כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בידוד של spermatocytes מיוטי חיוני כדי לחקור מנגנונים מולקולריים הבסיסיים מיוזיס ו spermatogenesis. למרות שיש פרוטוקולי בידוד תאים הוקמה באמצעות ההכתמה Hoechst 33342 בשילוב עם מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, זה דורש סדרנים תא מצויד לייזר אולטרה סגול. כאן אנו מתארים פרוטוקול בידוד תאים באמצעות כתם סיגלית DyeCycle (DCV), צבע מחייב DNA cytotoxicity נמוך דומה מבנית Hoechst 33342. DCV יכול להתרגש הן על ידי לייזרים אולטרה סגולים והן סגול, אשר משפר את הגמישות של בחירת ציוד, כולל סדרן תאים לא מצויד בלייזר אולטרה סגול. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד שלוש תת-אוכלוסיות של תאים חיים ב-prophase meiotic I, כולל לפטוטן/זיגוטן, פאצ'יטים, וזרעונים דיפלוטן, כמו גם זרעונים עגולים פוסט מיוטיים. אנו גם מתארים פרוטוקול להכנת השעיה חד-תאית מכיסכי עכבר. בסך הכל, ההליך דורש זמן קצר כדי להשלים (4-5 שעות בהתאם למספר התאים הדרושים), אשר מקל על יישומים רבים במורד הזרם.
מבוא
Spermatogenesis הוא תהליך מורכב שבו אוכלוסייה קטנה של תאי גזע spermatogonial לקיים ייצור רציף של מספר גדול של זרעלאורך החיים הבוגרים 1,2. במהלך spermatogenesis, שיפוץ כרומטין דינמי מתרחש כאשר תאי זרע עוברים meiosis לייצר זרעונים haploid3,4,5. בידוד זרעונים מיוטיים חיוני לחקירה מולקולרית, ונקבעו מספר גישות שונות לבידוד זרעון מיוטי, כולל הפרדה מבוססת מום6,7 ומיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות (FACS)8,9,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (פרוטוקול מס'. IACUC2018-0040) במרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי.
1. ציוד והגדרת רייגנט להכנת מתלי תא האשכים
- להכין כל מלאי אנזים 1x תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS) ולאחסן ב -20 ° C.(Table1).
הערה: הכן בכל עת לפני הניסוי. - יום אחד לפני הניסוי: צינורות איסוף מעילים (1.5 מ"ל צינורות) עם סרום של צופר עוברי (FBS) ב-4 מעלות צלזיוס בלילה.
- ביום הניסוי: הגדר את אמבט המים ל-37 מעלות צלזיוס.
- טרום חם של Dulbecco שונה נשר בינוני (DMEM) ב 37 ° C ולהכין 2 מ"ל של 1x מאגר דיסוציאציה עבור כל דגימה ממש לפני השימוש (
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תוצאה מייצגת של פרוטוקול מיון זה מוצגת באיון 3. זמן המיון הכולל של שני אשכים (עכבר אחד) הוא בדרך כלל סביב 3 שעות, אשר תלוי בריכוז של מתלי תא ומהירות המיון. לאחר מיון, הטוהר של spermatocytes מאושר על ידי immunostaining של SYCP3 ו ơH2AX (איור 3A). הטוהר המייצג של שברים של L/Z, P, D spermatocyte הוא סביב 80.4%, 90.6%, ו- 87.6%, בהתאמה(איור 3C). קבענו את שלבי המשנה בהתבסס על הקריטריונים שפרסמנו בעבר19. בקצרה, בשל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מציגים פרוטוקול מעשי ופשוט לבודד תת-אוכלוסיות של spermatocytes וזרעון מעכבר זכר בוגר אחד. כדי להבטיח את האפשרות לשחזור של פרוטוקול זה, קיימים מספר שלבים קריטיים הזקוקים לתשומת לב. לפני עיכול אנזימים, שלב לשטוף שואף להסיר תאים interstitial; לאחר העיכול, שלב זה מסייע להסיר spermatozoa ופסולת. כביסה / צנטריפוגה 3 פעמים חשוב. במתכון מאגר הדיסוציאציה שלנו, השילוב של מספר אנזימים שונים מקל על ניתוק האשכים לתוך המתלה של תא יחיד ללא נזק מוגזם לתא. צנרת בעדינות כדי למנוע גרימת בועות אוויר גם עוזר להגן על שלמות התא. נא בדו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים מתחרים.
