הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד וזיהוי הלחמית בעכברים

3.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61672

⸱

1 במאי 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 2Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Clinical Microbiology Laboratory, Department of Pathology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול לבידוד והגברה של חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטטיביים של עכבר אנאירובי באמצעות ספוגית עיניים ייחודית וצעד העשרה מבוסס תרבות עם זיהוי עוקב על ידי שיטות מבוססות מיקרוביולוגיות וספקטרומטריית מסה MALDI-TOF.

תקציר

פני העין נחשבו בעבר מיוחסים חיסוניים ואביוטיים, אך לאחרונה נראה כי קיימת נוכחות קומית קטנה אך מתמשכת. זיהוי וניטור של מיני חיידקים ברירית העין היו מאתגרים בשל השפע הנמוך שלהם וזמינות מוגבלת של מתודולוגיה מתאימה לצמיחה וזיהוי commensal. ישנן שתי גישות סטנדרטיות: שיטות מבוססות תרבות או רצף DNA. השיטה הראשונה בעייתית בשל החיידקים המוגבלים הניתנים לשחזור והגישה השנייה מזהה חיידקים חיים ומתים המובילים לייצוג חריג של מרחב העין. פיתחנו שיטה חזקה ורגישה לבידוד חיידקים על ידי בנייה על טכניקות פולחן מיקרוביולוגיות סטנדרטיות. זוהי טכניקה מבוססת ספוגית, תוך שימוש ב"מעבדה" העשויה ספוגית דקה המכוונת ללחמית התחתונה, ואחריה צעד הגברה עבור סוגים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים. פרוטוקול זה אפשר לנו לבודד ולזהות מינים הלחמית כגון קורינבקטריום spp., קוגולאז סטפילוקוקוס שלילי spp., סטרפטוקוקוס spp., וכו '. הגישה מתאימה להגדרת גיוון קומנסלי בעכברים בתנאי מחלה שונים.

מבוא

מטרת פרוטוקול זה היא לשפר את הבידוד הספציפי של מיקרואורגניזמים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים בני קיימא ונדירים מהלחמית העין כדי לאפיין את המיקרוביום העין. מחקרים מקיפים פרופיל קהילות הרירית commensal על העור, המעיים, דרכי הנשימה ואברי המין ולהראות כי קהילות אלה משפיעים על התפתחות המערכת החיסונית ואת התגובה1,2,3. קהילות עיניים הוכחו להשתנות במהלך פתולוגיות מחלה מסוימות, כגון מחלת עיניים יבשות4, תסמונת סיוגרן5 וסוכרת6. עם זאת, היכולת להגדיר קהילה טיפוסית של משטח עיני מעוכבת על ידי השפע הנמוך יחסית שלהם בהשוואה לאתרי הרירית האחרים6,7,8. זה מעורר מחלוקת אם יש מיקרוביום עיני תושב ואם הוא קיים, אם זה שונה מיקרוביום העור וכתוצאה מכך, ההשפעה המקומית שלה על התפתחות מערכת החיסון המולדת ותגובה. פרוטוקול זה יכול לסייע בפתרון שאלה זו.

בדרך כלל, גישות להגדרת הנישה העין commensal מבוססים על רצף וטכניקות מבוססות תרבות4,7,9. ריצוף 16 S rDNA וניתוח BRISK7 מראים מגוון רחב יותר מאשר טכניקות מבוססות תרבות, אך אינם מסוגלים להבחין בין מיקרואורגניזמים חיים למתים. מכיוון שפני השטח העין עוינים למיקרואורגניזמים רבים בשל תכונות אנטי-מיקרוביאליות של סרט דמעה4 היוצרים מגוון גדול של שברי דנ"א, גישות מבוססות DNA יזהו את הממצאים הללו אשר עשויים להטות את הנתונים לזיהוי חיידקים מתים כחיידקים מקומיים ולא כמזהמים. התוצאה היא זיהוי ואפיון חריגים של מרחב העין כ גבוה יותר בשפע החיידקים ובמגוון10. זה מקשה להגדיר את המיקרוביום העין תושב באמצעות שיטות מבוססות DNA. בעוד, טכניקות סטנדרטיות המבוססות על תרבות אינן מסוגלות לזהות commensals כי העומס הוא נמוך מדי11. השיטה שלנו משפרת על פרקטיקות סטנדרטיות באמצעות ספוגית דקה שיכולה למקד את הלחמית, ובכך למנוע זיהום מעור שכן, כמו גם את הרעיון כי אורגניזמים קיימא יכולים להיות מועשרים על ידי תרבות קצרה בתקשורת צפופה מיזינים במטרה להחיות קיימא אך לא culturable, כמו גם, העשרה עבור מיקרואורגניזמים קיימא נדירים.

