אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

בביולוגיה מולקולרית, אחד השיקולים החשובים ביותר לחוקר הוא כיצד להעביר גן של עניין לתא או לאוכלוסיית תאים כדי לברוח את תפקידו. שיטות המסירה השונות יכולות להיות מסווגות כביולוגיות (למשל, וקטור ויראלי), כימיות (למשל, סידן פוספט או שומנים), או פיזיות (למשל, אלקטרופורציה, מיקרו-הנדסה או ביוליסטית)^1,2. שיטות ביולוגיות יעילות מאוד ויכולות להיות ספציפיות לסוג התא אך מוגבלות על ידי פיתוח של כלים גנטיים ספציפיים. גישות כימיות הן חזקות מאוד במבחנה, אבל transfections הם בדרך כלל אקראיים; יתר על כן, גישות אלה שמורות בעיקר לתאים ראשיים בלבד. מתוך הגישות הפיזיות, הביוליסטיקה היא הפשוטה והקלה ביותר מבחינה טכנית, אך שוב מייצרת תוצאות טרנספקטיות אקראיות ביעילות נמוכה יחסית. עבור יישומים הדורשים העברה לתאים ספציפיים ללא צורך בפיתוח כלים גנטיים, אנו מסתכלים לכיוון אלקטרופורציה חד-תאית^3,4.

בעוד אלקטרופורציה המשמשת להתייחס רק אלקטרופורציה שדה, במהלך עשרים השנים האחרונות, פרוטוקולי אלקטרופורציה מרובים במבחנה ו in vivo חד תא פותחו כדי לשפר את הספציפיות ואת היעילות 5^,6,7, להוכיח כי electroporation יכול לשמש להעברת^גניםלתאים בודדים יכול, ולכן, להיות מדויק מאוד. עם זאת, ההליכים תובעניים מבחינה טכנית, גוזלים זמן רב ולא יעילים יחסית. ואכן, מאמרים עדכניים יותר חקרו את ההיתכנות של אסדות אלקטרופורציה ממוכנות^8,9, אשר יכול לעזור לחסל כמה מחסומים אלה לחוקרים המעוניינים להתקין רובוטיקה כזו. אבל עבור אלה המחפשים אמצעים פשוטים יותר, הבעיות עם אלקטרופורציה, כלומר מוות תאים, כשל transfection, וסתימת פיפטה, להישאר דאגה.

לאחרונה פיתחנו שיטת אלקטרופורציה המשתמשת בפיפטות זכוכית בעלות קצה גדול יותר, פרמטרים מתונים יותר של פעימות חשמליות, וצעד רכיבה על אופניים ייחודי בלחץ, שיצר יעילות transfection גבוהה בהרבה בתאי עצב מעוררים מאשר שיטות קודמות, ואיפשר לנו לראשונה להעביר גנים באינטראורונים מעכבים, כולל אינטראורונים מעכבים המבטאים סומטוסטטין באזור CA1 ההיפוקמפוס של תרבות פרוסת האורגנוטיפית של העכבר¹⁰. עם זאת, האמינות של שיטת אלקטרופורציה זו בסוגי פנימיות מעכבות שונות ושלבים התפתחותיים עצביים לא טופלה. כאן, הדגמנו שטכניקת אלקטרופורציה זו מסוגלת להעביר גנים הן לנוירונים מעוררים והן למעמדות שונים של אינטראורונים. חשוב לציין, יעילות טרנספקטו הייתה גבוהה ללא קשר לימים במבחנה (DIV) פרוסת גיל תרבות נבדק. טכניקה מבוססת וידידותית למשתמש זו מומלצת מאוד לכל חוקר המעוניין להשתמש באלקטרופורציה של תא יחיד לסוגי תאים שונים בהקשר של רקמת מוח של עכבר במבחנה.

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מסצ'וסטס. הכנת תרבות פרוסה, הכנת פלסמיד ואלקטרופורציה מפורטים גם בשיטות שלנו שפורסמו בעבר וניתן להתייחס אליהם לקבלת מידע נוסף¹⁰.

