכית ומכתימים קלות עם כחול טולואידין 1%.
- הדבק מקטעים דקים למחצה בחרו לבלוקי ארלדיט וניתקו אותם ממגלשת הזכוכית על ידי הקפאה חוזרת (בחנקן נוזלי) והפשרה.
- הכן מקטעים דקים במיוחד (0.06-0.08 מיקרומטר) עם מכונה וניגודיות נוספת עם ציטוט עופרת.
- השג מיקרוגרפים באמצעות מיקרוסקופ סריקת אלקטרונים עם מצלמה דיגיטלית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התוצאות מספקות ראיות לכך ששיטה חדשנית זו ללא GM מסוגלת להחזיר תאי אבות דם למצבם הפרימיטיבי ביותר מבלי לפעול ישירות על הגנום האנושי.
הוכחנו בעבר כי קישור נוגדנים ספציפי לחלבון הקשור ל- GPI יוזם באמצעות PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation של גנים רלוונטיים התפתחותית שמורים מאוד כגון WNT, NOTCH ו- C-Kit, ובכך יוזםתהליךשל דיפרנציה שמוביל לשלב הראשון ליצירת HSCs ושני ואחרון לדור של BD-PSCs 6,8.
תרביות M...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטת התמנות מחדש של תאים אנושיים המתוארים בעבודה זו מבוססת על הפעלה ממברנה לגרעין של מכונות איתותים מאחורי גליקופרוטאין הממברנה האנושית הקשורה ל- GPI היוזמת את תהליך הדיפרנציאציה המובילה ליצירת ex vivo והרחבת מחשבים מתחדשים עצמית המתקבלים מדם היקפי אנושי שאינו מניפולציה. תאים אלה כאשר מתורבתים במדיה המתאימה מסוגלים להבדיל מחדש לתאים השייכים לשכבות נבט שונות6.
הנתונים המוצגים בעבודה זו מראים כי תאי BD-PSCs שנוצרו ללא GM כאשר תרבית במדיה בידול עצבי רכש פנוטיפ שונ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברת המקבילה מצהירה כי היא מחזיקת פטנט הקשורה לחלבון הקשור ל- GPI אנושי חדשני, כמו גם היא ייסדה ועובדת עבור ACA CELL Biotech. המחברים האחרים מצהירים כי אין להם כל ניגוד אינטרסים.
תודות
מוקדש לזכרו של ד"ר ריינר סאפריך.
המחברים אסירי תודה במיוחד לחוזה מנואל גרסיה-ורדוגו ווויסנטה הרנץ-פרז על ביצוע ניסויים וניתוח EM במעבדה לנוירוביולוגיה השוואתית, מכון קוואניל למגוון ביולוגי וביולוגיה אבולוציונית, אוניברסיטת ולנסיה, CIBERNED, ולנסיה, ספרד, שנתמכה על ידי מימון מחקר מענק פרומטאו לקבוצות מחקר מצוינות PROMETEO/2019/075. שאר העבודה נתמכה על ידי ACA CELL ביוטכנולוגיה GmbH היידלברג, גרמניה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אלבומין שבר V | Roth | T8444.4 | |
| אנטי-GFAP Cy3 מצומד | Merck Millipore | MAB3402C3 | |
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| ערכת כדאיות התאים של AO/PI | Biozym | 872045 | Biozym הופסקה. המוצר מיוצר על ידי לוגוס ביוסיסטמס. |
| חומצה אסקורבית 2-פוספט sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 ללא סרום 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| תמיסת FGF בסיסית | פישר סיינטיפיק (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | מדיית שיפוע צפיפות |
| BSA Frac V 7.5% | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | חרוזים מגנטיים בגודל ננו |
| שקופיות ספירת תאים Luna | Biozym | 872010 | Biozym הופסק. המוצר מיוצר על ידי לוגוס ביוסיסטמס. |
| מגלשות קאמריות Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | שרף אפוקסי |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | הופסק. זמין תחת: TMS-013-B |
| GDNF רקומביננטי | אנושי פישר סיינטיפיק (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-גלוטמין |
| גלוטראלדהיד בדרגת | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| תא נתרן הפרין | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| BDNF אנושי | פישר סיינטיפיק (Gibco)11588836 | ||
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin Mouse | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| עופרת ציטראט | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Automated Cell Counter | Biozym | 872040 | Biozym הופסק. המוצר מיוצר על ידי לוגוס ביוסיסטמס. |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trennsä ulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada מצלמה דיגיטלית | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 בארות | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Supplement 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 10888022 | |
| PBS סטרילי | Roth | 9143.2 | |
| פולי-L-אורניתין | סיגמא-אולדריץ' | P4957-50ML | |
| סופר דבק-3 לוקטיט | הנקל | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI אירופה | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| אורניל אצטט C | EMS | 22400 |
מקורות
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105(2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
