מאמר שיטה

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

DOI:

10.3791/61662

⸱

6 באוקטובר 2020

 ,  , 
1Brudnick Neuropsychiatric Research Institute, Department of Neurobiology, University of Massachusetts Medical School, 2Interdisciplinary Graduate Program, University of Massachusetts Medical School, 3UMMS MD/PhD Program, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג כאן פרוטוקול לאלקטרופורציה חד-תאית שיכולה לספק גנים הן בתאי עצב מעוררים והן בתאי עצב מעכבים על פני מגוון גילאים של תרבות פרוסות היפוקמפוס במבחנה. הגישה שלנו מספקת ביטוי מדויק ויעיל של גנים בתאים בודדים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לבחון פונקציות תאיות אוטונומיות ובין תאיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלקטרופורציה ביססה את עצמה כשיטה קריטית להעברת גנים ספציפיים לתאים כדי להבין את תפקודם. כאן, אנו מתארים טכניקת אלקטרופורציה של תא יחיד שממקסמת את היעילות (~ 80%) של טרנספקטציה בגן במבחנה בנוירונים מעכבים מעוררים ומעמדיים בתרבות פרוסת ההיפוקמפוס האורגנוטיפית של העכבר. באמצעות אלקטרודות זכוכית גדולות, נוזל שדרתי מלאכותי המכיל טטרודוטוקסין ופולסים חשמליים קלים, העברנו גן מעניין לנוירונים פירמידליים בהיפוקמפוס CA1 ואינטראורונים מעכבים. יתר על כן, אלקטרופורציה יכולה להתבצע בפרוסות היפוקמפוס בתרבית עד 21 ימים במבחנה ללא ירידה ביעילות transfection, המאפשרת מחקר של שלבים התפתחותיים שונים של תרבות פרוסה. עם העניין הגובר בבחינת הפונקציות המולקולריות של גנים על פני מגוון רחב של סוגי תאים, השיטה שלנו מדגימה גישה אמינה וישירה לתחילת הגנים במבחנה ברקמת מוח העכבר שניתן לבצע עם ציוד וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות קיימות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בביולוגיה מולקולרית, אחד השיקולים החשובים ביותר לחוקר הוא כיצד להעביר גן של עניין לתא או לאוכלוסיית תאים כדי לברוח את תפקידו. שיטות המסירה השונות יכולות להיות מסווגות כביולוגיות (למשל, וקטור ויראלי), כימיות (למשל, סידן פוספט או שומנים), או פיזיות (למשל, אלקטרופורציה, מיקרו-הנדסה או ביוליסטית)1,2. שיטות ביולוגיות יעילות מאוד ויכולות להיות ספציפיות לסוג התא אך מוגבלות על ידי פיתוח של כלים גנטיים ספציפיים. גישות כימיות הן חזקות מאוד במבחנה, אבל transfections הם בדרך כלל אקראיים; יתר על כן, גישות אלה שמורות בעיקר לתאים ראשיים בלבד. מתוך הגישות הפיזיות, הביוליסטיקה היא הפשוטה והקלה ביותר מבחינה טכנית, אך שוב מייצרת תוצאות טרנספקטיות אקראיות ביעילות נמוכה יחסית. עבור יישומים הדורשים העברה לתאים ספציפיים ללא צורך בפיתוח כלים גנטיים, אנו מסתכלים לכיוון אלקטרופורציה חד-תאית3,4.

בעוד אלקטרופורציה המשמשת להתייחס רק אלקטרופורציה שדה, במהלך עשרים השנים האחרונות, פרוטוקולי אלקטרופורציה מרובים במבחנה ו in vivo חד תא פותחו כדי לשפר את הספציפיות ואת היעילות 5,6,7, להוכיח כי electroporation יכול לשמש להעברתגניםלתאים בודדים יכול, ולכן, להיות מדויק מאוד. עם זאת, ההליכים תובעניים מבחינה טכנית, גוזלים זמן רב ולא יעילים יחסית. ואכן, מאמרים עדכניים יותר חקרו את ההיתכנות של אסדות אלקטרופורציה ממוכנות8,9, אשר יכול לעזור לחסל כמה מחסומים אלה לחוקרים המעוניינים להתקין רובוטיקה כזו. אבל עבור אלה המחפשים אמצעים פשוטים יותר, הבעיות עם אלקטרופורציה, כלומר מוות תאים, כשל transfection, וסתימת פיפטה, להישאר דאגה.

