מאמר שיטה

דה-סלולריזציה ללא חומרי ניקוי של הלבלב האנושי לייצור מטריצה חוץ-תאית מסיסה (ECM)

DOI:

10.3791/61663

⸱

4 בספטמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome, 5Wake Forest University College of Arts and Science, 6Wake Forest University School of Medicine, 7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מסביר את השלבים לייצור מטריצה חוץ-תאית מסיסה (ECM) מהלבלב האנושי. אבקת ה-ECM המסיסה המתקבלת באמצעות פרוטוקול זה עשויה לשמש לסיכום המיקרו-סביבה של איי הלבלב במבחנה, ופוטנציאלית, בהגדרות vivo.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

להשתלת איים (ITx) יש פוטנציאל להפוך לסטנדרט הטיפול ברפואה להחלפת תאי בטא, אך תוצאותיה נשארות נחותות מאלו המתקבלות בהשתלת לבלב שלם. הפרוטוקולים המשמשים כיום לבידוד איים אנושיים נמצאים תחת בדיקה מדוקדקת מכיוון שהם מבוססים על העיכול האנזימטי של האיבר, לפיו הלבלב נהרס, קשריו לגוף אובדים ואיים ניזוקים באופן בלתי הפיך. נזק לאי מאופיין בגורמים קריטיים כגון הרס המטריצה החוץ-תאית (ECM), המייצגת את המסגרת התלת-ממדית של נישת האי ואשר אובדנה אינו תואם את האופיזיולוגיה של האי. חוקרים מציעים להשתמש בפיגומים מבוססי ECM שמקורם בלבלב היונקים כדי לטפל בבעיה זו ובסופו של דבר לשפר את הכדאיות, התפקוד ותוחלת החיים של האיים. השיטות הקיימות כיום להשגת פיגומים כאלה הן קשות מכיוון שהן מבוססות בעיקר על חומרי ניקוי. לפיכך, אנו מציעים שיטה חדשה ללא חומרי ניקוי שיוצרת פחות נזק ל-ECM ויכולה לשמר רכיבים קריטיים של ECM בלבלב. התוצאות מראות כי פרוטוקול הדה-סלולריזציה החדש שפותח איפשר השגת פינוי DNA מלא בזמן שמרכיבי ה-ECM נשמרו. ה-ECM שהתקבל נבדק לציטוטוקסיות ועטוף באיי לבלב אנושיים שהראו התנהגות תאית חיובית עם הפרשת אינסולין כאשר הם מגורים עם אתגר הגלוקוז. באופן קולקטיבי, אנו מציעים שיטה חדשה לדה-סלולריזציה של הלבלב האנושי ללא שימוש בחומרי ניקוי כימיים יוניים ולא יוניים קונבנציונליים. פרוטוקול זה וה-ECM המתקבל איתו יכולים להועיל הן ליישומי מבחנה והן ליישומים in vivo.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד איי הלבלב הוא תהליך קפדני המתבצע באמצעות עיכול אנזימטי של הקשרים בין האיים והמבנה התומך החוץ-תאי הסובב אותם. הרס זה של המטריצה החוץ-תאית (ECM) הוא אחד הגורמים הקריטיים באפיון הנזק לאיים המתרחש במהלך תהליכי בידוד 1,2,3,4. ה-ECM פרי-איסלט הוא מרכיב א-תאי חיוני בלבלב האנדוקריני. הוא מורכב מחלבונים ופוליסכרידים, המקיימים אינטראקציה ומקשרים ליצירת רשת תלת מימדית התומכת מבנית וביוכימית בהומאוסטזיס הפיזיולוגי, ומסייעת בשחזור מיקרו-סביבה זו במבחנה 2,5,6. אובדן תהליכי איתות בסיסיים בין איים ל-ECM מוכר כאחד הגורמים התורמים, המגביל את הישרדות האיים במבחנהוב-vivo 2,7,8,9,10.

ECM שמקורו בבעלי חיים ובבני אדם נמצא בשימוש נרחב לסיכום המיקרו-סביבה של איי הלבלב 11,12,13,14,15,16,17,18,19. מכיוון שיכולתו של ה-ECM לשפר את ההיצמדות, ההתפשטות ותחזוקת התרבית לטווח ארוך דווחה לראשונה ב-ref.20, מחקרים רבים אחרים סיפקו ראיות חזקות לכך ששחזור האינטראקציה המקומית של ECM עם איים אנושיים משפר את תפקוד האיים21,22. לדוגמה, נתונים עדכניים הראו כי איים עטופים ב-ECM שיפרו משמעותית את השליטה הגליקמית בעכברים סוכרתיים, ושיפרו והקלו על אספקת האינסולין בפלטפורמת אספקת אינסולין חדשה מבוססת תאים23. יתר על כן, מחקרים הראו כי שילוב של רכיבים קריטיים של ECM בלבלב יכול לשפר משמעותית את התפקוד האנדוקריני של תאי β 24,25,26,27.

