הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד רקמות בטוהר גבוה מפיתוח זרעי שעורה

2.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61681

⸱

26 באוקטובר 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ידני בטוהר גבוה ובקרת איכות של רקמות אימהיות של עובר, אנדוספרם וזרעים במהלך כל התפתחות זרעי השעורה.

תקציר

הבנת המנגנונים המווסתים את התפתחות זרעי הדגנים חיונית לגידול צמחים ולהגדלת היבול. עם זאת, הניתוח של זרעי דגנים מאתגר בשל הגודל הזעיר, האופי הנוזלי של רקמות מסוימות והחיבורים ההדוקים בין הרקמות. כאן, אנו מדגימים פרוטוקול מפורט לדיסקציה של רקמות העובר, האנדוספרם והזרעים האימהיים בשלבים מוקדמים, אמצעיים ומאוחרים של התפתחות זרעי שעורה. הפרוטוקול מבוסס על דיסקציה ידנית של רקמות באמצעות כלים מחודדים ומיקרוסקופ דו-עיני, ולאחריו בקרת טוהר מבוססת ניתוח פלואידי. רקמות אימהיות ועוברים של זרעים הם דיפלואידים, בעוד שהאנדוספרם הוא רקמה טריפלואידית. זה מאפשר ניטור של טוהר הדגימה באמצעות ציטומטריית זרימה. מדידות נוספות חשפו את האיכות הגבוהה של RNA שבודד מדגימות כאלה ואת השימושיות שלהם לניתוח רגישות גבוהה. לסיכום, פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח באופן מעשי רקמות טהורות מדגנים מתפתחים של שעורה מעובדת ואולי גם דגנים אחרים.

מבוא

זרעים הם מבנים מורכבים המורכבים ממספר רקמות ממוצא אימהי והורי1. גרגרי דגנים מייצגים סוג מיוחד של זרע, כאשר החלק הגדול ביותר נוצר על ידי אנדוספרם, רקמה טריפלואידית מיוחדת המגנה ומזינה את העובר. דגנים מספקים כ-60% ממשאבי המזון העולמיים והם התפוקה החשובה ביותר מייצור צמחי2. הידע על תהליכים מולקולריים השולטים בהתפתחות זרעי דגנים חשוב בשל חשיבותם הכלכלית ותפקידם המרכזי ברבייה של צמחים 1,3.

שעורה מתורבתת (Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5.1 Gbp) היא גידול הדגנים הרביעי בחשיבותו בעולם. הוא משמש להזנת בעלי חיים, מזון וביוטכנולוגיה4. מלבד זאת, זהו גם מודל גידול דגנים קלאסי באזור ממוזג מין בעל חשיבות הולכת וגוברת5. המשאבים הגנומיים של שעורה כוללים מפות גנטיות, אוספים של זנים, זנים ומוטנטים, מכלולי גנום והערות באיכות גבוהה וכן נתונים טרנסקריפטומיים של שלבי ההתפתחות העיקריים 5,6,7. כמו כן, גנים של שעורה משמשים לשיפורים גנטיים של דגנים אחרים. עמידות בפני לחצים אביוטיים כגון בצורת ומליחות, פתוגנים ספציפיים ותכולה גבוהה של תרכובות מועילות (למשל, β-גלוקן) הופכים את השעורה למקור רב ערך לתכונות לגידול חיטה8.

התפתחות הזרעים מתחילה על ידי הפריה ביום ההאבקה (DOP). DOP מוגדר על ידי הערכת המורפולוגיה של צלקות ואנתרים על פי סולם וודינגטון (W10.0)9. השיבולת שהכילה פרחים לא מאביקים התאפיינה בצלקת קומפקטית (לא מסועפת) ובאנתרים ירוקים, ואילו הקוצים המואבקים הכילו ספיקלטים מורחבים, צלקת מורחבת ומסועפת, ביצית נפוחה, אנתרים פתוחים ואבקה חופשית. הפרחים ב-DOP ייצגו פנוטיפ ביניים. לאנתרים היה צבע צהוב, הם הופרעו בקלות ואז שחררו אבקה. לסטיגמה היו ענפים סיגמטיים נרחבים של העלי (איור 1C).