התוצאות, שפע יחסי של קומנסלים עיניים לכל ספוגית עיניים, מאפיינות את המיקרוביום תושב הלחמית והן חשובות למטרות השוואתיות. הנתונים שלנו מראים כי יש הבדל בין עור מיקרוביוטה הלחמית, כמו גם מגוון גדול יותר עם גיל מוגבר הבדל ספציפי למין בשפע. יתר על כן, גישה זו מצאה באופן שכפול הבדלים commensal בעכברים בנוקאאוט12. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לתאר את המיקרוביום העין אשר עשוי להשתנות עקב שיטות caging, גיאוגרפיה, או מצב המחלה, כמו גם את ההשפעות המקומיות של מטבוליטים commensal ומוצרים על התפתחות המערכת החיסונית ותגובה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים בעכברים פועלים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. פעל בהתאם להנחיות הבטיחות במעבדה (בהתאם להנחיות המחלקה לבריאות ובטיחות סביבתית מוסדית) בעת עבודה עם מיקרואורגניזמים וחומרים שעלולים להיות מזוהמים. השתמש בכלי קיבול פסולת מתאימים ונהלי טיהור לפני סילוק חומרים מזוהמים שעלולים להיות מזוהמים ביולוגית.

1. הכנת ספוגית עיניים, הגדרת שדה עבודה, עין העכבר מנגבת והעשרה לדוגמה

  1. הכן ספוגיות עיניים סטריליות
    הערה: ספוגיות עיניים סטריליות הן קיסמים מעץ מצופים דק עם שכבה דקה סיבים של כותנה חבטות ועשה בבית.
    1. Autoclave כמות מתאימה של כותנה חבטות קיסמים עבור מספר העכברים להיות מנוכה.
    2. צבוט את חתיכת כותנה באורך חצי סנטימטר עם אגודל ואצבע. להקניט את החבטות על ידי משיכת בקצוות עם אגודלים ואצבעות כדי ליצור שכבה נקבובית אחת שטוחה, לעצור רק לפני החבטות מתפרק (חתיכות קטנות של כותנה מפוזרים לאורך החבטות מתוח מקובלים).
    3. ערבלו את החבטות סביב אחד הקצוות החדים של קיסם השיניים על ידי החזקה קלה של החתיכה המתוחה על קצה קיסם השיניים כשהוא מעוות, ראו איור 1. ספוגית העין "הושלמה" תהיה שכבה דקה מאוד של כותנה נמתח על הקצה, המשתרעת כחצי עד סנטימטר אחד מהקצה.
    4. הכנס ספוגיות "הושלמו" לתוך קסה קטנה, ספוגית בצד למטה לכסות. מובלעת אוטומטית.
  2. הגדרת סביבת העבודה
    1. הכן הרדמה המכילה 2 מ"ל קטמין (100 מ"ג / מ"ל), 400 μL של xylazine (100 מ"ג / מ"ל) ו 27.6 מ"ל של מלוחים סטריליים (0.9% NaCl ב dH2O) בצינור סטרילי 50 mL סטרילי צנטריפוגה. מסנן לעקר ולהרדים aliquot לשימוש מיידי (ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך חודש אחד, תמיד לאפשר שיווי משקל לטמפרטורת החדר לפני השימוש).
    2. לנקות ולנקות את אזור העבודה עם חיטוי כדי למזער את הזיהום.
    3. Aliquot 0.5 מ"ל של מדיה סטרילית לב המוח עירוי (BHI) לתוך שכותרתו 1.5 מ"ל סטרילי microcentrifuge צינורות (1 צינור לכל עכבר ושליטה); מסדרים בארון תקשורת מיקרוצנטריפוגה. שים את המדף על קרח.
    4. הגדרת זרימת עבודה כדלקמן (משמאל לימין): תחנת הרדמה לעכבר (כלוב המכיל עכברים ניסיוניים, כלוב סטרילי ריק, הרדמה בטמפרטורת החדר, מחט 25 G ומזרק 1 מ"ל), תחנת ניקוי עיניים (BHI על קרח, ספוגיות עיניים מעוקרות, מגבות נייר נקיות, תרסיס 70% isopropanol) ותחנת ציפוי (צלחות אגר דם בטמפרטורת החדר, 10 μL פיפטה , 10 טיפים חד פעמיים סטריליים μL, מיכל פסולת biohazard).