פרוטוקולי ייצור ECM הקיימים בספרות מבוססים על יישום של חומרי ניקוי כימיים, למשל, טריטון X-100 או נתרן דודציל סולפט (SDS). למרות פינוי DNA מעולה, כימיקלים המשמשים בתהליכי דה-סלולריזציה הם ציטוטוקסיים, יקרים ושאריות על הרקמה הנטולת תאים מעוררות חששות לאור יישום קליני פוטנציאלי.

בהתבסס על תצפיות אלה, מטרות מחקר זה היו משולשות: ראשית, לפתח שיטת דה-סלולריזציה ללבלב האנושי עם שימוש מינימלי בחומרי ניקוי כימיים יוניים או לא יוניים; שנית, לייצר פיגום ECM מסיס לתרבית רקמות; שלישית, לאפיין את ה-ECM של הלבלב על מנת להעריך את הציטוטוקסיות שלו והשפעתו על תפקוד תאי האי. האפיון הכרחי עבור כל היישומים המבוססים על תרבית תאים, מכיוון שהוא מדגים כי ECM לבלב מסיס יכול להועיל בסיכום המיקרו-סביבה של הלבלב עבור איים מבודדים. מתוארת כאן שיטת דה-סלולריזציה יעילה ונטולת דטרגנטים עבור הלבלב האנושי, אפיון ה-ECM והשפעת ה-ECM על הכדאיות והתפקוד של איי לבלב אנושיים מבודדים עטופים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי ועדת המחקר האנושי של המרכז הרפואי הבפטיסטי ווייק פורסט. לבלב אנושי הושג באופן אתי מתורמי איברים באמצעות שירותי התורמים של קרוליינה. תורמי איברים נבדקו למחלות זיהומיות הרלוונטיות לבני אדם, על פי תקנות UNOS. איברים התקבלו בתמיסת שימור סטרילית שם הם נשמרו עד לשימוש. עם המסירה למעבדה, כל האיברים נבדקו, ודגימות של הלבלב המקומי נאספו למטרות היסטולוגיות. לאחר מכן האיברים הוקפאו ואוחסנו בתנאים סטריליים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

1. הכנה כירורגית של הלבלב האנושי

הערה: לבלב קפוא הופשר במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

  1. לפני תחילת דיסקציה כירורגית של הלבלב האנושי, הכינו 1 ליטר של תמיסת כביסה, המורכבת מ-950 מ"ל מים נטולי יונים (dH2O), 50 מ"ל של מגיב על בסיס יוד ותמיסת עט/סטרפטוקוקוס 1%.
  2. ללבוש כפפות סטריליות וחלוק מעבדה במהלך הדיסקציה הכירורגית. בצע את כל הניתוחים מתחת למכסה מנוע בדרגת תרבית תאים כדי למנוע זיהום אפשרי.
  3. העבירו את הלבלב משקית ההובלה הסטרילית לאגן השליה הסטרילי. ודא שהלבלב מכוון עם ראש האיבר שמאלה והזנב ימינה.
  4. נתחו בזהירות את התריסריון מראש הלבלב בעזרת מספריים סטריליים ומלקחיים ללא שיניים. היזהר לא לעשות חור בתריסריון, מכיוון שהדבר מגדיל את הסיכוי לזיהום.
    הערה: אם נוצר חור במערכת העיכול, מהדק במהירות את החור והמשך בדיסקציה.
  5. לאחר השלמת דיסקציה של ראש הלבלב, השלך את התריסריון לשקית ביולוגית מתאימה ופעל לפי ההנחיות המוסדיות לסילוקו.
  6. לנתח ולהשליך את כל הרקמה החוץ-לבבית שנותרה סביב ראש הלבלב, כולל כלי הדם העיקריים וצינור המרה המשותף, המסומנים בדרך כלל בזמן רכישת האיברים בתפרים שאינם נספגים. השלך את הטישו בהתאם להנחיות המוסדיות.
  7. לנתח ולהשליך את כל רקמת הלבלב ורקמת השומן הפרי-לבלב המקיפה את זנב הלבלב, תוך חשיפת כלי הדם הטחוליים.
  8. לאחר חשיפת כלי הדם של הטחול, הסר את הטחול ונתח את כלי הדם הטחוליים בשלמותם, כולל אלה המחוברים למשטח האחורי של הלבלב (עורק הטחול והווריד). השלך את הטחול והסר רקמות בהתאם להנחיות המוסדיות.
  9. נתח והשליך כראוי כל שומן חוץ לבלב הנראה בבירור, במיוחד שומן סביב הלבלב.
    הערה: בגובה זנב הלבלב, הרטרופריטונאום עשוי להיות גלוי. יש להרים אותו עם מלקחיים ללא שיניים, להסיר בהתאם עם מלקחיים כירורגיים ולהיפטר כראוי. הלבלב אמור להיות כעת נקי מכל רקמה חוץ לבבית.
  10. נתח את הלבלב לקבלת 1 ס"מ3 קוביות רקמת לבלב באמצעות מספריים כירורגיים, להבים היסטולוגיים מעוקרים או אזמלים כירורגיים. קוביות רקמת לבלב המתקבלות לאחר דיסקציה זו יעברו את תהליך הדסלולריזציה. המספר הממוצע של קוביות הלבלב שעוברות דה-סלולריזציה תלוי במאפיינים הפנימיים של האיבר. בממוצע, בין 40-60 קוביות לבלב עברו דה-סלולריזציה במחקר שהוצג.
  11. המשך לשלב 2.1