פיתוח זרעי שעורה כולל שלושה שלבים חופפים חלקית 1,10. שלב I (0 - 6 ימים לאחר ההאבקה; DAP) מושקת על ידי הפריה כפולה, המאופיינת בריבוי תאים והיעדר סינתזת עמילן; שלב II (7 - 20 DAP) כולל התמיינות ורווח ביומסה גדול המלווה בייצור מולקולות אחסון עמילן וחלבון; שלב III (לאחר 21 DAP) מתאים להבשלת זרעים, הפחתת משקל על ידי ייבוש ותחילת תרדמה. לחלופין, השלבים נקראים מוקדם, אמצעי ומאוחר,בהתאמה 11.

גרגר שעורה מכוסה בקליפות, המורכבות מהלמה, הפלאה והגלומות12. ברוב הגנוטיפים של השעורה, הקליפות עוטפות היטב זרעים יבשים. הזרע עצמו נוצר על-ידי העובר, האנדוספרם והרקמות האימהיות של הזרע (איור 1A). העובר הדיפלואידי מקורו בהפריה של תא הביצית על ידי גרעין תא זרע אחד. בזרע המפותח במלואו, העובר מורכב מהציר העוברי עם הקולוריזה המקיפה את הרדיקל, הקולאופטיל התוחם את מריסטם היורה והעלים הראשוניים, והסקוטלום (קוטילדון)1,10,13,14. האנדוספרם הטריפלואידי הוא תוצאה של הפריה של התא המרכזי הדיפלואידי על ידי גרעין תא הזרע השני. התפשטות האנדוספרם מתחילה בשלב הסינציאלי (קואנוציט), שבו הגרעינים המתחלקים נדחפים לפריפריה על ידי הוואקואול המרכזי. בסוף השלב הסינציטיאלי, מיקרו-צינורות יוצרים רשת רדיאלית סביב הגרעינים ומצביעים על היווצרות דופן התא האנטיקלינלית ותחילת התאית האנדוספרם. התמיינות אנדוספרם מתרחשת במקביל לתאית ומביאה לחמש רקמות עיקריות: האנדוספרם העמילני, תאי ההעברה, שכבות האלורון והתת-אלורון והאזור הסובב את העובר. רקמות אימהיות של זרעים הן מבנה דיפלואידי רב שכבתי ממוצא אימהי המכיל פרי קרום ושכבות זרעים10,12. רקמות אימהיות של זרעים כוללות הקרנה נוצלרית בצד הגבי של התבואה שיש לה תפקיד הקשור להובלה, ומוטמעת באנדוספרם בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות הזרעים15.

figure-introduction-1
איור 1: פיתוח זרעי שעורה. (A) השרטוט הסכמטי של גרגירי דגנים בתוכנית הסגיטלית עם רקמות אימהיות של זרעים מסומנים (SMTs, ירוק), אנדוספרם (END, צהוב), עובר (EMB, כתום) וקליפות (H, אפור). (B) מורפולוגיה של שיבולת שעורה קרוב לאנתזה. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (C) מורפולוגיה של צלקות ואנתרים בשלבים לפני, במהלך ואחרי ההאבקה. הכניסה מציגה פירוט של הצלקת עם גרגרי אבקה (ראשי חץ). סרגל קנה מידה = 5 מ"מ, סרגל כניסה = 200 מיקרומטר. (D) חתכים קשתיים ורוחביים של 4, 8, 16 ו-24 זרעי DAP. (NP, הקרנה נוסלרית) סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

ההתקדמות האחרונה בגנומיקה בתפוקה גבוהה מספקת את הכלים לחקר התפתחות רקמת זרע בודדת. עם זאת, המכשול העיקרי למטרה זו הוא המבנה הקומפקטי וההידבקות ההדוקה של רקמות הזרע1. פיתחנו פרוטוקול לדיסקציה בטוהר גבוה של רקמות זרעים מפיתוח זרעי שעורה עם אפשרות לשימוש לאחר מכן לניתוחים רגישים ביותר, כגון ריצוף RNA. בנוסף, ניתן להתאים את הפרוטוקול המוצג בקלות לדגנים אחרים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. גידול צמחים