  3. עין ספוגה
    1. לנהל 10 μL של הרדמה לכל 1 גרם של מינון משקל העכבר של קטמין ו xylazine בהתאמה תוך-אופן לכל עכבר בוגר ומניחים לתוך כלוב autoclaved. בדיקת הרדמה על ידי סחיטת כרית אחורית; אין תנועה המצביעה על ההמתה המתאימה.
    2. הקצה יד אחת לטיפול רק בעכברים מורדמת וביד השנייה כדי לטפל רק בספוגית העין ובתרבות. לריב, להסיר את העכבר מורדם לחלוטין מהכלוב; מניחים על משטח עבודה נקי ממוקם על צידו עם עין שמאל חשופה. ריסוס ידיים כפפות עם isopropanol, יבש עם מגבת נייר נקייה.
    3. Uncap במיוחד שכותרתו צינור מיקרו צנטריפוגה BHI עם יד ייעודית לטיפול במדיה. מחזירים את הצינור למדף המיקרו-צנטריפוגות על הקרח.  טובלים את קצה כותנה מצופה של ספוגית העין ב BHI, למשוך את ספוגית העין מן הצינור מסתחרר קצה 2 פעמים נגד הצינור הפנימי כדי להסיר נוזל עודף.
    4. עם יד טיפול העכבר, בעדינות להחזיק את העכבר על ידי עורף הצוואר. מצד שני, הניחו את קצה העין על אזור הלחמית המדיאלי של העין השמאלית, ראו איור 2A. לדכא קלות את גלגל העין ולהזיז את הספוגית בתנועת שטיפת חלונות (איור 2B)קדימה ואחורה, בין העפעף התחתון לעין, 10 פעמים. לשמור על לחץ מתמיד.
    5. מבלי לגעת בפרווה, הסר בעדינות את קצה הספוגית, בניצב למקום שבו הוכנס, והנח את צד הכותנה ספוגית למטה ישירות לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה שכותרתו המכיל מדיה BHI. יש למרוח טיפת עין משומנת על העין המטונפת.
    6. תחזיר את העכבר לכלוב.
    7. תן את ספוגית לעמוד במשך 10 עד 15 דקות על קרח ולהסיר ספוגית עיניים עם יד כפפות מעוקרות על ידי ערבוב הקצה במדיה במשך 10 סיבובים. משוך את הספוגית על ידי מערבולת קצה על הקיר הפנימי של צינור מיקרו צנטריפוגה עבור 5 סיבובים. להשליך את הספוגית במיכל biohazard.
    8. חזור על שלבים 1.3.2 עד 1.3.7 עבור כל עכבר ועבור דגימות בקרה (ספוגית עור או פרווה). לעקר כפפות כראוי בין כל ספוגית.
  4. העשרה
    1. להעשיר את המדגם על ידי דגירה של הצינור סטטי במשך 1 שעה ב 37 °C (69 °F)
    2. במהלך הדגירה, תווית טמפרטורת חדר אחד Trypticase סויה עם 5% צלחת אגר דם כבשים (צלחת TSA) לכל עכבר ולחלק לשניים.
    3. לאחר הדגירה של תרבות ספוגית העיניים, יש להסיר דגימות מועשרות מהחממה ומניחים על הקרח.
    4. דגימות מערבולת לערבב ולצלחת בקצרה לפי השרטוט באיור 3A. Aliquot 10 μL של המדגם על צלחת TSA להטות את הצלחת כדי ליצור רצועה, לחזור 2 פעמים.
    5. בצד השני של קו החלוקה של הצלחת, נקודה 10 μL של מדגם על אגר, לחזור 9 פעמים.
    6. צלחות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות, 2 ימים, ו 4 ימים (בתא נקי המונע צלחות אגר ייבוש). מחוזות מושבות ברצועות, הערה מורפולוגיה ולחשב יחידות יוצרות מושבה (CFUs) לכל ספוגית עבור מבודדים דומים מורפולוגית. תסתכל על נקודות עבור אורגניזמים ייחודיים לא שנתפסו ברצועות.