2. דה-סלולריזציה של רקמת הלבלב

הערה: פרוטוקול זה שימש עם לבלב במשקל ממוצע של 100 גרם; לכן, לא מומלץ לחרוג ממשקל זה בעת שימוש בטכניקת דה-סלולריזציה זו.

  1. מניחים את כל רקמת הלבלב שנותחה בעבר בשלב 1.10 במיכל פלסטיק סטרילי (ראה טבלת חומרים) עם תמיסת הכביסה ודוגרים למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
  2. הסר את רקמת הלבלב בעזרת מלקחיים סטריליים והניח אותה במיכל סטרילי חדש המכיל מים נטולי יונים סטריליים ונטולי אנדוטוקסין. סגרו היטב את מכסה המיכל והניחו אותו על שייקר אורביטלי מקורר עם טמפרטורה מוגדרת של 4 מעלות צלזיוס ומהירות טלטול בין 180-200 סל"ד למשך 24 שעות.
  3. הסר את המיכל עם רקמת הלבלב ונקה את החלק החיצוני כראוי לפני הכנסתו למכסה המנוע להמשך התהליך.
  4. הסר את רקמת הלבלב באמצעות מלקחיים כירורגיים והנח אותה במיכל סטרילי חדש, יחד עם 1 ליטר מים נטולי יונים, 50 מ"ג DNase I ו-0.0025% מגנזיום כלוריד. סגרו היטב את מכסה המיכל והניחו אותו בשייקר מסלולי, עם טמפרטורה מוגדרת מראש של 37 מעלות צלזיוס ומהירות ניעור של 100 סל"ד למשך 6 שעות.
  5. הכן את תמיסת EDTA-Trizma
    1. אסוף מיכל סטרילי חדש של 1 ליטר ונקה אותו כראוי לפני הכנסתו למכסה המנוע. להכנת 1 ליטר של תמיסת EDTA-Trizma, הוסף את הדברים הבאים: 985 מ"ל של מים סטריליים נטולי יונים, 7.5 מ"ל של Tris-HCl Buffer ו-7.5 מ"ל של תמיסת EDTA. אחסן אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  6. הסר את המיכל התוחם את רקמת הלבלב ונקה את החלק החיצוני כראוי לפני הכנסתו למכסה המנוע להמשך התהליך.
  7. הסר את רקמת הלבלב בעזרת מלקחיים כירורגיים והנח אותה במיכל סטרילי חדש עם 1 ליטר תמיסה מבוססת EDTA-Trizma. סגור היטב את מכסה המיכל והנח אותו בשייקר מסלולי, עם טמפרטורה מוגדרת מראש של 4 מעלות צלזיוס ומהירות טלטול בין 180-200 סל"ד למשך 18 שעות.
  8. הסר את המיכל המכיל את רקמת הלבלב ונקה את החלק החיצוני כראוי לפני הכנסתו למכסה המנוע לצורך התהליך.
  9. הסר את רקמת הלבלב בעזרת מלקחיים סטריליים והניח אותה במיכל סטרילי חדש עם מים נטולי יונים סטריליים ללא אנדוטוקסין. סגרו היטב את מכסה המיכל והניחו אותו על שייקר אורביטלי מקורר, עם טמפרטורה מוגדרת של 4 מעלות צלזיוס ומהירות ניעור בין 180 ל-200 סל"ד למשך 24 שעות.
    הערה: במהלך תקופת עיבוד זו, יהיה שינוי ניכר בצבע, בו הרקמה תיראה בהירה יותר.
  10. אוספים את רקמת הלבלב ומאחסנים אותה בצינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל, עד למקסימום של 25 מ"ל לצינור להקפאה וליופיליזציה לאחר מכן. מספר צינורות הצנטריפוגה משתנה בהתאם לגודל הלבלב. יש לאחסן דגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