הערה: בהתחשב בכך שלצמח שעורה בודד יש בדרך כלל 5 עד 6 טילרים ויש להשתמש רק ב-5 עד 6 השיבוליות האמצעיות של כל שיבולת לדיסקציה, אז התשואה המקסימלית לצמח היא 72 זרעים לשתי שורות ו -216 זרעים לזנים בעלי שש שורות.

  1. כדי להנביט זרעי שעורה, הכינו צלחת פטרי מרופדת בשלוש שכבות של נייר טישו תאית מכוסה בשכבה אחת של נייר פילטר. הרטיבו אותו במים מזוקקים, כך שלא יהיו עודפי מים, הניחו את הזרעים על פני השטח וסגרו את צלחת הפטרי. נייר סינון נמנע מגידול השורשים דרך רקמת התאית. מנביטים את הזרעים במשך 3 ימים בחום של 25 מעלות צלזיוס בחושך.
    הערה: לחלופין, הנביט זרעים על ידי הכנסתם ישירות לתערובת אדמה רטובה (ראה שלב 1.2).
  2. מעבירים זרעים מונבטים עם רדיקל גלוי ויורה של כ -5 ס"מ לעציצי כבול בגודל 5 ס"מ על 5 ס"מ עם תערובת של אדמה וחול (3: 1, v/v). להשקות באופן קבוע. לאחר 10 ימים, העבירו את הצמחים לעציצים בגודל 12 ס"מ על 12 ס"מ מלאים באותה תערובת אדמה.
  3. לגדל את הצמחים בתא אקלימי תחת משטר מבוקר של יום ארוך (16 שעות ביום 20 מעלות צלזיוס, 8 שעות בלילה 16 מעלות צלזיוס; עוצמת אור 200 מיקרומול m-2 s-1; לחות 60%).
    הערה: שעורה אביבית דורשת כ-8-10 שבועות מהזריעה ועד תחילת האנתזה, ללא דרישה לוורנליזציה. שעורה חורפית זקוקה ל-7-8 שבועות של ורנליזציה (בתנאי יום קצרים, 8 שעות ביום 4 מעלות צלזיוס, 16 שעות בלילה 4 מעלות צלזיוס; עוצמת אור 200 מיקרומול מ"ר לשנייה; לחות 85%) כדי לגרום לפריחה.

2. קביעת האבקה

הערה: קביעה מדויקת של האבקה נחוצה להערכה נכונה של התקדמות ההתפתחות. שעורה היא מין המאביק את עצמו. כדי להגדיר את יום ההאבקה (DOP), ניטרנו את יום ההאבקה העצמית. תכונה זו היא ספציפית לזן, אך התחלת בליטה של הסוככים ממעטפת העלים היא אינדיקטור טוב להתקרבות ל-DOP (איור 1B).

  1. פתח את נדן העלה המכסה את השיבולת. השתמש בפינצטה מחודדת כדי לבדוק את האנתרים ואת השחלה בתוך השיבוליות בחלק המרכזי של השיבולת. שיבוליות עם אנתרים צהובים וצלקות "רכות" יאביקו תוך כמה שעות16 ונחשבות כ-DOP (איור 1B).
  2. גזור את הדוקרן ליד קצה השיבולת האחרונה, והסר את עלה הדגל ואת החלק העליון של הסוככים. לאחר מכן, גזרו את 1/3 הגוף העליון בכל שיבולת. זה מייבש את האנתרים ומוביל לפתיחה ושחרור מסונכרנים יותר של אבקה.
  3. מכסים את הדוקרן בשקית זכוכית עם מזהה הדוקרן, מספר הצמח ותאריך DOP מוגדר. זה גם מונע האבקה צולבת, שעלולה לסכן ניסויים ספציפיים.
  4. רשום את המידע לעורך טבלאי. השתמש בנוסחה הבאה כדי לחשב את היום שלאחר ההאבקה (DAP) שבו צריך להתרחש בידוד רקמות.
    xDAP = DOP + x
    x = DAP צפוי
    הערה: הערכים צריכים להיות בתבנית 'נתונים'.
  5. לניתוח רקמות זרעים, אסוף את הקוצים ב-DAP בהתאם ללוח השנה הטבלאי המוכן.