תודות
אנו מודים לחברי מעבדות נמקאווה, יושידה ומזאווה על עזרתם; קייטי גרהרט לעריכת כתב היד; מרי אן הנדל לשיתוף הנוגדן H1T, המרכז הרפואי לילדים בסינסינטי (CCHMC) מחקר זרימה Cytometry Core לשיתוף ציוד FACS נתמך על ידי NIH S10OD023410; מענק בסיוע למחקר מדעי (KAKENHI; 17K07424) ל-T.N.; מלגת פוסט-ת'ורי של קרן ללור לא.ס.; AMED-CREST (JP17gm110005h0001) עד ס.י.; מענק פרויקט המחקר על ידי חטיבת שירותי המחקר של אוניברסיטת אזבו, משרד החינוך, התרבות, הספורט, המדע והטכנולוגיה (MEXT)-נתמך בתוכנית עבור פרויקט המיתוג של האוניברסיטה הפרטית למחקר (2016-2019), מענק-בסיוע לסטארט-אפ פעילות מחקרית (19K21196), קרן המדע טוקדה (2019) ומענק תמריץ המחקר של קרן אוהרה (2018) ל-S.M.; המכון הלאומי לבריאות....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שפופרת 1.5 מ"ל | ווטסון | 131-7155C | |
| 100 מ"מ צלחת פטרי | קורנינג, פלקון | 351029 | |
| 15 מ"ל צינור צנטריפוגה | ווטסון | 1332-015S | |
| 5 מ"ל צינור פוליסטירן עם מכסה הצמד מסננת תאים (35 ומיקרו; m רשת ניילון) | קורנינג, פלקון | 352235 | |
| 50 מ"ל צינור צנטריפוגה | ווטסון | 1342-050S | |
| 60 מ"מ צלחת פטרי | קורנינג, פלקון | 351007 | |
| 70 ומיקרו; m רשת ניילון | קורנינג, Falcon | 352350 | |
| סדרן תאים | Sony | SH800S | |
| צנטריפוגה | |||
| קולגנאז, רקומביננטי, ללא בעלי חיים | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| קולגנאז, סוג 1 | Worthington | LS004196 | |
| כיסוי זכוכית | פישר | 12-544-G | |
| ציטוספין 3 | שנדון | ||
| DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד) | פישר | D1306 | ריכוז עבודה: 0.1 μ גרם/מ"ל |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| סרום חמור | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t נוגדן | מתנה ממרי אן הנדל | 1/2000 | |
| האנק מדולל s תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase מאשכי בקר | Sigma | H3506-1G | |
| פוספט חוצץ מלח (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade | Mountant Fisher | P36930 | |
| rH2AX נוגדן | Millipore | 05-635 | ריכוז עבודה: 2 μ גרם/מ"ל |
| חלבון הפריית זרע 56 (Sp56) נוגדן | QED Bioscience | 55101 | ריכוז עבודה: 0.5 μ g / mL |
| מלקחיים ומספריים | |||
| Superfrost / Plus מיקרוסקופ שקופיות | פישר | 12-550-15 | |
| SYCP3 נוגדן | Abcam | ab205846 | ריכוז עבודה: 5 μ גרם/מ"ל |
| TWEEN 20 (פוליסורבט 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle כתם סגול (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| אמבט |
מקורות
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