3. ייצור אבקת ECM בלבלב – ליופיליזציה וכרסום קריו

  1. לאחר מינימום של 24-40 שעות של אחסון של החומר הנטול תאים ב-80 מעלות צלזיוס, העבירו את ה-ECM של הלבלב למייבש הקפאה.
  2. העבירו את החומר הקפוא למייבש הקפאה, ומונעים את הפשרת החומר.
    הערה: שלב הליופיליזציה אורך כ-3-5 ימים בהתאם למספר גורמים, כגון כמות החומר בכל צינור שעובר את התהליך והמשטח החשוף לליופיליזציה. מומלץ שהרקמה המפורקת לא תעלה על הרמה של 25 מ"ל בכל צינור ושהצינורות יוקפאו בזווית של 45 מעלות, מה שיאפשר לחשוף יותר משטח בקלות ברגע שהליופיליזציה מתחילה. הסר את המכסים מהצינורות.
  3. לאחר הליופיליזציה, העבירו את החומרים למכסה מנוע בדרגת תרבית תאים.
  4. חותכים כל חתיכה מה- ECM המיובש למחצית מגודלה בעזרת מספריים סטריליים. חלקי ECM מיובשים אלה יעברו תהליך כרסום אוטומטי לייצור אבקת ECM. השתמש במעבד אוטומטי כרסום בהקפאה כדי למנוע עלייה בטמפרטורה ודנטורציה לאחר מכן של התכונות הביולוגיות של ה-ECM. הקפד להתאים את ההגדרה של מכונת כרסום הקריו לקבלת אבקה דקה לאחר תהליך הטחינה.
    הערה: במחקר זה נעשה שימוש בלבלב מתורמים עם BMI < 30. לבלב מתורמים עם BMI > 30 הראה נטייה להכיל יותר שומן תוך-פרנכימלי. תהליך הליופיליזציה אינו נחשב אופטימלי ועלול להיות מעוכב על ידי תכולת השומן. אם לאחר הליופיליזציה הרקמה נראית לעין, יש להשליך אותה מכיוון שהיא לא תהיה אופטימלית לייצור אבקת ה-ECM.

4. מסיסות של ECM הלבלב

הערה: בשלב זה, מלבלב בגודל ממוצע (100 גרם), התשואה של אבקת הלבלב נטולת התאים היא 1-2 גרם.

  1. שוקלים 1 גרם אבקת ECM בעזרת מרית פלסטיק סטרילית.
  2. השג מסיסות בהתאם לפרוטוקולים שתוארו קודם לכן: מסיס 1 גרם ECM ב-100 מ"ל של 0.01 M HCl ו-100 מ"ג פפסין למשך 48 שעות ב-RT עם ערבוב מתמיד28.
  3. לאחר 48 שעות, השתמש ב-NaOH כדי לנטרל את ה-pH (pH = 7) של ה-ECM החומצי תוך שמירה על הכוס המכילה את ה-ECM החומצי על קרח כדי למנוע ג'לציה.
    הערה: קינטיקה של ג'לציה משתנה בהתאם לטמפרטורה, תכולת הקולגן, ה-pH ותמיסת הנטרול. במחקר זה נעשה שימוש ב-0.01 מ' של NaOH. נפח ה-NaOH שנוסף לנטרול ה-pH היה כ-100 מ"ל. שקול למדוד את ה-pH מספר פעמים תוך נטרול תמיסת ה-ECM החומצית.
  4. העבירו את תמיסת ה-ECM הנייטרלית לצינורות צנטריפוגה סטריליים של 50 מ"ל. סוגרים את הצינורות ומכניסים אותם לצנטריפוגה. צנטריפוגה הצינורות המכילים את ה-ECM המסיס במהירות מרבית (12,000 x גרם) למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, העבירו את הצינורות למכסה המנוע של תרבית תאים.
    הערה: לאחר צנטריפוגה של הדגימה, הרכיב הבלתי מסיס של ה-ECM יופקד בתחתית הצינור, בעוד שתמיסת ה-ECM המסיסה תימצא בחלק העליון בסופרנטנט.
  5. באמצעות טכניקות סטריליות, אספו את ה-supernatant של הצינור המכיל את תמיסת ה-ECM המסיס והעבירו אותו לצינורות טריים של 50 מ"ל, עד למקסימום של 25 מ"ל לשפופרת.
  6. אחסן את צינורות תמיסת ה-ECM ב-80 מעלות צלזיוס.

5. ייצור אבקת ECM בלבלב – ליופיליזציה ואחסון

  1. לאחר לפחות 24-40 שעות של אחסון של תמיסת ה-ECM המסיסה ב-80 מעלות צלזיוס, העבירו את הצינורות למייבש הקפאה.
  2. העבירו את החומר הקפוא למייבש הקפאה, וודאו שהחומר לא יפשיר.
    הערה: שלב הליופיליזציה אורך כ-3-5 ימים בהתאם למספר גורמים, כגון כמות החומר בכל צינור שעובר את התהליך והמשטח החשוף לליופיליזציה. מומלץ שתמיסת ה-ECM המסיס לא תעלה על הרמה של 25 מ"ל בכל צינור וכי הצינורות יוקפאו בזווית של 45 מעלות כדי לאפשר ליותר משטח להיחשף בקלות ברגע שהליופיליזציה מתחילה. הסר את המכסים מצינור הבז לפני הליופיליזציה.
  3. לאחר ליופיליזציה של תמיסת ה-ECM המסיסה, העבירו את החומר למכסה מנוע בדרגת תרבית תאים. לאחר ליופיליזציה מלאה, אבקת ECM עדינה תיראה לעין.
    הערה: התפוקה המתקבלת היא 700 מ"ג מ-1 גרם של רקמה נטולת תאים.
  4. אחסן את אבקת ה-ECM המסיסה או השתמש בה למטרות תרבית תאים.
    הערה: מומלץ לאחסן את ה-ECM ב-4 מעלות צלזיוס לשימוש מיידי, ב-20 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר, וב-80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.