3. דיסקציה של רקמות הזרע

הערה: יש לבצע את השלבים הבאים באמצעות סטריאומיקרוסקופ. הסר את הקליפות לפני החיתוך באמצעות פינצטה. שימו לב שגופות הספינות הופכות יבשות יותר ודביקות יותר מסביבות 16 DAP. כדי לשמור על תנאים פיזיולוגיים ולהימנע מייבוש החומרים הצמחיים במהלך הדיסקציה, יש להרטיב את הדגימות על ידי הכנסתן לטיפה של 1x PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2HPO4, 1.8 מ"מ KH2PO4, pH = 7.4). השתמש בזרע חדש לדיסקציה של כל רקמה כדי למנוע פירוק DNA, RNA או חלבון עקב זמן איסוף דגימה ממושך. לבידוד RNA מחומר מנותח, השתמש רק בחומרים וכימיקלים נטולי RNase. אל תחרוג מזמן החיתוך הכולל של 15 דקות עבור דגימה אחת המורכבת בדרך כלל מרקמות שנותחו מ-5-10 זרעים כדי למזער את פירוק ה-RNA.

  1. הסר את שאר הקליפות באמצעות פינצטה מחודדת לפני כריתת רקמות. לחות עם 1× PBS למשך דקה אחת מסייעת בהסרת שאריות יבשות של השיבולית.
  2. מניחים את הזרע הקלוף על צלחת פטרי עם טיפה של 1× PBS ומנתחים חלקים בודדים בעזרת פינצטה מחודדת, מחט דקה ופיפטה מיקרו-נימית. אסטרטגיה שונה במקצת מיושמת לדיסקציה של רקמות בודדות: רקמות האם של הזרע (שלב 3.3), העובר (שלב 3.4) והאנדוספרם (שלב 3.5).
  3. דיסקציה של רקמות אימהיות של זרעים
    1. חיתוך מזרעים עד 8 DAP
      1. מניחים זרע על הצד הגבי וחותכים בעדינות את הזרע לאורך ציר אורך, ומקלפים רקמות אימהיות של זרעים למעט השכבה האחרונה הגובלת באנדוספרם מהחלק האפיקלי לחלק הבסיסי בעזרת פינצטה.
      2. אוספים רקמות אימהיות של זרעים מ-5 עד 10 זרעים לתוך צינור של 1.5 מ"ל עם 50 מיקרוליטר של 1× PBS, זורקים את המאגר באמצעות פיפטה, שוטפים את הרקמה פעמיים עם 100 מיקרוליטר PBS, מסירים מאגר עודף על ידי פיפטינג וסוגרים את הצינור ומקפיאים בחנקן נוזלי או משתמשים ישירות למדידת פלואידיה ציטומטרית זרימה. כמות החומר מספיקה בדרך כלל ליישום אחד במורד הזרם (למשל, בידוד RNA או מדידת פלואידיה ציטומטרית זרימה).
    2. חיתוך מזרעים לאחר 8 DAP
      1. מניחים זרע בצד הגב, חותכים בעדינות באמצע הצד הגחוני של רקמות האם של הזרע ומקלפים בהדרגה את הרקמה סביב הזרע השלם כולל הקרנה נוסלרית. עבור כל יישום במורד הזרם אסוף ושטוף את הרקמה מ-5 עד 10 זרעים כמתואר בשלב 3.3.1.
  4. דיסקציה של העובר
    1. חיתוך מזרעים ב-8 DAP ומטה