2. צלחת מאסטר, אפיון וזיהוי של מיקרואורגניזמים עיניים

  1. לוח ראשי
    1. ציירו רשתות בגב לוחית TSA (איור 3B). בחר מושבה עם קיסם סטרילי מכל צלחת ספוגית עין העכבר פס ריבוע הלוח הראשי (רשתות), רשת תווית עם מספר המושבה ומידע העכבר. בחר ופלט שלוש מושבות שונות עבור כל מושבה ברורה מורפולוגית.
    2. דגירה את הצלחת לילה ב 37 מעלות צלזיוס. המשך דגירה במשך 96 שעות, בדיקת מדי יום עבור המראה של מבודדים חדשים.
      הערה: אוכלוסיית Commensal תשתנה בהתאם לגיל העכבר, תזונה, מצב המחלה ושיטות caging. אפיון מבודד מבוסס על חיידקים אנאירוביים אירוביים ופקולטיים השולטים שנמצאו במעבדה שלנו.
  2. איפיון
    1. לשכפל13 חיידקים צלחת על מניטול מלח אגר (MSA) ו MacConkey (MAC) צלחות, דגירה לילה ב 37 °C (69 °F). הערה צמיחה עבור כל בידוד ונוכחות של מושבות שעווה או מושבות צהובות עם הילה על MSA.
    2. עבור cocci חיובי גרם, מבחן עם מבחן קטלאז13,14. מניחים טיפה של 3% מי חמצן על מגלשת זכוכית נקייה. באמצעות קיסם סטרילי, לבחור את החיידק המתאים מצלחת ספוגית העין. אין היווצרות בועה מציין סטרפטוקוקוס spp., היווצרות בועה קלה מצביעה על Corynebacterium spp. ואולי Aerococcus spp. היווצרות בועה מהירה מציין סטפילוקוקוס spp.
  3. זיהוי: ניתוח MS של MALDI-TOF
    הערה: זיהויים חיידקיים מתבצעים באמצעות MALDI-TOF ומסד הנתונים של התוכנה. מערכת זו משתמשת בינון ינון לינון בלייזר בסיוע מטריצה של ספקטרומטריית מסת טיסה (MALDI-TOF MS) לפיתוח פרופילי ספקטרום אשר מושווים לספקטרום חיידקי ידוע לזיהוי. E.coli, ATCC 8739, משמש לכיול המערכת.
    1. חיידקי צלחת מבודדים על לוחות TSA המכילים 5% דם כבשים ודגרת לילה עם 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. באמצעות לולאת μL 1, להחיל שכבה דקה של החיידקים הטהורים על שקופית היעד MALDI-TOF; 1 μL של MALDI-TOF MS CHCA פתרון מטריקס (חומצה אלפא-ציאנו-4-הידרוקסיצינמית) מכוסה ומורשה להתייבש באוויר לחלוטין לפני טעינת השקופית לתוך מכשיר MALDI-TOF.
    3. כל מבודד מזוהה בכפילות.
    4. דוחות המכילים ציוני הסתברות העולים על 80%, המצביעים על ערך אפליה גבוה, מתקבלים כתוצאות מהימנות והזיהוי החיידקי מתקבל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תוצאות מייצגות של לוחית ספוגית עיניים המדגימות שיטות שונות לציפוי מוצגות באיור 3A ומציגות מבודדים מגוונים מבחינה מורפולוגית מעכבר C57BL/6. עבור כל איזולט מובהק, המושבות נספרו ברצועה והשפע היחסי, יחידות יוצרות מושבה ייחודיות (CFUs) לכל ספוגית עיניים, מחושבות ומותוות למטרות השוואה. עבור אפיון מיקרוביולוגי, חיידקים נקטפו מצלחות ספוגיות עכבר בודדות כדי לייצר צלחת TSA מאסטר (נוצר על ידי קטיף מבודדים ברורים מורפולוגית משולש מכל צלחת ספוגית עין העכבר). מלוח האב, ביום שלאחר מכן או כאשר הצמיחה מופיעה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשל המצב paucibacterial של פני השטח העין, מעבדות רבות התקשו לבודד commensals עינית7,20, וכתוצאה מכך מספר נמוך של דגימות עם צמיחה, שפע נמוך ומגוון נמוך8. שיטה זו משפרת באופן משמעותי על פרקטיקות תרבות סטנדרטיות4,21 על ידי תוספת של צעד העשרה, כמו גם ספוגית עיניים מעוצבת מחדש וזיהוי על ידי MALDI-TOF MS. שלב ההעשרה מטפל ביכולת התאוששות נמוכה על ידיהגברת העומס החיידקי. העלייה המשמעותית ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