6. אפיון ECM הלבלב עם צביעה היסטולוגית

  1. אסוף חתיכת לבלב מקומי זמן קצר לאחר מסירת האיבר ולפני הדה-סלולריזציה. תקן את זה למשך 24 שעות בפורמלין 10%. שוטפים את הדגימות במים דה-יונים. מייבשים אותו באלכוהול מדורג לפני הטמעתו בפרפין ופורסים לחלקים של 5 מ"מ.
  2. בתום תהליך הדסלולריזציה, אספו דגימה של החומר הנטול תאים וקבעו אותה למשך 24 שעות בפורמלין של 10%. שוטפים את הדגימה במים נטולי יונים. מייבשים אותו באלכוהול מדורג לפני הטמעתו בפרפין ופורסים לחלקים של 5 מ"מ.
  3. כדי לאמת דה-סלולריזציה מוצלחת, בצע צביעת H&E ו-DAPI הן על הלבלב המקורי והן על המקביל הנטול תאים.
  4. לאפיון היסטולוגי, בצע צביעות טריכרום (MT) וכחול אלצ'יאן (AB) של מאסון, אשר ידגישו את המבנים הקולגיניים וה-GAGs, בהתאמה.

7. אפיון אבקת ה-ECM המסיסה

  1. בצע תכולת DNA וניתוח קולגן כולל של רקמת הלבלב המקורית ואבקת ה-ECM המסיסה כפי שתואר קודם לכן29.
  2. כימות גליקוזאמינוגליקנים סולפטיים (sGAG) על סמך הפרוטוקול המסופק על ידי ערכה זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים). השתמש בספקטרופוטומטר מיקרו-פלטות כדי למדוד תכולת sGAG סולפטית ב-ECM הלבלב באורך גל של 595 ננומטר30.
    הערה: דווח על תכולת ה-DNA כ-ng/mg של רקמה יבשה ותכולת הקולגן וה-GAGs כמיקרוגרם/מ"ג של רקמה יבשה.

8. עטיפת איים אנושיים עם ECM ותרבות

הערה: איי לבלב אנושיים הושגו באופן מסחרי (ראה טבלת חומרים).

  1. עם ההגעה, תרבית איי הלבלב האנושיים בצלחות שאינן מטופלות בתרבית רקמות למשך 24 שעות בתנאים סטנדרטיים עם צפיפות משוערת של 2,000 IEQ בכל צלחת של 10 ס"מ.
  2. תפעל את האיים האנושיים כדי לבדוק את השפעת ה-ECM על הפונקציונליות והכדאיות של האיים עם קבוצות הניסוי הבאות: איים חופשיים, איים עטופים באלגינט ואיים עטופים באלגינט-ECM.
    הערה: קבוצות האיים שהוזכרו לעיל תורבבו במבחנה בתנאים סטנדרטיים עד 8 ימים כדי להעריך את השפעת ה-ECM על הפונקציונליות והכדאיות של האיים.
  3. שקלו אלגינט על משקל ותלו אותו עם HBSS לתוך צינור צנטריפוגה על מנת לקבל יחס של 1.5% (w/v). הנח את צינור הצנטריפוגה על מסובב למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: משקל מולקולרי בין 75-200 kDA ויחס G/M של ≤ 1 דווחו על ידי היצרן עבור האלגינט.
  4. שקלו 0.1 מ"ג ECM והשעו אותו ב-1 מ"ל של האלגינט שהוכן בעבר על מנת לקבל ריכוז ECM של 0.1 מ"ג/מ"ל.
  5. עטוף איי לבלב אנושיים באלגינט ואלגינט-ECM על פי פרוטוקול31 שתואר קודם לכן. ההליך מתואר בקצרה להלן.
    1. יש לאסוף ולערבב בעדינות 3,000 IEQ ב-1 מ"ל של אלגינט ו-3,000 IEQ ב-1 מ"ל של אלגינט-ECM בריכוז ECM של 0.1 מ"ג/מ"ל שהוכן בעבר בשלב 8.4.
    2. שאב את המתלים המתקבלים דרך התקן אנקפסולציה מיקרופלואידית המוגדר ל-0.2 מ"ל/דקה וקצב זרימה ולחץ אוויר של 2.0 Pa, בהתאמה.
    3. עם הייצור, אספו את המיקרו-קפסולות ב-100 מ"מ של אמבט CaCl2 עם 10 מ"מ של HEPES. אפשר לאלגינט להצליב למשך 10 דקות.
    4. לפני התרבית, שטפו את האיים המכוסים ב-HBSS בתנאים סטנדרטיים, למשך 2-3 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO2.
    5. הוסיפו את אמצעי התרבות (ראו טבלת חומרים) והחליפו שני שליש מהמדיה כל יומיים עד לסיום הניסוי.
      הערה: יש לבצע את השלבים לעיל הן עבור האיים באלגינט והן עבור האיים באלגינט-ECM.
  6. ביום 8, לאחר האנקפסולציה, בצע הפרשת אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS) וניתוח DNA כדי להעריך את כדאיות ייצור האינסולין והאיים, בהתאמה.
  7. השג תמונות שדה בהיר וצביעה חיה/מתה של איים חופשיים ועטופים כדי להעריך את המורפולוגיה והכדאיות של התאים.
    הערה: הערכה איכותית של התמונות בוצעה כדי להעריך את בריאות האיים. הפרמטרים שנלקחו בחשבון כוללים צורה, גבול, שלמות וקוטר האיים, כמו גם נוכחות של תאים בודדים בתרבית.