      1. מניחים זרע בצד הגב וחותכים 1/3 מהזרע. מפצלים בזהירות חלק מופרד לשניים ומשחררים את העובר. עבור כל יישום במורד הזרם יש לאסוף ולשטוף את העוברים מ-10 עד 20 זרעים כמתואר ב-3.3.1.
    2. חיתוך מזרעים לאחר 8 DAP
      1. הניחו זרע בצד הגב והוציאו רקמות אימהיות של זרעים מהחלק הבסיסי של הצד הגחוני. הפריעו בעדינות לשכבה הדקה של האנדוספרם סביב היקף העובר על ידי מחט דקה או פינצטה מחודדת וקילפו את העובר. עבור כל יישום במורד הזרם, אסוף ושטוף עוברים מעד 5 זרעים כמתואר ב-3.3.1.
  5. דיסקציה של אנדוספרם
    1. דיסקציה של אנדוספרם סינציאלי מ-4 זרעי DAP.
      1. הניחו זרע בצד הגב, והסירו רקמות אימהיות של זרעים למעט השכבה האחרונה של תאים הגובלים באנדוספרם. יש לנקב בעדינות את השכבה באמצע הצד הגחוני על ידי מחט דקה, ולמצוץ את האנדוספרם הסינציאלי על ידי פעולה נימית באמצעות פיפטה מיקרו-נימית.
      2. עבור כל יישום במורד הזרם אסוף אנדוספרמים נוזליים מ-10 עד 15 זרעים לתוך צינור חדש של 1.5 מ"ל עם מאגר המתאים לניתוח המתוכנן במורד הזרם (כלומר, 1x PBS, מאגר בידוד RNA, מאגר ציטומטריית זרימה). נפח המאגר צריך לשקף את הפרוטוקול עבור היישום המתוכנן במורד הזרם. מקפיאים בחנקן נוזלי.
    2. דיסקציה של אנדוספרם מ-5 עד 8 זרעי DAP
      1. הניחו זרע בצד הגב, והסירו את כל רקמות האם והעובר של הזרעים. עבור כל יישום במורד הזרם, אספו ושטפו את האנדוספרם מ-10 עד 15 זרעים לתוך צינור חדש של 1.5 מ"ל עם 1x PBS והקפיאו בחנקן נוזלי.
    3. דיסקציה של אנדוספרם צלולרי מהזרע לאחר 8 DAP
      1. הניחו זרע בצד הגב, הסירו את כל רקמות האם והעובר של הזרעים. עבור כל יישום במורד הזרם, אסוף ושטוף אנדוספרם מזרע בודד לכל שפופרת כמתואר בשלב 3.3.1.
  6. אחסן את הצינורות עם חומר מבודד בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

4. בקרה על טוהר הרקמות באמצעות ציטומטריית זרימה

הערה: ניתן לבדוק את טוהר הדגימה באמצעות זרימה ציטומטרית לפני בידוד RNA. כיול נכון של מכשירים הוא קריטי לניתוח הדגימה הביולוגית. יש לכוונן את האופטיקה של ציטומטר הזרימה/מנתח הפלואידים באמצעות חרוזי כיול (מיקרוספירות פוליסטירן מוכתמות פלואורסצנטיות אחידות מאוד ביחס לגודלן ועוצמת הקרינה) עד לחדות השיא המקסימלית, בדרך כלל מגיעה למקדם השונות (CV) < 2%. רקמות זרעי דגנים מכילות בעיקר אוכלוסיות של G1, G2 וגרעינים משוכפלים; לכן, מומלץ להשתמש בסולם לוגריתמי. התחל עם רקמת עלה המכילה בעיקר גרעיני G1 ומשמשת כבקרת פלואידיה בסיסית.