לאחרונה פיתחנו שיטת אלקטרופורציה המשתמשת בפיפטות זכוכית בעלות קצה גדול יותר, פרמטרים מתונים יותר של פעימות חשמליות, וצעד רכיבה על אופניים ייחודי בלחץ, שיצר יעילות transfection גבוהה בהרבה בתאי עצב מעוררים מאשר שיטות קודמות, ואיפשר לנו לראשונה להעביר גנים באינטראורונים מעכבים, כולל אינטראורונים מעכבים המבטאים סומטוסטטין באזור CA1 ההיפוקמפוס של תרבות פרוסת האורגנוטיפית של העכבר10. עם זאת, האמינות של שיטת אלקטרופורציה זו בסוגי פנימיות מעכבות שונות ושלבים התפתחותיים עצביים לא טופלה. כאן, הדגמנו שטכניקת אלקטרופורציה זו מסוגלת להעביר גנים הן לנוירונים מעוררים והן למעמדות שונים של אינטראורונים. חשוב לציין, יעילות טרנספקטו הייתה גבוהה ללא קשר לימים במבחנה (DIV) פרוסת גיל תרבות נבדק. טכניקה מבוססת וידידותית למשתמש זו מומלצת מאוד לכל חוקר המעוניין להשתמש באלקטרופורציה של תא יחיד לסוגי תאים שונים בהקשר של רקמת מוח של עכבר במבחנה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס. הכנת תרבות פרוסה, הכנת פלסמיד ואלקטרופורציה מפורטים גם בשיטות שלנו שפורסמו בעבר וניתן להתייחס אליהם לקבלת מידע נוסף10.

1. הכנת תרבות פרוסה

  1. הכן תרביות פרוסת היפוקמפוס אורגנוטיפית עכבר כפי שתואר בעבר11, באמצעות עכברים לאחר הולדות 6- עד 7 ימים של כל מין.
    1. הכן מדיה ביתור עבור תרבות פרוסה organotypic המורכב (ב mM): 238 סוכרוז, 2.5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, ו 11 גלוקוז במים deionized, ולאחר מכן גז עם 5% CO2/95% O2 ל- pH של 7.4.
    2. הכן מדיה תרבית פרוסה organotypic המורכבת: 78.8% (v/v) נשר בינוני חיוני מינימלי, 20% (v/ v) סרום סוס, 17.9 מ"מ NaHCO3, 26.6 mM גלוקוז, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4, 30 mM HEPES, אינסולין (1 מיקרוגרם / מ"ל), ו 0.06 מ"מ חומצה אסקורבית, pH מותאם ל 7.3. התאימו את האוסמולאריות ל-310-330 אוסמול באמצעות אוסמומטר.
    3. לנתח היפוקמפי מתוך המוח כולו באמצעות שתי מריות, ולחתוך (400 מיקרומטר) באמצעות מסוק רקמה. הפרד פרוסות באמצעות שני מלקחיים והעבר לתרביות תאים של 30 מ"מ בצלחת 6 היטב מלאה במדיה תרבותית (950 μL) מתחת לתוספות.
  2. אחסנו תרביות פרוסות אורגנוטיפיות באינקובטור תרבית רקמות (35 מעלות צלזיוס, 5% CO2)ושנו את מדיית תרבות הפרוסה כל יומיים.

2. הכנת פלסמיד

  1. הכן את הפלסמיד לגן העניין.
    1. גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) של תת-קלון לווקטור pCAG.
    2. לטהר pCAG-EGFP plasmid עם ערכת טיהור ללא אנדוטוקסין להתמוסס בתמיסה פנימית המורכבת מים מטופלים דיאתיל pyrocarbonate המכיל 140 mM K-מתנסולפונט, 0.2 מ"מ EGTA, 2 מ"מ MgCl2, ו 10 mM HEPES, מותאם pH 7.3 עם KOH (ריכוז plasmid: 0.1 μg / μL).