9. שחרור אינסולין מגורה גלוקוז (GSIS) ומדידת DNA

הערה: ביום 8, לאחר האנקפסולציה, איי לבלב אנושיים נאספו והודגרו עם בופר קרב, המכילים ריכוזי גלוקוז נמוכים (2.8 מ"מ) וגבוהים (16.8 מ"מ), ואחריהם תמיסת דפולריזציה של KCl (25 מ"מ). אתגר הגלוקוז בוצע עם שינוי של פרוטוקול שתואר קודם לכן32.

  1. הכנס שרף סינון ג'ל בעמודי פוליפרופילן.
  2. הכנס קבוצות טיפול (איים חופשיים או איים עטופים) בחלק האמצעי של שרף סינון הג'ל בתוך עמודי הפוליפרופילן.
  3. תמיסות גלוקוז ודפולריזציה של פיפטה לעמודות הפוליפרופילן שתוארו לעיל ודגירה למשך שעה, בסדר הבא: בצע תקופת דגירה מוקדמת עם תמיסת גלוקוז מולרית נמוכה, ולאחר מכן המשך בסדרה של דגירות עם תמיסת גלוקוז נמוכה, גבוהה, נמוכה ודפולריזציה כאמור בהערה בתחילת סעיף 9.
  4. אוספים את המדיום מכל שלב דגירה ומאחסנים אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח שלאחר מכן.
  5. לאחר הדגירה והאיסוף של תמיסת הדפולריזציה, דגרו על איי לבלב אנושיים עם 1 מ"ל של מאגר מיצוי DNA ואחסנו אותו עד לניתוח נוסף.
  6. מדוד את תכולת האינסולין מהדגירה של הגלוקוז והתמיסה הדפולריזציה באמצעות בדיקת אינסולין ELISA, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  7. מדוד את תכולת ה-DNA ממאגר המיצוי שנאסף בשלב 9.5 באמצעות ערכת בדיקת DNA בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  8. לנרמל את מדידות האינסולין בהתאם לתכולת ה-DNA.

10. ניתוח סטטיסטי

הערה: השוואות קבוצתיות מתייחסות לאותה קבוצה של איים אנושיים עם n = 3 הערכה עצמאית שנערכה עבור כל בדיקה המתוארת בכתב יד זה. הערכים מבוטאים כ-Mean ±-SD.

  1. השתמש בתוכנה סטטיסטית כדי לבצע את מבחן מאן-וויטני להערכת ניתוחי שאריות תאים ושאריות DNA, להשוות בין היליד, הלבלב נטול התאים וה-ECM המסיס.
  2. בצע בדיקת t לא מזווגת להערכת הגליקוזאמינוגליקנים והקולגן בין הלבלב הטבעי, הלבלב נטול התאים וה-ECM המסיס.
  3. בצע ANOVA דו-כיווני עם השוואות מרובות פוסט-הוק של טורקיה לבדיקת גירוי הגלוקוז בהערכת גירוי האיים ביום 8.
  4. שקול מובהקות סטטיסטית ב-p < 0.05 עם ציון של *p < 0.05, **p<0.01, ***p < 0.001 ו-****p < 0.0001.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דגימות לבלב טבעיות וא-תאיות עובדו לצביעה היסטולוגית עם H&E, MT ו-AB. צביעת H&E הראתה היעדר מוחלט של חומר גרעיני ותאים גרעיניים, מה שאישר דה-סלולריזציה מוצלחת. צבעי MT ו-AB הראו את המסגרת של ה-ECM, תוך הדגשת רכיבים קולגניים וסטרומליים איכותיים, בהתאמה (איור 1).