  1. השתמש בדגימות טריות שהוכנו על קרח (ראה שלב 3.3.1) או ברקמות קפואות כמתואר17.
    הערה: מכיוון שכל דגימת < 8 DAP משמשת לציטומטריית זרימה, זה מייצג רק בקרה עקיפה. אנו ממליצים לחוקרים לבצע מספר בידודים ומדידות עד להגעה לשיעור גבוה של דגימות טהורות (>90%) לפני שימשיכו לבידוד RNA עם < 8 דגימות DAP.
  2. שחרר את הגרעינים מדגימות העובר 4 ו-8 DAP (לדגימות אחרות ראה שלב 4.4) על ידי הומוגניזציה של הרקמות על ידי 5 עד 10 סיבובים של עלי הפלסטיק בצינור של 1.5 מ"ל המכיל 300 מיקרוליטר של מאגר אוטו I (0.1 M חומצת לימון מונוהידרט, 0.5% (v/v) טווין 20, מסונן דרך מסנן 0.22 מיקרומטר)18.
  3. סנן את התרחיף הגולמי דרך רשת ניילון של 50 מיקרומטר לתוך צינור ניתוח זרימה-ציטומטריה והוסף 600 מיקרוליטר של מאגר Otto II (0.4 M Na2HPO4·12H2O) המכיל 2 מיקרוגרם mL-1 DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)18 כדי להכתים DNA.
  4. הניחו את כל שאר הרקמות (כולל 16 DAP או עוברים מבוגרים יותר) על צלחת פטרי המכילה 500 מיקרוליטר של חוצץ אוטו I והומוגני על ידי קיצוץ עם סכין גילוח. סנן את המתלה כמו בשלב 4.3 והכתים עם 1 מ"ל של מאגר Otto II המכיל DAPI.
    הערה: מניפולציה עם סכין גילוח חד דו-צדדי דורשת תשומת לב מיוחדת. כדי להפחית את הסיכון לפציעה, קיימים סכיני גילוח בקצה יחיד או מחזיקי להבים מיוחדים.
  5. הערך את תכולת ה-DNA הגרעיני של הדגימה באמצעות ציטומטר זרימה. נדרשים לפחות 2000 חלקיקים לדגימה לניתוח טוהר הדגימה.

5. בידוד RNA ומדידת איכות

  1. השתמש ברקמות קפואות כדי למנוע פירוק RNA על ידי ריבונוקלאזים אנדוגניים. מרקמות אימהיות זרעים ודגימות עובר מבודדים RNA באמצעות ערכות זמינות מסחרית או מגיב TRIzol19. בשל תכולת עמילן גבוהה ברקמות האנדוספרם, בודד את סך ה-RNA מכל הדגימות באמצעות פרוטוקולי מיצוי RNA מסחריים על העמודה לרקמות בעייתיות (למשל, ערכת RNA כוללת של צמח ספקטרום) עם טיפול ב-DNase I בעמודה20.
  2. מדוד את ריכוז ושלמות ה-RNA באמצעות פרוטוקול ייעודי לאלקטרופורזה של ג'ל RNA או Agilent 2100 Bioanalyzer.
    הערה: ל-RNA כולל שלם יש רצועות/שיאים ברורים של 18S ו-25S rRNA בגודל סביב 1.9 ו-3.7 קילו-בייט בהתאמה. פס ה-25S rRNA צריך להיות אינטנסיבי בערך פי שניים מרצועת ה-18S rRNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כדי לבצע ניתוח טרנסקריפטומי ספציפי לרקמה של התפתחות זרעי שעורה, הקמנו פרוטוקול לבידוד רקמות בטוהר גבוה. הפרוטוקול מבוסס על ניתוח ידני של רקמות אימהיות של עובר, אנדוספרם וזרעים מדגנים מקולפים (לאחר הסרת גוף ידנית) (איור 1A). הפרוטוקול שימש בהצלחה לבידוד חומרים מכמה זני שעורה קפיציים של שתיים ושש שורות, והדוקרנים נקטפו ב-DAP נתון ושימשו ישירות למיצוי ללא קיבוע (איור 1D).