1. הכנת תרבות פרוסה

1. הכן תרביות פרוסת היפוקמפוס אורגנוטיפית עכבר כפי שתואר בעבר¹¹, באמצעות עכברים לאחר הולדות 6- עד 7 ימים של כל מין.
   1. הכן מדיה ביתור עבור תרבות פרוסה organotypic המורכב (ב mM): 238 סוכרוז, 2.5 KCl, 1 CaCl₂, 4 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄, ו 11 גלוקוז במים deionized, ולאחר מכן גז עם 5% CO₂/95% O₂ ל- pH של 7.4.
   2. הכן מדיה תרבית פרוסה organotypic המורכבת: 78.8% (v/v) נשר בינוני חיוני מינימלי, 20% (v/ v) סרום סוס, 17.9 מ"מ NaHCO₃, 26.6 mM גלוקוז, 2 M CaCl₂, 2 M MgSO₄, 30 mM HEPES, אינסולין (1 מיקרוגרם / מ"ל), ו 0.06 מ"מ חומצה אסקורבית, pH מותאם ל 7.3. התאימו את האוסמולאריות ל-310-330 אוסמול באמצעות אוסמומטר.
   3. לנתח היפוקמפי מתוך המוח כולו באמצעות שתי מריות, ולחתוך (400 מיקרומטר) באמצעות מסוק רקמה. הפרד פרוסות באמצעות שני מלקחיים והעבר לתרביות תאים של 30 מ"מ בצלחת 6 היטב מלאה במדיה תרבותית (950 μL) מתחת לתוספות.
2. אחסנו תרביות פרוסות אורגנוטיפיות באינקובטור תרבית רקמות (35 מעלות צלזיוס, 5% CO₂₎ושנו את מדיית תרבות הפרוסה כל יומיים.

2. הכנת פלסמיד

1. הכן את הפלסמיד לגן העניין.
   1. גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) של תת-קלון לווקטור pCAG.
   2. לטהר pCAG-EGFP plasmid עם ערכת טיהור ללא אנדוטוקסין להתמוסס בתמיסה פנימית המורכבת מים מטופלים דיאתיל pyrocarbonate המכיל 140 mM K-מתנסולפונט, 0.2 מ"מ EGTA, 2 מ"מ MgCl₂, ו 10 mM HEPES, מותאם pH 7.3 עם KOH (ריכוז plasmid: 0.1 μg / μL).

3. הכנת פיפטה מזכוכית

1. משכו פיפטות זכוכית בורוסיליקט (4.5 – 8 MΩ) על פולר מיקרופיפט(איור 1A).
   הערה: צינורות הזכוכית המשמשים להקלטות מהדק תיקון של תאים שלמים אידיאליים לאלקטרופורציה.
2. אופים פיפטות זכוכית למשך הלילה ב-200 מעלות צלזיוס כדי לעקר.
3. בדוק את גודל קצה הפיפטה תחת מיקרוסקופ ניתוח כדי להעריך את ההתנגדות החשמלית.
   1. אופציונלי:אמת עמידות פיפטה על ידי חיבור הפיפטה לאלקטרודה אלקטרופורציה והשתמש במיקרו-מניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה לנוזל השדרתי המלאכותי המעוקר במסנן (aCSF) המכיל (ב- mM): 119 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 CaCl₂, 5 MgCl₂, 26 NaHCO₃, 1 NaH₂PO₄ ו- 11 גלוקוז במים דה-יונים, בגז עם 5% CO₂/95% O₂ ל- pH של 7.4. אשר את ההתנגדות בפועל באמצעות הקריאה על האלקטרופורטור.
      הערה: ככל שקצה הפיפטה חד יותר, כך ההתנגדות החשמלית גדולה יותר. התנגדות הפיפטה צריכה להיות מתחת ל-10 MΩ. פיפטות זכוכית עם עמידות גבוהה לפיפטה(איור 1B)סותמות לעתים קרובות בקצה במהלך אלקטרופורציה חוזרת ונשנית.