תודות

מימון P30 DK034854 נתמך VY, LB ומחקרים במרכז המארח-מיקרוביום של מסצ'וסטס ומימון מ NIH / NEI R01 EY022054 נתמך MG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.1 עד 10 ומיקרו; l קצה פיפטUSA Scientific1110-300אוטוקלב לפני השימוש
0.5 עד 10 ומיקרו; l פיפט אפנדורףפישר סיינטיפיק13-690-026
מזרק 1 מ"לפישר סיינטיפיקBD309623מזרק אחד לכל קבוצת ספוגית עיניים
1.5 מ"ל שפופרות אפנדורףארה"ב סיינטיפיק1615-5500אוטוקלאב לפני השימוש
1000 ומיקרו טיפ פיפטארה"ב סיינטיפיק1111-2021אוטוקלב לפני השימוש
200 עד 1000&מיקרו; l גילסון פיפטמן (P1000)פישר סיינטיפיקF123602G
25 גרם מחטפישר סיינטיפיק14-826AA1 מחט לכל ספוגית עיניים קבוצה
3% מי חמצןפישר סיינטיפיקS25359
37 & מעלות; Cמעבדה
70% איזופרופנולפישר סיינטיפיקPX1840-4
הזרקת אנה-סד (קסילזין 100 מ"ג/מ"ל)סנטה קרוז בריאות בעלי חייםSC-362949Rx
BD BBL גרם ערכת כתמיםפישר סיינטיפיקB12539
ציודמבער בונסן
מגבות נייר נקיותמעבדה ציוד
כותנה עטלף / כותנה מגולגלת סטריליתCVS
חד פעמי 1 מ"לפיפט פישר סיינטיפיק13-711-9AMלבדיקות כתמי גרם וקטלאז
E.coliATTCATCC 8739
שקופיות זכוכיתפישר סיינטיפיק12-550-A3לבדיקות כתמי גרם וקטלאז
קטמין ( 100 מ"ג / מ"ל)הנרי שיין9950001
Mac Conkey Agar Platesחנות 4321270 פישר סיינטיפיקב -4 מעלות; C עד שמוכן לשימוש
מניטול מלח אגרקרולינה אספקה ביולוגית784641מכינים צלחות לפי הוראות mfr, מאחסנים בטמפרטורה של 4 מעלות; C למשך שבוע
עכבריםמעבדות ג'קסוןC57/BL6J
מנות פטריפישר סיינטיפיק08-757-12לצלחות אגר מלח מניטול
RPI מוח עירוי לב מדיהפישר סיינטיפיק50-488525מכינים לפי הוראות וחיטוי
SteriFlip (0.22 ומיקרו; פוליאסטר סולפון בגודל נקבוביות m)EMD / Millipore, Fisher ScientifcSCGP00525לעיקור הרדמה
צנטריפוגה קורנינג סטריליפישר הכנת הרדמה 430829 מדעיתכלוב
עכבר סטריליציוד
קיסמי שיניים (במבוק עגול)חיטוי יסודותלפני השימוש והכנת
ספוגיתTrypticase Soy Agar II עם 5% צלחות דם של כבשיםחנות Fisher Scientific4321261ב-4 מעלות; C עד שיהיה מוכן לשימוש
Vitek target slideBioMerieux Inc. Durham, NC
Vitek-MSBioMerieux Inc. Durham, NC
Vitek-MS CHCA matrix solutionBioMerieux Inc. Durham, NC411071
טיפות עיניים לשימוש חד פעמיCVS PharmacyBausch and Lomb Soothe טיפות עיניים לסיכה, 28 בקבוקונים, 0.02 אונקיות נוזל כל אחד
ציוד חממהמעבדה צינור מעבדה המטבח

מקורות

  1. Arpaia, N., et al. Metabolites produced by commensal bacteria promote peripheral regulatory T cell generation. Nature. 504 (7480), 451-455 (2013).
  2. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2010).
  3. Nagpal, R., et al. Human-origin probiotic cocktail increases short chain fatty acid production via modulation of mice and human gut microbiome. Scientific Reports. 8 (1), 12649(2018).
  4. Graham, J. E., et al. Ocular pathogen or commensal: a PCR based study of surface bacterial flora in normal and dry eyes. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (12), 5616-5623 (2007).
  5. Wang, C., et al. Sjögren-Like Lacrimal Keratoconjunctivitis in Germ-Free Mice. International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), 565-584 (2018).
  6. Ham, B., Hwang, H. B., Jung, S. H., Chang, S., Kang, K. D., Kwon, M. J. Distribution and diversity of ocular microbial communities in diabetic patients compared with healthy subjects. Current Eye Research. 43 (3), 314-324 (2018).
  7. Doan, T., et al. Paucibacterial microbiome and resident DNA virome of the healthy conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (13), 5116-5126 (2016).
  8. Kugadas, A., Gadjeva, M. Impact of microbiome on ocular health. Ocular Surface. 14 (3), 342-349 (2016).
  9. Dong, Q., et al. Diversity of bacteria at healthy human conjunctiva. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (8), 5408-5413 (2011).
  10. Zegans, M. E., Van Gelder, R. N. Considerations in understanding the ocular surface microbiome. American Journal of Opthalmology. 158 (3), 420-422 (2014).
  11. Fleiszig, S. M., Efron, N. Microbial flora in eyes of current and former contact lens wearers. Journal of Clinical Microbiology. 30 (5), 1156-1161 (1992).
  12. Lu, X., et al. Neutrophil L-Plastin Controls Ocular Paucibacteriality and Susceptibility to Keratitis. Frontiers in Immunology. 11, 547(2020).
  13. Johnson, T. R., Case, C. L. Laboratory Experiments in Microbiology. , Pearson Benjamin Cummings Pubs. San Francisco, CA. (2010).
  14. Reiner, K. Catalase Test Protocol. American Society for Microbiology. , (2010).
  15. UK SMI. Standards for Microbiology Investigation. UK SMI. , Gov.UK. (2014).
  16. Sharp, S. E., Searcy, C. Comparison of mannitol salt agar and blood agar plates for identification and susceptibility testing of Staphylococcus aureus in specimens from cystic fibrosis patients. Journal of Clinical Microbiology. 44 (12), 4545-4546 (2006).
  17. Siegman-Igra, Y., Azmon, Y., Schwartz, D. Milleri group streptococcus--a stepchild in the viridans family. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 31 (9), 2453-2459 (2012).
  18. Mohan, B., Zaman, K., Anand, N., Taneja, N. Aerococcus Viridans: A Rare Pathogen Causing Urinary Tract Infection. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 11 (1), 1-3 (2017).
  19. Senneby, E., Nilson, B., Petersson, A. C., Rasmussen, M. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry is a sensitive and specific method for identification of aerococci. Journal of Clinical Microbiology. 51 (4), 1303-1304 (2013).
  20. Wan, S. J., et al. IL-1R and MyD88 contribute to the absence of a bacterial microbiome on the healthy murine cornea. Frontiers in Microbiology. 9, 1117(2018).
  21. Ozkan, J., et al. Temporal Stability and Composition of the Ocular Surface Microbiome. Scientific Reports. 7 (1), 9880(2017).
  22. Oliver, J. M. The viable but non-culturable state in bacteria. Journal of Microbiology. 43 (1), 93-100 (2005).
  23. Epstein, S. S. The phenomenon of microbial uncultivability. Current Opinion in Microbiology. 16 (5), 636-642 (2013).
  24. Whelan, F. J., et al. Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota. Nature Microbiology. 5 (2), 379-390 (2020).
  25. Raymond, F., et al. Culture-enriched human gut microbiomes reveal core and accessory resistance genes. Microbiome. 7, 56(2019).
  26. Peto, L., et al. Selective culture enrichment and sequencing of feces to enhance detection of antimicrobial resistance genes in third-generation cephalosporin resistant Enterobacteriaceae. PLoS One. 14 (11), 0222831(2019).
  27. Lauer, B. A., Masters, H. B. Toxic effect of calcium alginate swabs on Neisseria gonorrhoeae. Journal of Clinical Microbiology. 26 (1), 54-56 (1988).
  28. Dubois, D., et al. Performances of the Vitek MS matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system for rapid identification of bacteria in routine clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 50 (8), 2568-2576 (2012).
  29. Kawakita, T., et al. double-blind study of the safety and Efficacy of 1%D-3-Hydroxybutyrate eye drops for Dry Eye Disease. Scientific Reports. 6, 20855(2016).
  30. Lee, H. S., Hattori, T., Stevenson, W., Cahuhan, S. K., Dana, R. Expression of toll-like receptor 4 contributes to corneal inflammation in experimental dry eye disease. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 53 (9), 5632-5640 (2012).
  31. Simmons, K. T., Xiao, Y., Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. Inflammatory response to lipopolysaccharide on the ocular surface in a murine dry eye model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (6), 2444-2450 (2016).
  32. Miller, D., Ioviano, A. The role of microbial flora on the ocular surface. Current Opinion in Allergy and Immunology. 9 (5), 466-470 (2009).
  33. Nayyar, A., Gindina, S., Barron, A., Hu, Y., Danias, J. Do epigenetic changes caused by commensal microbiota contribute to development of ocular disease? A review of evidence. Human Genomics. 14 (1), 11(2020).
  34. Stevenson, W., et al. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח המיקרוביום העיניטכניקת שפשוף חיידקיםהעשרה של חיידקים אירובייםזיהוי באמצעות MALDI-TOF MSיחידות יוצרות מושבותפרוטוקול שפשוף עיניפני השטח של העין בעכברגילוי מיקרואורגניזמים חיונייםבידוד חיידקים מהלחמית
בידוד וזיהוי הלחמית בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.