מאמר שיטה

כתם מערבי במהירות גבוהה במיוחד באמצעות טכנולוגיית שיפור Immunoreaction

DOI:

10.3791/61657

⸱

26 בספטמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקת סופג מערבית במהירות גבוהה במיוחד מפותחת על ידי שיפור הקינטיקה של אנטיגן-נוגדנים מחייב באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) טכנולוגיה בשילוב עם סוכן שיפור immunoreaction.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתם מערבי (באנגלית: Western blot) היא שיטה קנונית למחקר ביו-רפואי. הוא משמש בדרך כלל כדי לקבוע את הגודל היחסי ואת השפע של חלבונים ספציפיים, כמו גם שינויים בחלבון שלאחר התרגום. טכניקה זו יש היסטוריה עשירה ונשאר בשימוש נרחב בשל הפשטות שלה. עם זאת, הליך הבליעה המערבי המפורסם לוקח שעות, אפילו ימים, כדי להשלים, עם צוואר בקבוק קריטי להיות זמני הדגירה הארוכים המגבילים את התפוקה שלה. צעדי דגירה אלה נדרשים עקב דיפוזיה איטית של נוגדנים מהתמיסה בתפזורת לאנטיגנים משותקים על הממברנה: ריכוז הנוגדנים ליד הממברנה נמוך בהרבה מהריכוז בצובר. כאן, אנו מציגים חידוש המפחית באופן דרמטי מרווחי דגירה אלה על ידי שיפור כריכת אנטיגן באמצעות ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) של פתרון הנוגדנים. השתמשנו גם בטכנולוגיה לשיפור האימונוריאציה כדי לשמר את הרגישות של ההסתעפות. שילוב של שיטת CDR עם סוכן שיפור אימונוריאציה מסחרי הגביר את אות הפלט והפחית באופן משמעותי את זמן הדגירה של הנוגדנים. הכתם המערבי במהירות גבוהה במיוחד יכול להתבצע בתוך 20 דקות ללא כל אובדן רגישות. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כתמים מערביים באמצעות זיהוי chemiluminescent ו פלואורסצנטי. פרוטוקול פשוט זה מאפשר לחוקרים לחקור טוב יותר את הניתוח של ביטוי חלבון בדגימות רבות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתם מערבי (ידוע גם בשם immunoblot) היא טכניקה חזקה ויסודית על פני מגוון רחב של דיסציפלינות מדעיות וקליניות. טכניקה זו משמשת לבחינת הנוכחות, השפע היחסי, המסה המולקולרית היחסית והשינויים שלאחר התרגום של חלבונים1. בשילוב עם ניתוח תמונה דיגיטלית, שיטה זו יכולה לנתח באופן אמין את שפע החלבונים ושינויי החלבון2. למרות כתם המערבי מבוצע באופן שגרתי, היא שיטה זמן רב ועבודה אינטנסיבית. דגירה ארוכה של הנוגדן עם ממברנות נדרשים. כאן, אנו מתארים שינוי בשיטת הדגירה המתגברת על מגבלה זו מבלי להקריב רגישות.

במהלך הדגירה של הממברנה, נוגדנים צפים בתמיסה בעוד אנטיגנים משותקים על הממברנה. בגלל הזיקה הגבוהה שלהם, שיעור הנוגדנים המחייבים את האנטיגן מהיר יותר מפיזור הנוגדנים מהתמיסה בתפזורת לקרום. פעולה זו יוצרת "שכבת דלדול" בריכוז נמוך (איור 1). זה עלול לקחת שעות עבור נוגדנים רחוקים יותר להגיע לקרום באמצעות דיפוזיה פסיבית, שהוא הגורם העיקרי האחראי על זמני דגירה ארוכים בטכניקה זו. אפקט זה נקרא הגבלת הסעת המונים (MTL)3. הוצע כי ניקוז חוזר ונשנה וחידוש הפתרון המכיל נוגדנים עלול לשבש את שכבת הדלדול ולהתגבר על MTL4. כאן, פיתחנו טכניקה ייחודית המיישמת את המושג הזה ניקוז מחזורי וחידוש (CDR) כדי להפחית את ההשפעה של MTL בפרוטוקול סופג מערבי מסורתי ולקצר באופן הערות את תקופת הדגירה הנדרשת.

על מנת לשמור על רגישות הגילוי עם זמן דגירה קצר, עשינו שימוש בטכנולוגיה לשיפור אימונוריאציה המאיצה את תגובת האנטיגן-נוגדנים, ובכך משפרת את יחס האות לרעש5. סוכנים רבים לשיפור האימונו-ראציה הזמינים מסחרית (IRE) מורכבים מ-2 רכיבים (פתרון 1 ו-2, ראו טבלת חומרים). ההרכב הקנייני או מנגנון הפעולה של IRE לא נחשפו, אך מצאנו בעבר כי IRE הפחית את קבוע הדיסוציאציה בין האנטיגן והנוגדן ב מבחני כריכת פאזה מוצקים, מה שמצביע על זיקה מוגברת היא, לפחות בחלקה, אחראית לשיפור ההשפעה של IRE6. השילוב של CDR עם IRE מניב פרוטוקול נפיחות מערבי במהירות גבוהה במיוחד המפחית את זמן ההליך כולו מבלי להתפשר על הרגישות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SDS-PAGE והעברה לקרום PVDF

  1. בצעו SDS-PAGE להפרדת חלבונים לפי גודל יחסי.
    הערה: כל מערכת ג'ל מסחרית או ביתית היא בסדר. נא פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. מעבירים חלבונים מופרדים מג'ל לקרום PVDF.
    הערה: שיטות העברה נפוצות (העברה יבשה למחצה או רטובה) מתאימות. נא פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן.

2. חסימת קרום PVDF

  1. דגירה את הממברנות במאגרי חסימה מתאימים במשך 1 שעות עם עצבנות בטמפרטורת החדר.
    הערה: בהתאם למערכת הנוגדנים והזיהוי העיקרית, יש לבחור מאגר חסימה מתאים. לדוגמה, החוסמים האופייניים ביותר הם BSA, חלב יבש דל שומן, קזאין ופולימרים סינתטיים מסחריים. PBS ו/או TBS עם 0.1% Tween20 הם המאגרים הנפוצים ביותר. שלב חסימה זה יכול להיעשות בן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.

3. דגירה עם נוגדן ראשוני

  1. הכן 10% שיפור אימונוריאציה סוכן-1 פתרון (IRE-1) עם מים מזוקקים. וורטקס היטב.
  2. הכינו את הנוגדן העיקרי המדולל עם 10% IRE-1. מערבבים אותו בעדינות וביסודיות.
  3. אם משתמשים בקרום גדול יותר (4 ס"מ x 8 ס"מ – 8 ס"מ x 8 ס"מ), מוסיפים 8 מ"ל של פתרון הנוגדנים לצינורות צנטריפוגה חרוטים של 50 מ"ל. אם משתמשים בקרום קטן יותר (2 ס"מ x 8 ס"מ – 4 ס"מ x 8 ס"מ), מוסיפים 3 מ"ל של פתרון הנוגדנים לצינור פוליפרופילן עגול 14 מ"ל(שולחן החומרים).
  4. להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את פתרון החסימה לזמן קצר. הכנס את קרום PVDF לתוך צינור זה עם אצבעות כפפות ולהבטיח כי הממברנה כולה נצמדת לקיר הצינור. כאשר קרום PVDF מוכנס לתוך צינור, פנים "צד החלבון" של הממברנה כי היה במקור במגע עם הג'ל פנימה. סגור את המכסה בחוזקה.
  5. הכנס את הצינור 50 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית לתנור הכלאה.
    הערה: כאשר צינורות 14 מ"ל משמשים דגירה זו, להכניס צינור 14 מ"ל לתוך הצינור 50 מ"ל, באמצעות זוג מחזיקי טבעת פלסטיק כדי לשמור על הצינור הפנימי במרכז הצינור 50 מ"ל.
  6. הפעל את תנור ההכלאה.
  7. דגירה הממברנה עם סיבוב 6 סל"ד לפחות 5 דקות.
    הערה: ודא כי הממברנה נצמדת לקיר בכל עת וכי הצינור (הפנימי) הוא אופקי כדי לכסות את הממברנה עם פתרון הנוגדן באופן שווה. כייל את הדילול של זמן הנוגדן והדגירה לפני הניסוי עצמו.