4. התקנת אסדת אלקטרופורציה

1. התקן את האלקטרופורטור לאסדת אלקטרופיזיולוגיה סטנדרטית של תאים שלמים, המצוידת במיקרוסקופ זקוף המותקן על שולחן משתנה עם מיקרו-מניפולטור ומשאבה פריסטרלית.
2. התקן את הבמה של האלקטרופורטור על מיקרו-מניפולטור וחבר זוג רמקולים לאלקטרופורטור. חבר את האלקטרופורטור לדוושת רגל שניתן להשתמש בה כדי לשלוח דופק כאשר הוא מוכן.
   הערה: הרמקולים פולטים צליל כאשר הם מופעלים, המהווה אינדיקטור להתנגדות החשמלית באלקטרודה. זה מאפשר לקבוע שינויים יחסיים בהתנגדות מבלי למשוך תשומת לב מההליך.

5. הכנת אלקטרופורציה

1. מעבירים את תרבות הפרוסה מ-6 צלחות באר ל-3 ס"מ של מנות פטרי עמוסות ב-900 μL של מדיה תרבותית ומאחסנים בחממה CO₂ שולחן עד שמוכנה לביצוע אלקטרופורציה.
   1. מראש תוסיפי תרבות טרייה עם מדיה של תרבות פרוסות (1 מ"ל) למשך 30 דקות לפחות בצלחת פטרי 3.5 ס"מ לפרוסות תרבות לאחר אלקטרופורציה.
2. לנקות ולהכין את האסדה לאלקטרופורציה.
   1. לשוטט את הקווים עם 10% אקונומיקה במשך 5 דקות כדי לעקר את הצינורות ואת התא לפני תחילת הניסוי במשך היום.
   2. לטפטף את הקווים עם מים autoclaved deionized במשך 30 דקות לפחות לשטוף לחלוטין.
   3. תחדיר את הקווים עם aCSF מעוקר מסנן המכיל 0.001 mM tetrodotoxin (TTX).
      הערה: TTX ממזער רעילות תאית ומוות עקב ניסיון יתר של interneurons¹⁰.
3. הגדר את פרמטרי הדופק של האלקטרופורטור: משרעת של -5 V, פעימה מרובעת, רכבת של 500 אלפיות שני, תדירות של 50 הרץ ורוחב דופק של 500 מיקרו.
4. מלא פיפטה זכוכית עם 5 μL של פתרון פנימי המכיל plasmid.
   1. הסר את כל בועות האוויר הלכודות מקצה הפיפטה על-ידי הבהוב והקשה עדינה על הקצה מספר פעמים.
   2. בדוק את הקצה עבור נזק על ידי הדמייתו תחת מיקרוסקופ ניתוח או על ידי חזרה על שלב 3.3.1 כדי לבדוק את התנגדות pipette.
      הערה: אם הקצה פגום, יש להשליך את פיפטת הזכוכית, ויש לחזור על שלב זה עם פיפטת זכוכית חדשה שהוכנה בעבר בשלב 3.
5. חברו את קצה הפיפטה לאלקטרודה והדליקו את הרמקולים. הקלט את הקריאה (ההתנגדות של pipette) של אלקטרופורטור כאשר הקצה יצר קשר עם מדיום aCSF.
6. חותכים את הממברנה התרבותית באמצעות להב חד ומבודדים תרבית פרוסה אחת. מעבירים בזהירות את תרבות הפרוסה לתא האלקטרופורציה באמצעות מלקחיים חדים בזווית ומתקנים את מיקומה עם עוגן פרוסה.
   1. אין לשמור את תרבות הפרוסה מחוץ לאינקובטור במשך יותר מ -30 דקות בכל פעם כדי למנוע תופעות לוואי כגון שינויים בבריאות העצבית או פונקציה¹².

6. תאי אלקטרופוראט מעניינים

1. יש להפעיל לחץ חיובי על הפיפטה בפה או באמצעות מזרק של 1 מ"ל (לחץ של 0.2 - 0.5 מ"ל) המחובר לצינורות.
2. השתמש בבקרות הידית התלת מימדיות של המיקרו-מניפולטור כדי לתמרן את קצה הפיפטה ליד פני השטח של תרבות הפרוסה.
3. בחר תא יעד והתקרב אליו, תוך שמירה על הלחץ החיובי המופעל עד שנוצרת גומה על משטח התא, הנראית על המיקרוסקופ.
4. בצע מחזורי לחץ.
   1. במהירות להחיל לחץ שלילי מתון על ידי הפה, כך חותם רופף צורות בין קצה pipette לבין קרום הפלזמה, המצוין חזותית על ידי הממברנה עולה לתוך קצה פיפטה במקצת. שים לב לעלייה (~ 2.5x ההתנגדות הראשונית) בהתנגדות pipette על ידי האזנה לעלייה בטון מגיע מהרמקולים. יש להפעיל מחדש במהירות לחץ חיובי כך שגומות הגומה ייווצרו מחדש.
   2. מיד להשלים לפחות שני מחזורי לחץ נוספים ללא הפסקה, ולאחר מכן להחזיק לחץ שלילי עבור 1 s.
      הערה: השהייה בין מחזורים, הפעלת לחץ רב מדי, או החזקת הלחץ השלילי במשך זמן רב מדי יכול לגרום נזק משמעותי לתא ואולי לגרום לתא למות במהלך electroporation.
5. פעמו במהירות את האלקטרופורטור פעם אחת באמצעות דוושת כף הרגל כאשר הטון מהרמקולים מגיע לשיא יציב בגובה המגרש, המציין התנגדות חשמלית שיא. אין להמתין בהתנגדות השיא במשך יותר מ 1 s לפני שליחת הדופק.
   הערה: לא ראינו אלקטרופורציה מחוץ למטרה בעת שימוש בפרוטוקול זה¹⁰. רק התאים במגע עם פיפטת הזכוכית במהלך מחזורי לחץ הועברו. מיקום הפיפטה ליד נוירונים אחרים אינו גורם להדבקת גנים.
6. בעדינות לסגת את pipette כ 100 מיקרומטר מהתא מבלי להפעיל לחץ.
7. הפעל מחדש לחץ חיובי, ודא שההתנגדות דומה לקריאה המוקלטת בשלב 5.5, ולאחר מכן התקרב לתא הבא.
   1. הסר קבקבים פוטנציאליים, המצוין חזותית או על ידי התנגדות פיפטה מוגברת באופן משמעותי (>15% לאחר אלקטרופורציה, על ידי הפעלת לחץ חיובי.
      הערה: אם אין סתימה גלויה וההתנגדות עדיין גבוהה משמעותית, השלך את הפיפטה והשתמש בצינור חדש. בממוצע, pipette יכול לשמש עד 20 אירועי אלקטרופורציה אם המשתמש זהיר¹⁰.
8. לאחר אלקטרופורציה, להעביר את תרבות הפרוסה על תוספת תרבות טרי, ודגור ב 35 מעלות צלזיוס באינקובטור עד 3 ימים.

7. קיבעון, הכתמה והדמיה של תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות

1. לתקן תרביות פרוסה אורגנוטיפית אלקטרופורציה 2 – 3 ימים לאחר transfection עם 4% paraformaldehyde ו 4% סוכרוז 0.01 M תמיסת מלח חוצץ פוספט (1x PBS) עבור 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
2. הסר פרוסות קבועות ודגרה ב 30% סוכרוז במאגר פוספט 0.1 M (1x PB) במשך 2 שעות.
3. מניחים פרוסות על שקופית ומקפיאים אותן על ידי הצבת זכוכית השקופית על גבי קרח יבש כתוש. מפשירים את הפרוסות בטמפרטורת החדר ומעבירים אותן לצלחת 6 היטב מלאה ב- PBS 1x.
4. הכתימו את הפרוסות בנוגדנים נגד עכברים נגד GFP וארנבות נגד RFP במאגר GDB (0.1% ג'לטין, 0.3% טריטון X-100, 450 מ"מ NaCl ו-32% 1x PB, pH 7.4) למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.
5. לשטוף פרוסות עם 1x PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות כל לשטוף.
6. דגירה פרוסות עם נוגדן משני נגד עכבר אלכסה 488-מצומד אנטי ארנב אלכסה 594-מצומד חיץ GDB עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר. דגירה פרוסות עם DAPI (4 מיקרוגרם / מ"ל) ב 1x PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
7. לשטוף פרוסות עם 1x PBS שלוש פעמים בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות כל לשטוף.
8. הרכב פרוסות על שקופיות זכוכית באמצעות בינוני הרכבה ולבצע הדמיה פלואורסצנטית.

האלקטרופורציה החד-תאית שלנו מסוגלת להעביר גנים בדיוק לנוירונים מעוררים ומעכבים שזוהו חזותית. עברנו אלקטרופורנציה של שלושה סוגי תאים עצביים שונים בשלוש נקודות זמן שונות. Parvalbumin (Pv) או ארסקולי גלוטמט סוג 3 (VGT3) ביטוי נוירונים היו דמיינו על ידי חציית Pvcre (JAX #008069) או VGT3cre (JAX #018147) קווים עם TdTomato (גרסה של חלבון פלואורסצנטי אדום) קו כתב (Jax #007905), בהתאמה בשם Pv / TdTomato ו- VGT3 / TdTomato קווים. תרביות פרוסה אורגנוטיפיות הוכנו מעכברי C57BL/6J, Pv/TdTomato ועכברי VGT3/TdTomato.

ראשית, אלקטרופורציה בוצעה נוירונים פירמידליים CA1 (Py) ב 7, 14, או 21 ימים במבחנה (DIV). EGFP הועבר ל-5-20 נוירונים פירמידליים באזור ההיפוקמפוס CA1 לאורך גילאי תרבות הפרוסה האלה(איור 2B-D). נוירונים פירמידליים CA1 זוהו באמצעות ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC). כדי להדגים את ההתפלגות האנטומית וההבדלים המורפולוגיים בין נוירונים פירמידליים לבין אינטראורונים מעכבים בתרבות הפרוסה, נוירונים פירמידליים CA1 היו אלקטרופורציות עם EGFP בעכבר DIV7 Pv / TdTomato ונגד גרעיני בוצע כדי להציג את המיקום המובהק של נוירונים חיוביים EGFP בשכבת התא הפירמידלי CA1 (איור 2A).

לאחר מכן, פרוטוקול זה הוחל גם על Pv חיובי TdTomato ו- VGT3 interneurons. אלקטרופורציה EGFP בוצעה 1-10 ineurons תייג פלואורונים. נוירונים TdTomato-חיובי Pv (איור 3) ו- VGT3 (איור 4) היו אלקטרופורים בהצלחה באזור CA1 ההיפוקמפוס. מעניין, טרנספקטציה של הגן EGFP של עניין בכל הסוגים העצביים המעכבים האלה לא הושפע באופן משמעותי על ידי DIV ולא היה שונה עם יעילות transfection (~ 80%) נצפתה נוירונים פירמידליים CA1(איור 5).