שיטה זו אפשרה ייצור עקבי של אבקת ECM מהלבלב האנושי. בדיקות כימות DNA אישרו פינוי תאים משביע רצון33. ECM לבלב ילידי, תאי ומסיס אופיינו ביוכימית על מנת להעריך את ההרכב הביולוגי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת עבודה זו הייתה לפתח פרוטוקול דה-סלולריזציה עדין יותר ונטול דטרגנטים לייצור ECM בלבלב. תשומת הלב הוקדשה לשימור רכיבי ECM של פרנכימת הלבלב והימנעות מחשיפה ממושכת של רקמות לחומרי ניקוי כימיים יוניים או לא יוניים קונבנציונליים במהלך תהליך הדסלולריזציה.

ההיבט החדשני ביותר בשיטת הדסלולריזציה המפותחת הוא הימנעות מחומרי ניקוי כימיים יוניים ולא יוניים קלאסיים. הניסיון הקודם שלנו בייצור ECM לבלב אנושי 11,12,13,22,34,35 קבע את קו הבסיס לייצור מדיה תומכת בלבלב א-תאי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין אינטרסים פיננסיים מתחרים להצהיר על ידי אף אחד מהמחברים השותפים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מס' 646272. איי לבלב אנושיים התקבלו ממעבדות Prodo, Aliso Viejo, CA 92656.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קורנינג 1 ליטר קל אחיזה פוליסטירן בקבוקי אחסון עם 45 מ"מ מכסיםThermoFisher430518מיכל שימוש עבור דה-סלולריזציה
טחנה קריוגניתSPEX Certiprep6870-230
Deoxyribonuclease I מלבלב בקרSigma AldrichDN25
מים מזוקקיםThermoFisher15230147
Falcon 50 מ"ל חרוטי צינורות צנטריפוגהCorning352070
לבלב אנושי
Mercodia10-1113-01
מגנזיום כלוריד, 1M, סטריליBio-World41320004-1
פפסין מרירית קיבה חזיריתSigma AldrichP7012-5G
אגן שליה ללא מכסה,DeRoyalסטרילי32-881
צינורות כרומטוגרפיה פוליפרהBio-rad731-1500עמודות פוליפרופילן
Quant-iT PicoGreen dsDNA ערכת בדיקתInvitrogenP7589ערכת DNA
SamplePrep קיבולת גדולה מקפיא/טחנה אביזרSPEX6801סט בקבוקון טחינה גדול
Sephadex G-10 חרוזיםCytiva17001001ג'ל סינון שרף
ערכה כירורגיתעם
UltraPur 0.5M EDTA, pH 8.0ThermoFisher15575020
UltraPur 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5ThermoFisher15567027
UltraPure DNase/RNase ללא מים מזוקקיםThermoFisher10977023
ואינסולין-Elisa