4. שטיפת ממברנות

  1. עצור את הסיבוב.
  2. בזהירות להסיר את קרום PVDF מהצינור עם פינצטה, ומניחים את הממברנה לתוך מיכל עם 50 מ"ל של PBS-T.
  3. יש לשטוף את הממברנה לזמן קצר באמצעות PBS-T.
  4. יש לשטוף את הממברנה במיכל במים מזוקקים עד שלא יופיעו בועות. זה כדי להסיר את רוב הנוגדן.
  5. מעבירים את קרום ה-PVDF מהמכל לטווח הסלט המכיל 250 מ"ל של PBS-T.
  6. מניחים את סל מסננת ספינר. ודא שהמכסה הונח בצורה מאובטחת.
  7. הפעל את ספינר ולהפעיל אותו במשך כ 20-30 שניות.
  8. להשליך את הפתרון ולשטוף בקצרה את החלק הפנימי של ספינר עם מים מזוקקים.
  9. הוסף 250 מ"ל של PBS-T לתוך ספינר שוב.
  10. חזור על שלבים 4.6 ו- 4.7.

5. דגירה עם הנוגדן המשני

  1. הכן 10% שיפור אימונוריאציה סוכן-2 פתרון (IRE-2) עם מים מזוקקים. וורטקס היטב.
  2. הכינו את הנוגדן המשני המדולל עם 10% IRE-2. מערבבים אותו בעדינות וביסודיות.
  3. בחר את נפח פתרון הנוגדנים והצינור כאמור בשלב 3.3.
  4. להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את הפתרון בקצרה. הכנס את קרום PVDF לתוך הצינור כאמור בשלב 3.4.
  5. הכנס את הצינור 50 מ"ל לתוך בקבוק זכוכית לתנור הכלאה.
  6. הפעל את תנור ההכלאה.
  7. דגירה הממברנה עם סיבוב 6 סל"ד לפחות 5 דקות. ודא כי הממברנה נצמדת לקיר בכל עת וכי הצינור (הפנימי) הוא אופקי כדי לכסות באופן שווה את הממברנה עם פתרון הנוגדן.
    הערה: כייל את זמן הדגירה לפני הניסוי עצמו. כאשר הנוגדן המשני מצומד באופן פלואורסצנטי, בצע את הדגירה בחושך.

6. שטיפת ממברנות

  1. בצע את שלבים 4.1 עד 4.10.