איור 1: שתי תמונות פיפטה מזכוכית מייצגות.
(A)הצג צינורות התנגדות נמוכה יותר (6.5 MΩ), המשמשים בפרוטוקול זה, ו- (B)צינורות התנגדות גבוהה יותר (10.4 MΩ) האופייניים לפרוטוקולי אלקטרופורציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תרביות פרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות היו אלקטרופורציות עם EGFP (ירוק) בשלוש נקודות זמן שונות.
(A)תרבות פרוסת היפוקמפוס אורגנוטיפית מייצגת בעכבר DIV7 Pv / TdTomato. נוירונים פירמידליים CA1 היו אלקטרופורציות עם EGFP (ראשי חץ ירוקים ולבנים) ולא הראו חפיפה עם TdTomato (TdT)-חיובי Pv interneurons (ראשי חץ אדומים, צהובים). תגובה גרעינית DAPI (כחול) בוצעה. ד"ג: שקע gyrus. (B-D) נוירונים פירמידליים CA1 היו אלקטרופורציות עם EGFP בשלוש נקודות זמן שונות: (B) DIV7, (C) DIV14 ו (D) DIV21. תרביות פרוסה אורגנוטיפיות תוקנו עם 4% סוכרוז, 4% פרפורמלדהיד / 1x PBS ותמונה ללא חתך נוסף. תמונות הגדלה למעלה משמאל, נמוכות של אזור ההיפוקמפוס CA1. ראשי חץ מייצגים נוירונים פירמידליים CA1 בודדים המיועדים לאלקטרופורציה. נוירונים שהודבקו עם ראשי חץ צהובים מוגדלים בלוחות התחתונים. ראשי חץ לבנים מסמלים נוירונים אלקטרופוריים נוספים מחוץ לתצוגת ההגדלה הגבוהה. למעלה מימין, תמונות הגדלה נמוכה של תמונות פלואורסצנטיות (Sup) ותמונות נומרסקי. מוטות קנה מידה: 500, 50, 100, 20 מיקרומטר בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: תרבויות פרוסות ההיפוקמפוס האורגנוטיפיות של Pv/TdTomato הופקעו באמצעות EGFP (ירוק) בשלוש נקודות זמן שונות.
(A) DIV7, (B) DIV14 ו -( C) DIV21. חפיפה עם תאים חיוביים TdTomato (TdT) (אדום) עם תווית Pv (אדום) נצפתה בשכבת התא הפירמידלי CA1 בהיפוקמפוס ואוריין. ב- insets ההגדלה הנמוכה (שורה עליונה), ראשי חץ צהובים מייצגים אינטראורונים בודדים של Pv המיועדים לאלקטרופורציה. ראשי חץ לבנים מסמלים אינטראורונים נוספים של Pv חיוביים של TdTomato אלקטרופורציה מחוץ לתצוגת ההגדלה הגבוהה. מוטות קנה מידה: 50, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: VGT3/TdTomato תרבויות פרוסות היפוקמפוס אורגניות היו אלקטרופורציות עם EGFP (ירוק) בשלוש נקודות זמן שונות.
(A) DIV7, (B) DIV14 ו -( C) DIV21. חפיפה עם תאים חיוביים TdTomato (TdT) עם תווית VGT (TdT) (אדום) נצפתה בשכבת התא הפירמידלי CA1 בהיפוקמפוס ואוריין. בכנסי ההגדלה הנמוכים (שורה עליונה), ראשי חץ צהובים מייצגים אינטראורונים בודדים של VGT3 המיועדים לאלקטרופורציה. ראשי חץ לבנים מסמלים אינטראורונים VGT3 חיוביים נוספים TdTomato אלקטרופורציה מחוץ לתצוגת ההגדלה הגבוהה. מוטות קנה מידה: 50, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: רמות דומות של יעילות טרנספקטי בתאי עצב פירמידליים CA1, Pv/TdTomato ו- VGT3/TdTomato interneurons בשלושה גילאים שונים של תרבות הפרוסה במבחנה.
תרשימי עמודות סיכום של שלושה גילאים שונים של תרבות פרוסות: DIV7 (משמאל), DIV14 (אמצע) ו- DIV21 (מימין). כל סמל מייצג את יעילות הטרנספקטיון המתקבלת מתרבות פרוסה אורגנוטיפית אחת CA1 Py: DIV7 (12 תרביות פרוסה משני עכברים), DIV14 (8/2), DIV21 (8/2); Pv: DIV7 (5/2), DIV14 (6/2), DIV21 (6/2); VGT3: DIV7 (6/2), DIV14 (7/2), DIV21 (6/2). בכיוון אחד ANOVA; נ.ס. (לא משמעותי). הנתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.