ההגדרה של DOP הייתה פרמטר קריטי שיש להעריך לפני הנתיחה. קוצי שעורה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן אנו מציגים פרוטוקול המאפשר בידוד בטוהר גבוה של רקמות זרעי שעורה. למרות שהוא פותח ונבדק לשעורה, ניתן לאמץ אותו בקלות לחברים אחרים בשבט Triticeae כגון חיטה, שיבולת שועל, שיפון או טריטיקל27. החלק הראשוני של הפרוטוקול, המתמקד בנתיחת רקמות זרעים, אינו דורש ציוד לא סטנדרטי או יקר ולכן צריך להיות נגיש למדענים רבים. נדרש מכשיר מיוחד ביותר כגון ציטומטר זרימה לניתוח בקרת איכות יסודי. עם זאת, למוסדות מחקר צמחים רבים יש ציטומטר זרימה או מנתח פלואידיה המופעל על יד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר יאן ורנה ולד"ר מחמוד סעיד על תחזוקת ציטומטרי הזרימה, לאווה יאהנובה על הכנת חוצצים, למארי סייפרטובה על רשימת החומרים ולזדנקה בורסובה על הטיפול בצמחים. עבודה זו נתמכה בעיקר ממענק 18-12197S של קרן המדע הצ'כית. A.P. נתמך גם על ידי מלגת J. E. Purkyně מהאקדמיה הצ'כית למדעים ופרויקט ERDF "צמחים ככלי לפיתוח גלובלי בר-קיימא" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.22 אום פילטרMerckSLGSV255F
1.5 מ"ל צינור אפנדורףSarstedt72.690.001
4',6-diamidido-2-phenylindoleInvitrogenD21490
50 um ניילון רשתמשי a Progrersuhelon 120 T
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BA
מכלול נורותDrummond Scientific Company1-000-9000
חרוזי כיולInvitrogenA16502
טישו תאית
חומצת לימון מונוהידראטPenta13830-31000
תא אקליםWeiss Gallenkamp
DNase ISigma Aldrichמסנן DNASE70
ניירFagron
פינצטה מחודדתעדינה כלי מדע עדינים11254-20
ציטומטר זרימהSysmex-Partec
צינור ציטומטריית זרימהSarstedt55.484
שקית
מקפיא
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
חנקן נוזלילינדה
פיפטה מיקרו-נימיתחמשת הפוטונים ביוכימיקליםMGM 1C-20-30
פיניםדקים כלי מדע עדינים26002-20
Na2HPO4לכימיה
Na2HPO4.12H2Oלכנר30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
סירי כבולJiffy5x5 ס"מ
צלחת
מחזיק סיכותFine Science Tools26016-12
עלי פלסטיקp-LabA199001
סירים12x12 ס"מ
סכין גילוחג'ילט
RNAse zapInvitrogenAM9780
מספריים חול
כלים מדעיים עדינים14060-11
ספקטרום קרקע
סטריאומיקרוסקופאולימפוס
P2287
TRIzol ריאגנטInvitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513
נייר זכוכיתפטרי צמח ערכת RNA כוללת סיגמא אולדריץ' STRN50 טווין 20 סיגמא אולדריץ'