3. הכנת פיפטה מזכוכית

  1. משכו פיפטות זכוכית בורוסיליקט (4.5 – 8 MΩ) על פולר מיקרופיפט(איור 1A).
    הערה: צינורות הזכוכית המשמשים להקלטות מהדק תיקון של תאים שלמים אידיאליים לאלקטרופורציה.
  2. אופים פיפטות זכוכית למשך הלילה ב-200 מעלות צלזיוס כדי לעקר.
  3. בדוק את גודל קצה הפיפטה תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי להעריך את ההתנגדות החשמלית.
    1. אופציונלי:אמת עמידות פיפטה על ידי חיבור הפיפטה לאלקטרודה אלקטרופורציה והשתמש במיקרו-מניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה לנוזל השדרתי המלאכותי המעוקר במסנן (aCSF) המכיל (ב- mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 ו- 11 גלוקוז במים דה-יונים, בגז עם 5% CO2/95% O2 ל- pH של 7.4. אשר את ההתנגדות בפועל באמצעות הקריאה על האלקטרופורטור.
      הערה: ככל שקצה הפיפטה חד יותר, כך ההתנגדות החשמלית גדולה יותר. התנגדות הפיפטה צריכה להיות מתחת ל-10 MΩ. פיפטות זכוכית עם עמידות גבוהה לפיפטה(איור 1B)סותמות לעתים קרובות בקצה במהלך אלקטרופורציה חוזרת ונשנית.

4. התקנת אסדת אלקטרופורציה

  1. התקן את האלקטרופורטור לאסדת אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטית של תאים שלמים, המצוידת במיקרוסקופ זקוף המותקן על שולחן משתנה עם מיקרו-מניפולטור ומשאבה פריסטרלית.
  2. התקן את הבמה של האלקטרופורטור על מיקרו-מניפולטור וחבר זוג רמקולים לאלקטרופורטור. חבר את האלקטרופורטור לדוושת רגל שניתן להשתמש בה כדי לשלוח דופק כאשר הוא מוכן.
    הערה: הרמקולים פולטים צליל כאשר הם מופעלים, המהווה אינדיקטור להתנגדות החשמלית באלקטרודה. זה מאפשר לקבוע שינויים יחסיים בהתנגדות מבלי למשוך תשומת לב מההליך.

5. הכנת אלקטרופורציה

  1. מעבירים את תרבות הפרוסה מ-6 צלחות באר ל-3 ס"מ של מנות פטרי עמוסות ב-900 μL של מדיה תרבותית ומאחסנים בחממה CO2 שולחן עד שמוכנה לביצוע אלקטרופורציה.
    1. מראש תוסיפי תרבות טרייה עם מדיה של תרבות פרוסות (1 מ"ל) למשך 30 דקות לפחות בצלחת פטרי 3.5 ס"מ לפרוסות תרבות לאחר אלקטרופורציה.
  2. לנקות ולהכין את האסדה לאלקטרופורציה.
    1. לשוטט את הקווים עם 10% אקונומיקה במשך 5 דקות כדי לעקר את הצינורות ואת התא לפני תחילת הניסוי במשך היום.
    2. לטפטף את הקווים עם מים autoclaved deionized במשך 30 דקות לפחות לשטוף לחלוטין.
    3. תחדיר את הקווים עם aCSF מעוקר מסנן המכיל 0.001 mM tetrodotoxin (TTX).
      הערה: TTX ממזער רעילות תאית ומוות עקב ניסיון יתר של interneurons10.
  3. הגדר את פרמטרי הדופק של האלקטרופורטור: משרעת של -5 V, פעימה מרובעת, רכבת של 500 אלפיות שני, תדירות של 50 הרץ ורוחב דופק של 500 מיקרו.
  4. מלא פיפטה זכוכית עם 5 μL של פתרון פנימי המכיל plasmid.
    1. הסר את כל בועות האוויר הלכודות מקצה הפיפטה על-ידי הבהוב והקשה עדינה על הקצה מספר פעמים.
    2. בדוק את הקצה עבור נזק על ידי הדמייתו תחת מיקרוסקופ ניתוח או על ידי חזרה על שלב 3.3.1 כדי לבדוק את התנגדות pipette.
      הערה: אם הקצה פגום, יש להשליך את פיפטת הזכוכית, ויש לחזור על שלב זה עם פיפטת זכוכית חדשה שהוכנה בעבר בשלב 3.
  5. חברו את קצה הפיפטה לאלקטרודה והדליקו את הרמקולים. הקלט את הקריאה (ההתנגדות של pipette) של אלקטרופורטור כאשר הקצה יצר קשר עם מדיום aCSF.
  6. חותכים את הממברנה התרבותית באמצעות להב חד ומבודדים תרבית פרוסה אחת. מעבירים בזהירות את תרבות הפרוסה לתא האלקטרופורציה באמצעות מלקחיים חדים בזווית ומתקנים את מיקומה עם עוגן פרוסה.
    1. אין לשמור את תרבות הפרוסה מחוץ לאינקובטור במשך יותר מ -30 דקות בכל פעם כדי למנוע תופעות לוואי כגון שינויים בבריאות העצבית או פונקציה12.

6. תאי אלקטרופוראט מעניינים

  1. יש להפעיל לחץ חיובי על הפיפטה בפה או באמצעות מזרק של 1 מ"ל (לחץ של 0.2 - 0.5 מ"ל) המחובר לצינורות.
  2. השתמש בבקרות הידית התלת מימדיות של המיקרו-מניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה ליד פני השטח של תרבות הפרוסה.
  3. בחר תא יעד והתקרב אליו, תוך שמירה על הלחץ החיובי המופעל עד שנוצרת גומה על משטח התא, הנראית על המיקרוסקופ.
  4. בצע מחזורי לחץ.
    1. במהירות להחיל לחץ שלילי מתון על ידי הפה, כך חותם רופף צורות בין קצה pipette לבין קרום הפלזמה, המצוין חזותית על ידי הממברנה עולה לתוך קצה פיפטה במקצת. שים לב לעלייה (~ 2.5x ההתנגדות הראשונית) בהתנגדות pipette על ידי האזנה לעלייה בטון מגיע מהרמקולים. יש להפעיל מחדש במהירות לחץ חיובי כך שגומות הגומה ייווצרו מחדש.
    2. מיד להשלים לפחות שני מחזורי לחץ נוספים ללא הפסקה, ולאחר מכן להחזיק לחץ שלילי עבור 1 s.
      הערה: השהייה בין מחזורים, הפעלת לחץ רב מדי, או החזקת הלחץ השלילי במשך זמן רב מדי יכול לגרום נזק משמעותי לתא ואולי לגרום לתא למות במהלך electroporation.
  5. פעמו במהירות את האלקטרופורטור פעם אחת באמצעות דוושת כף הרגל כאשר הטון מהרמקולים מגיע לשיא יציב בגובה המגרש, המציין התנגדות חשמלית שיא. אין להמתין בהתנגדות השיא במשך יותר מ 1 s לפני שליחת הדופק.
    הערה: לא ראינו אלקטרופורציה מחוץ למטרה בעת שימוש בפרוטוקול זה10. רק התאים במגע עם פיפטת הזכוכית במהלך מחזורי לחץ הועברו. מיקום הפיפטה ליד נוירונים אחרים אינו גורם להדבקת גנים.
  6. בעדינות לסגת את pipette כ 100 מיקרומטר מהתא מבלי להפעיל לחץ.
  7. הפעל מחדש לחץ חיובי, ודא שההתנגדות דומה לקריאה המוקלטת בשלב 5.5, ולאחר מכן התקרב לתא הבא.
    1. הסר קבקבים פוטנציאליים, המצוין חזותית או על ידי התנגדות פיפטה מוגברת באופן משמעותי (>15% לאחר אלקטרופורציה, על ידי הפעלת לחץ חיובי.
      הערה: אם אין סתימה גלויה וההתנגדות עדיין גבוהה משמעותית, השלך את הפיפטה והשתמש בצינור חדש. בממוצע, pipette יכול לשמש עד 20 אירועי אלקטרופורציה אם המשתמש זהיר10.
  8. לאחר אלקטרופורציה, להעביר את תרבות הפרוסה על תוספת תרבות טרי, ודגור ב 35 מעלות צלזיוס באינקובטור עד 3 ימים.

7. קיבעון, הכתמה והדמיה של תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות

  1. לתקן תרביות פרוסה אורגנוטיפית אלקטרופורציה 2 – 3 ימים לאחר transfection עם 4% paraformaldehyde ו 4% סוכרוז 0.01 M תמיסת מלח חוצץ פוספט (1x PBS) עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
  2. הסר פרוסות קבועות ודגרה ב 30% סוכרוז במאגר פוספט 0.1 M (1x PB) במשך 2 שעות.
  3. מניחים פרוסות על שקופית ומקפיאים אותן על ידי הצבת זכוכית השקופית על גבי קרח יבש כתוש. מפשירים את הפרוסות בטמפרטורת החדר ומעבירים אותן לצלחת 6 היטב מלאה ב- PBS 1x.
  4. הכתימו את הפרוסות בנוגדנים נגד עכברים נגד GFP וארנבות נגד RFP במאגר GDB (0.1% ג'לטין, 0.3% טריטון X-100, 450 מ"מ NaCl ו-32% 1x PB, pH 7.4) למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
  5. לשטוף פרוסות עם 1x PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כל לשטוף.
  6. דגירה פרוסות עם נוגדן משני נגד עכבר אלכסה 488-מצומד אנטי ארנב אלכסה 594-מצומד חיץ GDB עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. דגירה פרוסות עם DAPI (4 מיקרוגרם / מ"ל) ב 1x PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. לשטוף פרוסות עם 1x PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות כל לשטוף.
  8. הרכב פרוסות על שקופיות זכוכית באמצעות בינוני הרכבה ולבצע הדמיה פלואורסצנטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האלקטרופורציה החד-תאית שלנו מסוגלת להעביר גנים בדיוק לנוירונים מעוררים ומעכבים שזוהו חזותית. עברנו אלקטרופורנציה של שלושה סוגי תאים עצביים שונים בשלוש נקודות זמן שונות. Parvalbumin (Pv) או ארסקולי גלוטמט סוג 3 (VGT3) ביטוי נוירונים היו דמיינו על ידי חציית Pvcre (JAX #008069) או VGT3cre (JAX #018147) קווים עם TdTomato (גרסה של חלבון פלואורסצנטי אדום) קו כתב (Jax #007905), בהתאמה בשם Pv / TdTomato ו- VGT3 / TdTomato קווים. תרביות פרוסה אורגנוטיפיות הוכנו מעכברי C57BL/6J, Pv/TdTomato ועכברי VGT3/TdToma...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטת אלקטרופורציה המעבירה נוירונים מעוררים ומעכבים ביעילות ודיוק גבוהים. פרוטוקול האלקטרופורציה הממוטב שלנו כולל שלוש פריצות דרך חדשניות להשגת עבירות גנים יעילות ביותר. השינוי הראשון שלנו היה להגדיל את גודל הפיפטה בהשוואה לפרוטוקולים שפורסמו בעבר3,5,6. שינוי זה איפשר לנו electroporate נוירונים רבים ללא סתימת פיפטה. בנוסף, ייתכן כי צינורות ההתנגדות התחתונה מאפשרים שימוש בפרמטרים של דופק חשמלי מתון יותר בהשוואה לשיט...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים של מענקי בריאות (R01NS085215 כדי K.F., T32 GM107000 ו F30MH122146 ל- A.C.). המחברים מודים לגברת נאו ווטנבה על הסיוע הטכני המיומן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<הכנה חזקה>פלסמיד
ערכת טיהור פלסמידQiagen12362
<חזקה>הכנת תרבית פרוסות אורגנוטיפית
6 צלחות בארGREINER BIO-ONE657160
Dumont #5/45 מלקחייםFST#5/45מלקחיים לדיסקציה בזווית להכנת תרבית פרוסות אורגנוטיפית
יחידת מסנן בקבוקMilliporeSCHVU02REסינון ואחסון של אמצעי תרבית
קלסרחממהBD C150-UL
McIlwain קוצץ רקמותTED PELLA, INC.10180קוצץ רקמות להכנת תרבית פרוסות אורגנוטיפית
הכנסת תרבית תאים מיליתא, 30 מ"מMilliporePIHP03050מוסיף תרבית פרוסות אורגנוטיפית
אוסמומטרמערכות דיוקOSMETTE II
PTFE מרית מצופהCole-ParmerSK-06369-11
מספרייםFST14958-09
סטריאו מיקרוסקופאולימפוסSZ61
מערכת סינון ואקום סטריליתMilliporeSCGPT01REסינון ואחסון של הכנת אלקטרודות aCSF
משקפיים נימייםWarner Instruments640796
Micropipetter PullerSutter מכשירP-1000חולץ
תנורקלסרBD (E2)
חולץ נימהמכשיר סאטרFB330Bחולץ
<חזק>אלקטרופורציה חד-תאית והדמיית פלואורסצנציה #1
3.5 מ"מ פלקון פטרי צלחותBD פלקון353001
AirtableTMC63-7512E
מצלמת CCDQ הדמיהRetiga-2000DC
מערכת אלקטרופורציהמולקולרייםAxoporator 800Aאלקטרופורטור
מערכת תאורה פלואורסצנטיתלומן קודם200
מניפולטורמכשיר סאטרMPC-385מניפולטור
מטמורף תוכנהמולקולרייםרכישת תמונה
משאבה פריסטלטיתRaininDynamax, RP-2משאבת זלוף
הזזהLuigs & רמקול נוימן240 XY
לא ידועיםהמחוברים לאלקטרופורטור
מיקרוסקופ סטריאואולימפוסSZ30
חממה שולחניתתרמו מדעיMIDI 40
מיקרוסקופ זקוףאולימפוסBX61WI
<חזק>פלואורסצנטי הדמיה #2
מיקרוסקופ פלואורסצנטי All-in-OneKeyenceBZ-X710
של מצלמת התקנים מכשירים שולחן רמקולים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Washbourne, P., McAllister, A. K. Techniques for gene transfer into neurons. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 566-573 (2002).
  2. Capecchi, M. R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell. 22 (2), Pt 2 479-488 (1980).
  3. Rae, J. L., Levis, R. A. Single-cell electroporation. Pflugers Archives: European Journal of Physiology. 443 (4), 664-670 (2002).
  4. Teruel, M. N., Blanpied, T. A., Shen, K., Augustine, G. J., Meyer, T. A versatile microporation technique for the transfection of cultured CNS neurons. Journal of Neuroscience Methods. 93 (1), 37-48 (1999).
  5. Rathenberg, J., Nevian, T., Witzemann, V. High-efficiency transfection of individual neurons using modified electrophysiology techniques. Journal of Neuroscience Methods. 126 (1), 91-98 (2003).
  6. Tanaka, M., Yanagawa, Y., Hirashima, N. Transfer of small interfering RNA by single-cell electroporation in cerebellar cell cultures. Journal of Neuroscience Methods. 178 (1), 80-86 (2009).
  7. Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), 094904(2017).
  8. Li, L., et al. A robot for high yield electrophysiology and morphology of single neurons in vivo. Nature Communication. 8, 15604(2017).
  9. Steinmeyer, J. D., Yanik, M. F. High-throughput single-cell manipulation in brain tissue. PLoS One. 7 (4), 35603(2012).
  10. Keener, D. G., Cheung, A., Futai, K. A highly efficient method for single-cell electroporation in mouse organotypic hippocampal slice culture. Journal of Neuroscience Methods. 337, 108632(2020).
  11. Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
  12. Ibata, K., Sun, Q., Turrigiano, G. G. Rapid synaptic scaling induced by changes in postsynaptic firing. Neuron. 57 (6), 819-826 (2008).
  13. Li, Y., et al. Electroporation on microchips: the harmful effects of pH changes and scaling down. Science Reports. 5, 17817(2015).
  14. Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6171-6177 (2010).
  15. Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nature Neurosciences. 15 (2), 329-337 (2011).
  16. Zhang, Y., Yu, L. C. Single-cell microinjection technology in cell biology. Bioessays. 30 (6), 606-610 (2008).
  17. De Simoni, A., Griesinger, C. B., Edwards, F. A. Development of rat CA1 neurones in acute versus organotypic slices: role of experience in synaptic morphology and activity. Journal of Physiology. 550, Pt 1 135-147 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ACSFCA1

מאמרים קשורים