7. רכישת תמונה

  1. זיהוי צ'מילומינסנטי
    1. מניחים חתיכת סרט גמיש חצי השתלה (10 ס"מ x 15 ס"מ) על משטח שטוח.
    2. מערבבים 2 מרכיבים של המצע המלומינסנטי בצינור 5 מ"ל.
    3. להעביר מיד 1.5 מ"ל של המצע המעורב לסרט חצי השתלה גמיש ומניחים את קרום PVDF על זה. לאחר מכן, להעביר את שאר פתרון המצע על הממברנה.
    4. דגירה קרום PVDF עם מצע מעורב על סרט גמיש שקוף למחצה במשך 1 דקות.
    5. להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את פתרון המצע בקצרה.
    6. כריך הממברנה בין זוג סרטי שקיפות.
    7. לרכוש את התמונה תחת מצב chemiluminescent.
  2. זיהוי פלואורסצנטי
    1. להרים את קרום PVDF עם פינצטה ולנקות את הפתרון בקצרה.
    2. כריך הממברנה בין זוג סרטי שקיפות.
    3. רכוש את התמונה במצב פלואורסצנטי.
      הערה: יש לבצע את שלבים 7.1 ו- 7.2 בסמיכות למכונת ההדמיה כדי להבטיח רגישות מרבית.
    4. כאשר אות הרקע גבוה, בצע שלב כביסה במיכל עם 80-100 מ"ל של PBS-T: 10 דקות לשטוף 3 פעמים עבור הנוגדן העיקרי 5 דקות לשטוף 6 פעמים עבור הנוגדן המשני.
      הערה: הן נוגדנים ראשוניים והן משניים מדוללים עם 10% פתרונות IRE ניתן להשתמש עד 8-10 פעמים ללא אובדן רגישות6. הפתרון צריך להישמר ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 חודש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דוגמה זו ממחישה את האפקטיביות של שיטת CDR יחד עם טכנולוגיית אימונוהאנסינג על כתם מערבי. הדגירה הסטטית בוצעה על סרט גמיש שקוף למחצה שבו קרום PVDF דגירה עם פתרון הנוגדנים, ואילו דגירה CDR היה בתנור הכלאה על ידי סיבוב צינורות שהכילו את הממברנות ואת פתרון הנוגדנים (סרט). איור 2 הראה כמויות של אנטיגן ונוגדנים, בהתאמה, הדרושים לגילוי צ'מילומינסנט על כתמים מערביים. הן בדגירה סטטית והן בדגירה CDR, השימוש בתמיסת IRE הגביר את הרגישות: IRE הפחית את הכמות הנמוכה ביותר של ליסטטים של תאים (אנטיגן) הדרושים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתם מערבי הוא טכניקה אנליטית בשימוש נרחב כדי לזהות חלבונים ספציפיים שפותחו ~ לפני 40 שנה7,8. מאז, הטכניקה המשיכה להתפתח, עם חידושים הבאים לשפר את הרגישות, המהירות, ואת הכמות של הטכניקה2,9,10,11,12,13. פרוטוקול סופג מערבי מהיר במיוחד המוצג כאן מבצע מספר שיפורים משמעותי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים הצהירו כי אין אינטרסים מתחרים הרלוונטיים ישירות לתוכן מאמר זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי האגף למחקר פנים-ארצי, מכון הלב, הריאות והדם הלאומי, המכונים הלאומיים לבריאות. S.H. נתמך על ידי יפן ציבורית-פרטית שותפות סטודנטים ללמוד בחו"ל תוכנית, ו H.N. ו K.Y. היו על ידי גבור ו V סמים בחו"ל הכשרה מלגת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מבחנה PP עם בהירות גבוהה של 14 מ"ל תחתית עגולה, בוגרת, עםפלקון352059
אפולו למדפסות לייזרN/AN/A כל סוג של סרט שקיפות למדפסת לייזר הם בסדר.
Azure Imaging System 600Azure BiosystemsAzure 600כל סוג של מערכת רכישת תמונה מתאים לזיהוי כימילומינסנט ו/או פלואורסצנטי.
יכול לקבל פתרון משפר תגובה חיסוניתאות TOYOBONKB-101
ציפורן חלב יבש מיידי ללא שומןציפורןN/A
ECL אנטי עכבר IgG, חזרת פרוקסידאז מקושר F(ab')2 שבר מכבשיםGE HealthcareNA9310V
ECL נגד ארנב IgG, חזרת פרוקסידאז מקושר F(ab')2 שברים מחמורGE HealthcareNA9340V
HYBAID Micro-4N/AN/Aכל תנור הכלאה הוא בסדר כל עוד הצינורות מסובבים באופן שווה במצב אופקי.
קרום Immobilon-P PVDF, 0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביותMillipore SigmaIPVH304F0
IRDye 680RD עז נגד עכבר IgG נוגדן משניLICOR926-68070
IRDye 800CW עז נגד ארנב IgG נוגדן משניLICOR926-32211
KPL LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrateseracare5430-0049
נוגדן עכבר נגד ß נוגדן אקטיןMillipore SigmaA5316
מאגר חסימת אודיסיאה (PBS)LICOR927-40100מאגר חוסם לזיהוי פלורסנט
ספינר סלט OXOOXO32480V2Bכל ספינר סלט הוא בסדר כל עוד ממברנות ה-PVDF נשטפות במרץ ללא קרע.
סרט איטום פרפילםBemisParafilm M PM996סרט גמיש שקוף למחצה
פוליאתילן מכסי בורג שטוחים לצינורות צנטריפוגה תחתונים חרוטיים 50 מ"לFalcon352070
טבעות להחזקת צינור 14 מ"ל במרכז צינור 50 מ"לN/AN/Aמוכן בחנות מכונות ארנב
אנטי-6X נוגדן התג שלוAbcamab9108
Tween20מיליפור סיגמאP2287
סרט שקפים של

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
  2. Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
  3. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
  4. Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
  5. Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
  6. Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  8. Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
  9. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  10. Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
  11. Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852(2016).
  12. Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
  13. Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
  14. Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PVDF

מאמרים קשורים