מקורות

  1. Sreenivasulu, N., et al. Barley grain development: Toward an integrative view. International Review of Cell and Molecular Biology. 281, 49-89 (2010).
  2. FAO. Cereal supply and demand brief. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: http://www.fao.org (2019).
  3. Baik, B. K., Ullrich, S. E. Barley for food: Characteristics, improvement, and renewed interest. Journal of Cereal Science. 48 (2), 233-242 (2008).
  4. Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Stein, N., Muehlbauer, G. J. , Springer. Cham. Switzerland, AG. 1-10 (2018).
  5. Mascher, M., et al. A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome. Nature. 544 (7651), 427-433 (2017).
  6. Mascher, M. Pseudomolecules and annotation of the second version of the reference genome sequence assembly of barley cv. Morex V2. Morex. , Available from: https://edal.ipk-gatersleben.de (2019).
  7. Rapazote-Flores, P., et al. BaRTv1.0: An improved barley reference transcript dataset to determine accurate changes in the barley transcriptome using RNA-seq. BMC Genomics. 20 (1), 968(2019).
  8. Molnár-Láng, M., Linc, G., Szakács, É Wheat-barley hybridization: The last 40 years. Euphytica. 195 (3), 315-329 (2014).
  9. Waddington, S. R., Cartwright, P. M., Wall, P. C. A quantitative scale of spike initial and pistil development in barley and wheat. Annals of Botany. 51 (1), 119-130 (1983).
  10. Sabelli, P. A., Larkins, B. A. The development of endosperm in grasses. Plant Physiology. 149 (1), 14-26 (2009).
  11. Dante, R. A., Larkins, B. A., Sabelli, P. A. Cell cycle control and seed development. Frontiers in Plant Science. 5, 1-14 (2014).
  12. Rodríguez, M. V., Barrero, J. M., Corbineau, F., Gubler, F., Benech-Arnold, R. L. Dormancy in cereals (not too much, not so little): About the mechanisms behind this trait. Seed Science Research. 25 (2), 99-119 (2015).
  13. Sreenivasulu, N., et al. Gene expression patterns reveal tissue-specific signaling networks controlling programmed cell death and ABA-regulated maturation in developing barley seeds. Plant Journal. 47 (2), 310-327 (2006).
  14. Olsen, O. A. Nuclear endosperm development in cereals and Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 16, suppl_1 214-227 (2004).
  15. Thiel, J., et al. Different hormonal regulation of cellular differentiation and function in nucellar projection and endosperm transfer cells: A microdissection-based transcriptome study of young barley grains. Plant Physiology. 148 (3), 1436-1452 (2008).
  16. Weschke, W., et al. Sucrose transport into barley seeds: Molecular characterization of two transporters and implications for seed development and starch accumulation. Plant Journal. 21 (5), 455-467 (2000).
  17. Staszak, A. M., Rewers, M., Sliwinska, E., Klupczyńska, E. A., Pawłowski, T. A. DNA synthesis pattern, proteome, and ABA and GA signalling in developing seeds of Norway maple (Acer platanoides). Functional Plant Biology. 46 (2), 152-164 (2019).
  18. Otto, F. Chapter 11 DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  19. Fisher Scientific. Procedural guidelines. , (2020).
  20. Spectrum TM. Plant Total RNA Kit. , (2020).
  21. Nowicka, A., et al. Dynamics of endoreduplication in developing barley seeds. Journal of Experimental Botany. , eraa453(2020).
  22. Chen, J., et al. Dynamic transcriptome landscape of maize embryo and endosperm development. Plant Physiology. 166 (1), 252-264 (2014).
  23. Zhang, S., Laurie, A. E., Ae, W., Meng, L., Lemaux, P. G. Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize (Zea mays L.). Springer. 215 (2), 191-194 (2002).
  24. Doll, N. M., et al. Transcriptomics at maize embryo/endosperm interfaces identifies a transcriptionally distinct endosperm subdomain adjacent to the embryo scutellum. Planta. 32 (4), 833-852 (2020).
  25. Yi, F., et al. High temporal-resolution transcriptome landscape of early maize seed development. Plant Cell. 31 (5), 974-992 (2019).
  26. Gómez, E., et al. The maize transcription factor myb-related protein-1 is a key regulator of the differentiation of transfer cells. Plant Cell. 21 (7), 2022-2035 (2009).
  27. Bewley, J. D., Black, M., Halmer, P. The encyclopaedia of seeds: Science, technology and uses. CABI. , Wallingford, UK. (2006).
  28. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  29. Pirrello, J., et al. Transcriptome profiling of sorted endoreduplicated nuclei from tomato fruits: how the global shift in expression ascribed to DNA ploidy influences RNA-Seq data normalization and interpretation. Plant Journal. 93 (2), 387-398 (2018).
  30. Sreenivasulu, N., et al. Transcript profiles and deduced changes of metabolic pathways in maternal and filial tissues of developing barley grains. Plant Journal. 37 (4), 539-553 (2004).
  31. Bian, J., et al. Transcriptional dynamics of grain development in barley (Hordeum vulgare L). International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 962(2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.