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korpos, E., et al. The peri-islet basement membrane, a barrier to infiltrating leukocytes in type 1 diabetes in mouse and human. Diabetes. 62 (2), 531-542 (2013).
  2. Daoud, J., Petropavlovskaia, M., Rosenberg, L., Tabrizian, M. The effect of extracellular matrix components on the preservation of human islet function in vitro. Biomaterials. 31 (7), 1676-1682 (2010).
  3. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S., Maysinger, D. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  4. Paraskevas, S., Maysinger, D., Wang, R., Duguid, T. P., Rosenberg, L. Cell loss in isolated human islets occurs by apoptosis. Pancreas. 20 (3), 270-276 (2000).
  5. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  6. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  7. Kuehn, C., Vermette, P., Fulop, T. Cross talk between the extracellular matrix and the immune system in the context of endocrine pancreatic islet transplantation. A review article. Pathologie Biologie (Paris). 62 (2), 67-78 (2014).
  8. Irving-Rodgers, H. F., et al. Pancreatic islet basement membrane loss and remodeling after mouse islet isolation and transplantation: impact for allograft rejection. Cell Transplant. 23 (1), 59-72 (2014).
  9. Tomei, A. A., et al. Device design and materials optimization of conformal coating for islets of Langerhans. Proceedings of the National Academy Science U. S. A. 111 (29), 10514-10519 (2014).
  10. Miao, G., et al. Basement membrane extract preserves islet viability and activity in vitro by up-regulating alpha3 integrin and its signal. Pancreas. 42 (6), 971-976 (2013).
  11. Peloso, A., et al. The human pancreas as a source of protolerogenic extracellular matrix scaffold for a new-generation bioartificial endocrine pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
  12. Salvatori, M., et al. Extracellular Matrix Scaffold Technology for Bioartificial Pancreas Engineering: State of the Art and Future Challenges. Journal of Diabetes Science and Technology. 8 (1), 159-169 (2014).
  13. Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
  14. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2017).
  15. Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Science Reports. 8 (1), 10452(2018).
  16. Jiang, K., et al. 3-D physiomimetic extracellular matrix hydrogels provide a supportive microenvironment for rodent and human islet culture. Biomaterials. 198, 37-48 (2019).
  17. Citro, A., et al. Biofabrication of a vascularized islet organ for type 1 diabetes. Biomaterials. 199, 40-51 (2019).
  18. Hashemi, J., et al. Application of a novel bioreactor for in vivo engineering of pancreas tissue. Journal of Cell Physiology. 233 (5), 3805-3816 (2018).
  19. Guruswamy Damodaran, R., Vermette, P. Decellularized pancreas as a native extracellular matrix scaffold for pancreatic islet seeding and culture. Journal of Tissue Engineering and Regeneration Medicine. 12 (5), 1230-1237 (2018).
  20. Thivolet, C. H., Chatelain, P., Nicoloso, H., Durand, A., Bertrand, J. Morphological and functional effects of extracellular matrix on pancreatic islet cell cultures. Experimental Cell Research. 159 (2), 313-322 (1985).
  21. Llacua, L. A., Faas, M. M., de Vos, P. Extracellular matrix molecules and their potential contribution to the function of transplanted pancreatic islets. Diabetologia. 61 (6), 1261-1272 (2018).
  22. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  23. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2016).
  24. Hadavi, E., et al. Microwell Scaffolds Using Collagen-IV and Laminin-111 Lead to Improved Insulin Secretion of Human Islets. Tissue Engineering Part C Methods. 25 (2), 71-81 (2019).
  25. Crisostomo, J., et al. ECM-enriched alginate hydrogels for bioartificial pancreas: an ideal niche to improve insulin secretion and diabetic glucose profile. Journal of Applied Biomaterial and Functional Mater. 17 (4), 2280800019848923(2019).
  26. Davis, N. E., et al. Enhanced function of pancreatic islets co-encapsulated with ECM proteins and mesenchymal stromal cells in a silk hydrogel. Biomaterials. 33 (28), 6691-6697 (2012).
  27. Carlo, D. Pancreatic acellular matrix supports islet survival and function in a synthetic tubular device: In vitro and in vivo studies. International Journal of Molecular Medicine. 25 (2), (2009).
  28. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  29. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
  30. Afara, I. O., Prasadam, I., Arabshahi, Z., Xiao, Y., Oloyede, A. Monitoring osteoarthritis progression using near infrared (NIR) spectroscopy. Science Reports. 7 (1), 11463(2017).
  31. Tendulkar, S., et al. A scalable microfluidic device for the mass production of microencapsulated islets. Transplantation Protocol. 43 (9), 3184-3187 (2011).
  32. Fraker, C. A. The Role of Oxygen During In Vitro Culture and Immunoisolation of Islets of Langerhans. University of Miami. , PhD Thesis (2011).
  33. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  34. Edgar, L., et al. Utility of extracellular matrix powders in tissue engineering. Organogenesis. , 1-15 (2018).
  35. Katari, R., et al. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 325-347 (2017).
  36. Peloso, A., Katari, R., Tamburrini, R., Duisit, J., Orlando, G. Glycosaminoglycans as a measure of outcome of cell-on-scaffold seeding (decellularization) technology. Expert Reviews on Medical Devices. 13 (12), 1067-1068 (2016).
  37. Pineda Molina, C., Lee, Y. C., Badylak, S. F. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , 527-536 (2020).
  38. Thomas, F. T., et al. Anoikis, extracellular matrix, and apoptosis factors in isolated cell transplantation. Surgery. 126 (2), 299-304 (1999).
  39. Kenmochi, T., et al. Improved quality and yield of islets isolated from human pancreata using a two-step digestion method. Pancreas. 20 (2), 184-190 (2000).
  40. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  41. Stendahl, J. C., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Extracellular matrix in pancreatic islets: relevance to scaffold design and transplantation. Cell Transplant. 18 (1), 1-12 (2009).
  42. de Vos, P., et al. Enzymes for Pancreatic Islet Isolation Impact Chemokine-Production and Polarization of Insulin-Producing beta-Cells with Reduced Functional Survival of Immunoisolated Rat Islet-Allografts as a Consequence. PLoS One. 11 (1), 0147992(2016).
  43. Smink, A. M., de Vos, P. Therapeutic Strategies for Modulating the Extracellular Matrix to Improve Pancreatic Islet Function and Survival After Transplantation. Current Diabetes Report. 18 (7), 39(2018).
  44. Orlando, G., Soker, S., Stratta, R. J. Organ bioengineering and regeneration as the new Holy Grail for organ transplantation. Annals of Surgery. 258 (2), 221-232 (2013).
  45. Orlando, G., et al. Rethinking Regenerative Medicine From a Transplant Perspective (and Vice Versa). Transplantation. 103 (2), 237-249 (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production
Posted by JoVE Editors on 12/10/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

תגיות

ECMDNA
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים