הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הכנת פרוסות מוח חריפות מהקוטב הגבי של ההיפוקמפוס ממכרסמים בוגרים

3.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61699

⸱

10 בספטמבר 2020

1Simons Initiative for the Developing Brain, Centre for Discovery Brain Sciences, The University of Edinburgh

במאמר זה

סיכום

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה לייצור פרוסות של ההיפוקמפוס הגבי לבדיקה אלקטרופיזיולוגית. הליך זה משתמש בזילוף עם ACSF מקורר לפני הכנת הפרוסה עם זווית חיתוך כמעט קורונלית המאפשרת שימור של נוירונים עיקריים בריאים.

תקציר

רישומי מהדק טלאי של תאים שלמים מפרוסות מוח של מכרסמים חריפים הם עמוד התווך של המחקר הנוירופיזיולוגי המודרני, ומאפשרים מדידה מדויקת של תכונות תאיות וסינפטיות. עם זאת, יש צורך הולך וגובר לבצע ניתוחים מתאמים בין מצבי ניסוי שונים בנוסף לאלקטרופיזיולוגיה של פרוסות, למשל: אימונוהיסטוכימיה, ביולוגיה מולקולרית, הדמיה in vivo או רישום אלקטרופיזיולוגי; לענות על שאלות מורכבות יותר ויותר של תפקוד המוח. עם זאת, הסקת מסקנות משמעותיות מגישות ניסיוניות שונות אלה אינה פשוטה, שכן אפילו בתוך מבני מוח המתוארים היטב יחסית, קיימת רמה גבוהה של שונות תת-אזורית של תפקוד התא. אין מקום שבו זה מודגם טוב יותר מאשר ב-CA1 של ההיפוקמפוס, שיש לו תכונות גב-גחון מוגדרות היטב, המבוססות על תכונות תאיות ומולקולריות. עם זאת, מחקרים רבים שפורסמו בוחנים דפוסי ביטוי חלבונים או קורלציה התנהגותית בפעילות in vivo בהיקף הגבי של ההיפוקמפוס; ולהסביר ממצאים באופן מכני עם אלקטרופיזיולוגיה תאית מאזור הגחון-מדיאלי. זה מבולבל עוד יותר על ידי העובדה שניסויים אלקטרופיזיולוגיים חריפים רבים מבוצעים בבעלי חיים צעירים, כאשר מצבי ניסוי אחרים מבוצעים בבעלי חיים בוגרים יותר. כדי לטפל בבעיות אלה, שיטה זו משלבת זלוף טרנס-קרדיאלי של מכרסמים בוגרים (>60 יום) עם נוזל מוחי מלאכותי ואחריו הכנת פרוסות קורונליות שעברו שינוי כולל קוטב המחיצה של ההיפוקמפוס הגבי לתיעוד מתאי פירמידה CA1. תהליך זה מוביל ליצירת פרוסות בריאות וחדות של ההיפוקמפוס הגבי המאפשרות חקירה אלקטרופיזיולוגית תאית מבוססת פרוסה המותאמת למדדים אחרים.

מבוא

ההיפוקמפוס הוא ללא ספק המבנה הנחקר ביותר במוח היונקים, בשל גודלו הגדול יחסית והמבנה הלמינרי הבולט שלו. ההיפוקמפוס היה מעורב במספר תהליכים התנהגותיים: ניווט מרחבי, זיכרון הקשרי והיווצרות אפיזודות. זה, בין השאר, נובע מהקלות היחסית של גישה לחלקים הגביים של ההיפוקמפוס במכרסמים לניתוח in vivo . ואכן, תאי הפלט העיקריים נמצאים בדרך כלל במרחק של פחות מ-2 מ"מ מפני השטח של הפיאל.

במכרסמים, ההיפוקמפוס הוא מבנה גדול יחסית, שנוצר מפלישה של הטלנצפלון המשתרע ממחיצת הגב לניאו-קורטקס הגחוני. הוא מורכב משני אזורים עיקריים: הפיתול המשונן, והקורנו אמוניס (CA); האחרון שבהם מחולק ל-3 תת-אזורים מתוארים היטב (CA1-3) המשתרעים לתוך ה-gyrus hilus המשונן (שנקרא בעבר CA4), בהתבסס על קישוריות, אנטומיה תאית ותכונות גנטיות1. מבנה זה נשמר לאורך האזור הגבי-גחוני של ההיפוקמפוס, אם כי עם שינויים גדולים בתכונות הסינפטיות 2,3,4, אנטומיה5, מגוון גנטי 6,7,8 ותפקוד התנהגותי 9,10. מבין אזורי CA, תת-השדה CA1 מורכב ברובו מתאי פירמידה CA1 גלוטמטרגיים (CA1 PCs), שעבורם הוגדרו 3 תת-סוגים11, ואינטרנוירונים מעכבים המהווים ~10% מהנוירונים, אך הם מגוונים מאוד עם למעלה מ-30 תת-סוגים המוגדרים 12,13,14. בנוסף להבדלים ספציפיים אזוריים, הוכח כי להזדקנות נורמלית יש השפעות דרמטיות על העברה סינפטית 15,16,17, אנטומיה18 ופרופיל גנטי19. השיטה הנוכחית של תקן הזהב להערכת המורכבויות של תכונות תאיות וסינפטיות בצורה מבוקרת היא באמצעות הקלטות מהדק טלאי של תאים שלמים מפרוסות מוח חריפות20.

ההבנה של תפקוד ההיפוקמפוס מבוססת במידה רבה על מניפולציה גבית בשל הקלות שבה ניגשים אליו כירורגית או אנטומית למשימות התנהגותיות, השתלת אלקטרודות או חלונות הדמיה, או ביטוי פלסמיד ויראלי. בנוסף, במחקרים רבים, הליכים אלה מבוצעים עם מכרסמים צעירים מאוחרים או בוגרים כדי למנוע שונות במבנה המוח במהלך ההתפתחות. למרות זאת, גישות רבות לבחינת אלקטרופיזיולוגיה תאית ותת-תאית מבוצעות במכרסמים צעירים מוקדמים עד אמצעיים, בעיקר מהחלק הגחוני המדיאלי של ההיפוקמפוס במישור הרוחבי שלו 21,22,23,24,25. כאשר כל ההיקף הגב-גחוני הוערך, נעשה שימוש בקוצץ רקמות כדי לשמור על ההיקף הרוחבי 4,26, או שהניסוי בוצע בחולדות צעירות27 או בעכברים28. יתר על כן, קירור רקמות לפני דיסקציה של המוח ידוע כמשמר את מבנה ההיפוקמפוס בחולדות29 ונוירונים ניאו-קורטיקליים בעכברים30,31. עם זאת, קיים מחסור בפרטים לגבי ייצור פרוסות מוח מהציר הרוחבי הגבי של ההיפוקמפוס, כפי שנוצר על ידי פרוסות עטרה ששונו, בחולדות בוגרות.

פרוטוקול זה מתאר גישה שבאמצעותה ניתן לקבל הקלטות של מהדק טלאי של תא שלם מבודד או זוגות של נוירונים בפרוסות עטרה מותאמות של היפוקמפוס גבי מחולדות מבוגרות, ולאחר מכן זיהוי מורפולוגי פוסט-הוק. פרוסות מוח בריאות מתקבלות לאחר זלוף דרך הלב של נוזל מוחי שדרה מלאכותי מקורר (ACSF), מה שמקל על מדידת תכונות אלקטרופיזיולוגיות ממחשבי CA1 ואינטרנוירונים מקומיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל בעלי החיים נוצרו ותוחזקו בהתאם להנחיות משרד הפנים והמוסדות (HO# P135148E). כל החולדות נשמרו במחזור אור/חושך של 12 שעות וניתנה להן גישה אד-ליביטום למזון ומים.

1. זלוף טרנס-קרדיאלי של ACSF צונן

  1. לפני כל הניסויים, הניחו ~200 מ"ל סוכרוז-ACSF (טבלה 1) במקפיא בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס (עד להקפאה למחצה, לחיתוך) ועוד ~100-200 מ"ל סוכרוז-ACSF מסונן על קרח (לזילוף), מבעבע עם קרבוגן (95% O2/5% CO2).
  2. אספו חולדה בוגרת מהכלוב הביתי שלה והניחו אותה למשך ~30 דקות בכלוב החזקה בחדר ההליכים כדי להתאקלם לרמות הרעש והאור.
  3. הכן את כלי הדיסקציה (איור 1A), את אזור הזלוף ואת חומר ההרדמה הניתן להזרקה (כ-1 מ"ל של 200 מ"ג/מ"ל נתרן פנטוברביטל לריכוז סופי של 100 מ"ג/ק"ג).
  4. הכן תא הרדמה מתאים על ידי הנחת ספוגית קטנה של נייר טישו או צמר גפן בתוכו. הכניסו 1-2 מ"ל של חומר הרדמה איזופלורן נדיף לחומר הסופג בתא.
  5. הנח את החולדה בתא הרדמה להרגעה. עקוב אחר הנשימה עד שקצב הנשימה יורד ל~1 נשימה רדודה בשנייה.
  6. בשלב זה, התחל לבעבע סוכרוז-ACSF קפוא למחצה עם קרבוגן על קרח לשימוש במהלך החיתוך.
  7. שקלו את החולדה ושימו לב למשקלה.
  8. הרדמה סופית של החולדה על ידי הזרקת הנתרן פנטוברביטל המוכן לחלל התוך צפק. המינון של נתרן פנטוברביטל צריך להיות 100 מ"ג/ק"ג, מחושב מהמשקל שנלקח בעבר וריכוז המלאי של התרופה. הנח את החולדה בתא החזקה ואפשר 0.5-5 דקות לתחילת ההרדמה הסופנית.
  9. אשר הפסקת רפלקסים: בדוק גם את מצמוץ הקרנית (גע באישון) וגם את הרפלקסים של צביטת כף הרגל (הרם את הרגל וצבט את הכף האחורית) באמצעות בדיקה קהה (כלומר, מלקחיים מעוגלים). לאחר הפסקת הרפלקסים, הצמד את החולדה ללוח הניתוחי של פוליסטירן או פקק באמצעות מחטים תת-עוריות.
  10. פתח את חלל החזה והנח את הצינורית בבסיס החדר השמאלי של הלב. יש לנקב את הפרוזדור הימני ולהתחיל מיד בזילוף עם סוכרוז-ACSF קר כקרח (0-1 מעלות צלזיוס) (באמצעות משאבה פריסטלטית במהירות של 50 מ"ל לדקה).
  11. לאחר שהתרחשה החלפה מלאה של נוזלים וקירור הגוף (<5 דקות), הסר את הצינורית והסיכות, ולאחר מכן ערף את הראש באמצעות גיליוטינה.
  12. הסירו את הגולגולת בזהירות ובמהירות באמצעות מספרי עצם וכלי עצם של Rongeur (איור 1A,1B).
    1. התחל בביצוע חתכים דו צדדיים דרך הנקב מגנום באמצעות מספרי העצם והסר את הגולגולת לתפר הלמבדה עם הרונג'ור. חותכים בזהירות לאורך תפר קו האמצע עם מספרי העצם ממש מאחורי העיניים.
    2. בצע 2 חתכים דו צדדיים דרך הגולגולת, בניצב לקו האמצע. בעזרת ה-Rongeurs, פתח את הגולגולת לאורך קו האמצע. הקפד במיוחד להסיר פיה מאטר באמצעות מספריים עדינים או מחט מחוברת.
  13. הוציאו את המוח מהגולגולת באמצעות מרית קהה, חתכו את עצבי הגולגולת והראייה בדחיסה מצד לצד. הכניסו את המוח לסוכרוז-ACSF קרבוגן, קפוא למחצה (0-1 מעלות צלזיוס) למשך 1-2 דקות לפני החיתוך.

2. הכנת פרוסות מוח מההיפוקמפוס הגבי

  1. מוציאים את המוח המפוזר מהסוכרוז-ACSF הקפוא למחצה (0-1 מעלות צלזיוס) ומניחים בצלחת פטרי מזכוכית מרופדת בנייר פילטר. הניחו את המוח על פני הגחון שלו.
  2. באמצעות אזמל (להב מס' 22), הסירו את החלק האחורי של המוח ב-~10 מעלות מהאנכי כדי ליצור משטח שטוח כדי להדביק את המוח לבמה (איור 1C).
  3. מרחו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט על שלב הוויברטום. מורחים את הדבק כדי ליצור סרט דק גדול בכ-50% משטח החתך של משטח החתך של המוח.
  4. הרם את המוח מכלי הזכוכית על מרית, חתוך כלפי מטה, בעזרת מברשת כדי להנחות את הרקמה. כתם את המוח בחתיכת רקמה כדי להסיר עודף ACSF והחלק את המוח, חתוך את פני השטח כלפי מטה, אל מרכז הדבק. בעזרת פיפטת פסטר, הוסיפו 1-2 מ"ל סוכרוז-ACSF קר כקרח על המוח כדי להסיר דבק מחסימת המוח.
  5. הכניסו את המוח לתא החיתוך והציפו בסוכרוז חצי קפוא ACSF. השתמשו בכפית או במרית כדי להרחיק עודפי קרח מחסימת המוח, ואז השתמשו בקרבוגנאט (איור 1D).
  6. הזיזו את להב הוויברטום למקומו: ~1 מ"מ מהמשטח הגבי של המוח ואנכית ~1 מ"מ לפני הברגמה. ודא שהלהב שקוע לחלוטין, והסר בועות באמצעות מברשת.
  7. התחילו לחתוך את המוח. כדי לקצץ עד להיפוקמפוס הגבי, השתמש במהירות של 0.1-0.2 מ"מ לשנייה, עם תנועת להב אופקית של 1-1.5 מ"מ וקצב תנודה הדדי של ~90 הרץ. בעת חיתוך ההיפוקמפוס הגבי יש להפחית את המהירות ל-0.05-0.1 מ"מ לשנייה.
  8. אספו פרוסות של היפוקמפוס גבי (באופן נומינלי 3-4 פרוסות מלאות או 6-8 פרוסות חצויות) לכל מוח. אם נדרשות פרוסות אורכיות של היפוקמפוס ונטרו-מדיאלי, המשך לפרוס. לאחר שההיפוקמפוס הגבי נחתך, אין צורך לחתוך רקמה נוספת מעבר למיקום החדרהשלישי . עצרו את הוויברטום, הפרידו את הפרוסה בעזרת מחט היפודרמית כפופה ואספו בבסיס תא החיתוך.
    הערה: פרוסות יכולות להיות בעובי 250-500 מיקרומטר, בהתאם לדרישות הניסוי. עבור הקלטות מההיפוקמפוס הגבי, השתמש בדרך כלל בפרוסות בעובי 400 מיקרומטר כדי לשמר כמה שיותר מהרשת המקומית, תוך מתן אפשרות לתנאי המיקרוסקופיה המתאימים.
  9. חתוך את הפרוסות כך שיכילו רק את ההיפוקמפוס ואת קליפת המוח שמעליו תחת מיקרוסקופ מנתח. מעבירים את הפרוסות לתא שחומם מראש של 35 מעלות צלזיוס כשהמשטח הקדמי פונה כלפי מעלה.
  10. קבע את תא האחסון על סמך הניסוי שיבוצע. כדי להשיג הקלטות טלאי תא שלם או שדה חוץ-תאי באיכות גבוהה קרוב לפני השטח של הפרוסה בתאי הקלטה שקועים, יש לאחסן בתאים שקועים. לחלופין, יש לאחסן בתא ממשק נוזל/גז להקלטות של פעילות רשת תנודתית או הקלטות שדה חוץ-תאיות בממשק.
  11. לתנאי אחסון שקועים, אפשר לפרוסות להתאושש בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות מרגע כניסת הפרוסה האחרונה לתא האחסון. זה מאפשר הפעלה מחדש של תהליכים מטבוליים ואיטום מחדש של נויריטים חתוכים. לאחר 30 דקות, העבירו את תא האחסון לטמפרטורת החדר.

3. רישום הנוירונים הגביים בהיפוקמפוס

  1. לייצר פיפטות תיקון הקלטה מזכוכית נימית. פרוטוקול זה משתמש בזכוכית בורוסיליקט בקוטר חיצוני של 1.5 מ"מ, בקוטר פנימי של 0.86 מ"מ עם נימה, המניבה התנגדות קצה של 3-5 MΩ כאשר היא ממולאת בתמיסה תוך-תאית (טבלה 1). שמור על תמיסות תוך-תאיות מקוררות על קרח כדי למנוע השפלה של רכיבים אנרגטיים ומסוננים לפני השימוש (מסנן מזרק, גודל נקבוביות: 0.2 מיקרומטר).
  2. קרבוגנאט מקליט ACSF ומחמם מראש באמבט מים (35-40 מעלות צלזיוס). העבירו את ה-ACSF הקרבוגן והמחומם מראש לתא ההקלטה באמצעות צינורות זלוף בסיוע משאבה פריסטלטית. התחל זלוף מספר דקות לפני העברת פרוסה לתא.
  3. עצרו את הזלוף והעבירו פרוסת מוח לתא ההקלטה כשהמשטח הקדמי פונה כלפי מעלה. החזיקו את הפרוסה במקומה עם טבעת פלטינה עם סיבי משי בודדים המחוברים ליצירת צורת "נבל". מקם את הפרוסות כך ששכבת הפירמידה של CA1 עוברת בניצב לציר של פיפטת ההקלטה הראשונה.
  4. הפעל מחדש את הזרימה של הקלטת ACSF קרבוגן ומחומם מראש (35-40 מעלות צלזיוס) (טבלה 1) בקצב אופטימלי של 6-8 מ"ל∙דקה-1.
    הערה: קצבי זרימה גבוהים (6-8 מ"ל∙דקה-1) הם אופטימליים לשמירה על פעילות הרשת בפרוסות32. ניתן להשתמש בקצבי זרימה נמוכים יותר (כלומר, 2-3 מ"ל∙דקה-1) כדי לשמור על יציבות הפרוסה עבור ניסויי הדמיה או כאשר אין צורך בפעילות רשת רלוונטית מבחינה ביולוגית.
  5. הערך את איכות הפרוסה באמצעות אופטיקה של ניגודיות הסקה דיפרנציאלית אינפרא אדום (IR-DIC) עם הגדלה אובייקטיבית של פי 40 (הדמיה עם מצלמת CCD). נניח איכות פרוסה טובה אם ניתן לראות מספר רב של מחשבי CA1 בצורת ביצה, בעלי ניגודיות בינונית בפירמידלה בעומקים של 20-30 מיקרומטר מתחת למשטח חלק וגומות קלות (איור 2A). פרוסות באיכות ירודה מכילות מספר רב של תאים בעלי ניגודיות גבוהה, מכווצים או נפוחים, עם משטח פרוסה לא אחיד.
  6. מלאו פיפטות תיקון בתמיסה תוך-תאית (למשל, מבוססת על [Cl-] תוך-תאי של 24 מ"מ) כדי לאפשר השוואה עם נתונים אחרים שפורסמו.
  7. בצע הקלטות מהדק תיקון של תא שלם כפי שתואר קודם לכן22. אל תכלול תאים מהניתוח אם פוטנציאל הממברנה (VM) בפריצה הוא יותר מקוטב מ-50 mV, התנגדות הסדרה היא >30 MΩ; או שההתנגדות הסדרתית משתנה ב->20% במהלך ההקלטה. בתנאי הקלטה אלה, התנגדות הסדרה היא בדרך כלל בטווח של 8 - 25 MΩ ויציבה עד שעה.
  8. כדי לבחון את הריגוש הפנימי של CA1 מההיפוקמפוס הגבי, בדוק תכונות פיזיולוגיות מהותיות עם רישומי תאים שלמים עם הפרוטוקולים הבאים בתצורת מהדק זרם:
    1. מפוטנציאל הממברנה במנוחה ללא הפעלת זרם הטיה, החל צעדי זרם קטנים (-10 pA, 500 אלפיות השנייה) החוזרים על עצמם 30 פעמים.
    2. מ-70 mV עם זרם הטיה מופעל, החל היפר על שלבי זרם דה-פולריזציה של משך 500 אלפיות השנייה (-100 עד +400 pA, 25 צעדים pA) עם 3 חזרות של משפחת עקבות.
    3. החל גל סינוסואידלי של משרעת שיא לשיא של 100 pA, עם תדר משתנה בין 0.1 ל-20 הרץ. חזור על הפעולה 3 פעמים.
    4. הפעל גירוי של 5x 2 nA, 2 ms כדי להניע פוטנציאל פעולה ב-20, 40, 60, 80, 100 הרץ.
    5. מהדק מתח -70 mV, החל 5 דקות של זרמים פוסט-סינפטיים מעוררים ספונטניים (EPSC) להקלטה.
  9. כדי לאטום מחדש תאים לניתוח היסטולוגי לאחר הקלטה מוצלחת, צור טלאים מבחוץ החוצה על ידי נסיגה איטית של פיפטת התיקון. כאשר נצפית עלייה בהתנגדות הסדרה מרמות ניסוי ל->1 GΩ כפי שנמדד על ידי דופק בדיקה של -5 mV, העלה את פוטנציאל ההחזקה ל-40 mV והחזר את הפיפטה במלואה.
  10. בצע הקלטות נוספות באותה פרוסה כדי לספק את העוצמה הסטטיסטית הנדרשת של תכנון הניסוי.
  11. הסר פרוסות מוח המכילות נוירונים מוקלטים מתא ההקלטה, הניח בצלחת של 24 בארות, החלף את ה-ACSF ב-4% פרפורמלדהיד (במאגר פוספט של 0.1 M) והשאיר למשך הלילה.
  12. למחרת, החלף את ה- PFA במאגר פוספט 0.1 M ואחסן עד לעיבוד היסטולוגי. דמיין תאים עם סטרפטווידין מצומד פלואורסצנטי כפי שתואר קודם לכן22.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר הכנת פרוסות ברות קיימא מקוטב המחיצה של ההיפוקמפוס הגבי בחולדות בוגרות. גורם מפתח בפרוטוקול זה הוא זלוף של סוכרוז-ACSF צונן, לפני הכנת הפרוסה, וכתוצאה מכך מחשבי CA1 בריאים קרובים לפני השטח של הפרוסה. איכות הפרוסה המיוצרת מוערכת ויזואלית תחת אופטיקה IR-DIC, ותאים בריאים המזוהים כבעלי גופי תאים גדולים בצורת ביצית ממוקמים בכל ההיקף של שכבת הפירמידלה, מהשכבה הקומפקטית, לתוך שכבת אוריינס (איור 2A, חץ שחור). פרוסות לא בריאות מזוהות כבעל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כאן, מתואר פרוטוקול להפקת פרוסות מוח באיכות גבוהה מההיקף הגבי של ה-CA1 של ההיפוקמפוס, המאפשר הקלטות ממספר נוירונים ברי קיימא באזור זה. הגישה הקומבינטורית של רישום תאים שלמים מפרוסות כמעט קורונליות ואחריה הדמיית נוירונים היא קריטית לאישור כדאיות התא וזהותו.

פרוטוקול זה מייצר באופן אמין פרוסות ברות קיימא משתי סיבות עיקריות. ראשית, השינוי בזווית החיתוך, כסטייה מעטרה אמיתית, מאפשר שימור גדול יותר של הציר הסומטודנדריטי ובכך תפקוד רלוונטי ביולוגית של נוירונים. בהתחש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחבר מצהיר שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

המחבר מבקש להודות לפרופ' דיוויד ג'יי איי ווילי, ד"ר אמה פרקינס, לורה סימואס דה אוליביירה ופרופ' פיטר סי קינד על הערותיהם המועילות על כתב היד ואופטימיזציה של הפרוטוקול, וליוזמת סימונס למוח המתפתח על מתן עלויות הפרסום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תוכנת רכישהמכשירים מולקולרייםpClamp 10
חולדות בוגרותשונותn/aכל זן של חולדה בוגרת (60 יום ומעלה)
מגברהתקנים מולקולרייםAxopatch 700B
תוכנת ניתוחתוכנה חופשיתStimfit
https://github.com/neurodroid/stimfit מספריים עצםFST16152-12סגנון ליטאואר
זכוכית נימיתמכשיר הרווארד30-0060פיפטות זכוכית בורוסיליקט עם נימה בקוטר חיצוני 1.5 מ"מ, קוטר פנימי 0.86 מ"מ.
קרבוגןBOCמגוון95% O2/5% CO2
CCD מצלמהScientificaSciCamProhttps://www.scientifica.uk.com/products/
כימיקלים/ריאגנטיםסיגמא אולדריץ'שונים כל ריאגנטים במעבדה שנרכשו מסיגמא אולדריץ'.
ציאנואקרילט (כלומר RS Pro 3)רכיבי RS918-6872הימנע מתכשירים ציאנואקרילט מבוססי ג'ל
דיגיטייזרהתקנים מולקולרייםDigidata 1550B
סיכות / מחטיםשונה16 מד (למעלה)
מערכת אלקטרופיזיולוגיהScientificaSliceScopehttps://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
מספריים קשתית עדינהFST14568-12עם קצות טונגסטן-קרביד
צלחת פטרי זכוכיתפישר Scientific12911408
מחטים היפודרמיותBD Healthcareשונות16, 18 ו-22 מד
איזופלואורן 100% W / W (כלומר IsoFlo)Zoetis50019100
מספריים מסוג מאיוFST14110-17טיפים בוטים
MicromanipulatorsScientificaMicrostarhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
חנות אמנותמכחולn/aמכחול זיפים עדין, שנרכש מחנות אמנות מקומית.
פיפטה פסטרפישר סיינטיפיק11546963פיפטה פסטר מזכוכית, אך נחתכת כך שהקצה הקהה משמש להעברת פיפטה.
משאבה פריסטלטיתווטסון מרלו12466260משאבה פריסטלטית חד ערוצית
מושך פיפטהSutter InstrumentsP-97דגמים ושיטות אחרות לייצור פיפטות יעבדו באותה מידה.
מזרקי פלסטיק (1, 2, 5 מ"ל)BD Healthcareכלי עצם רונגר שונים
FST16021-14
תא החזקת פרוסותמשקל פרוסה תוצרת בית
/נבל מכשיר הרווארדSHD-22L/15חלופות יתאימו.
נתרן פנטוברביטל (כלומר Pentoject)Animalcare Ltd10347/4014200 מ"ג/מ"ל; ניסוחים אחרים של פנטוברביטל יתאימו
מריתBochem3213זמין ממסנני מזרק פישר סיינטיפיק
מסנני מזרקים של המותג Fisher Scientific 10482012 Corning, 0.22 & micro; קוטר נקבוביות מ '.
דגם VT1200S VibtratomeLeica1491200S001Vibrocheck
Fisher Scientific15167015אמבט מים 5 ליטר, לדוגמה: Grant Instruments™ JBA5 סיינטיפיקה-scicam-pro
בשימוש עם אמבט מים

מקורות

  1. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  2. Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
  3. Babiec, W. E., Jami, S. A., Guglietta, R., Chen, P. B., O'Dell, T. J. Differential regulation of NMDA receptor-mediated transmission by SK channels underlies dorsal-ventral differences in dynamics of schaffer collateral synaptic function. Journal of Neuroscience. 37 (7), 1950-1964 (2017).
  4. Papatheodoropoulos, C. Striking differences in synaptic facilitation along the dorsoventral axis of the hippocampus. Neuroscience. 301, 454-470 (2015).
  5. O'Reilly, K. C., et al. Identification of dorsal-ventral hippocampal differentiation in neonatal rats. Brain Structure and Function. 220 (5), 2873-2893 (2015).
  6. Cembrowski, M. S., et al. Spatial gene-expression gradients underlie prominent heterogeneity of CA1 pyramidal neurons. Neuron. 89 (2), 351-368 (2016).
  7. Cembrowski, M. S., Wang, L., Sugino, K., Shields, B. C., Spruston, N. Hipposeq: a comprehensive RNA-seq database of gene expression in hippocampal principal neurons. elife. 5, 14997(2016).
  8. Leonardo, E., Richardson-Jones, J., Sibille, E., Kottman, A., Hen, R. Molecular heterogeneity along the dorsal–ventral axis of the murine hippocampal CA1 field: a microarray analysis of gene expression. Neuroscience. 137 (1), 177-186 (2006).
  9. Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorsoventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 77 (5), 955-968 (2013).
  10. Kjelstrup, K. B., et al. Finite scale of spatial representation in the hippocampus. Science. 321 (5885), 140-143 (2008).
  11. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  12. Booker, S. A., Vida, I. Morphological diversity and connectivity of hippocampal interneurons. Cell and Tissue Research. 373 (3), 619-641 (2018).
  13. Freund, T. F., Buzsaki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347(1996).
  14. Pelkey, K. A., et al. Hippocampal GABAergic inhibitory interneurons. Physiological Reviews. 97 (4), 1619(2017).
  15. Barnes, C. A., Rao, G., Foster, T. C., McNaughton, B. L. Region-specific age effects on AMPA sensitivity: Electrophysiological evidence for loss of synaptic contacts in hippocampal field CA1. Hippocampus. 2 (4), 457-468 (1992).
  16. Potier, B., Jouvenceau, A., Epelbaum, J., Dutar, P. Age-related alterations of GABAergic input to CA1 pyramidal neurons and its control by nicotinic acetylcholine receptors in rat hippocampus. Neuroscience. 142 (1), 187-201 (2006).
  17. Ekonomou, A., Pagonopoulou, O., Angelatou, F. Age-dependent changes in adenosine A1 receptor and uptake site binding in the mouse brain: An autoradiographic study. Journal of Neuroscience Research. 60 (2), 257-265 (2000).
  18. Pyapali, G. K., Turner, D. A. Increased dendritic extent in hippocampal CA1 neurons from aged F344 rats. Neurobiology of Aging. 17 (4), 601-611 (1996).
  19. Blalock, E. M., et al. Gene microarrays in hippocampal aging: statistical profiling identifies novel processes correlated with cognitive impairment. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3807-3819 (2003).
  20. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  21. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075(2006).
  22. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically-and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706(2014).
  23. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflügers Archive. 443 (3), 491-501 (2002).
  24. Aitken, P., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  25. Siwani, S., et al. OLMα2 cells bidirectionally modulate learning. Neuron. 99 (2), 404-412 (2018).
  26. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The rat hippocampal slice preparation as an in vitro model of ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  27. Dougherty, K. A. Differential developmental refinement of the intrinsic electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons from the rat dorsal and ventral hippocampus. Hippocampus. 30 (3), 233-249 (2020).
  28. Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Reports. 27 (13), 3725-3732 (2019).
  29. Newman, G. C., Qi, H., Hospod, F. E., Grundmann, K. Preservation of hippocampal brain slices with in vivo or in vitro hypothermia. Brain Research. 575 (1), 159-163 (1992).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Springer. 221-242 (2014).
  31. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  32. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
  33. Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79(2017).
  34. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. (10), Cold Spring Harbor Protocols. 4848(2007).
  35. Gee, C. E., Ohmert, I., Wiegert, J. S., Oertner, T. G. Preparation of slice cultures from rodent hippocampus. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), (2017).
  36. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  37. Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-Clamp Analysis. , Springer. 135-193 (2002).
  38. Dougherty, K. A., et al. Differential expression of HCN subunits alters voltage-dependent gating of h-channels in CA1 pyramidal neurons from dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1940-1953 (2013).
  39. Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 48(2013).
  40. Booker, S. A., et al. Presynaptic GABAB receptors functionally uncouple somatostatin interneurons from the active hippocampal network. Elife. 9, 51156(2020).
  41. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  42. Ordemann, G. J., Apgar, C. J., Brager, D. H. D-type potassium channels normalize action potential firing between dorsal and ventral CA1 neurons of the mouse hippocampus. Journal of Neurophysiology. 121 (3), 983-995 (2019).
  43. Arnold, E. C., McMurray, C., Gray, R., Johnston, D. Epilepsy-induced reduction in HCN channel expression contributes to an increased excitability in dorsal, but not ventral, hippocampal CA1 neurons. eNeuro. 6 (2), (2019).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

CA1 של ההיפוקמפוסהיפוקמפוס דורסליPatch-clamp של תא שלםפרפוזיה טרנס-קרדיאליתפרוסות קורונליות משופרותאלקטרופיזיולוגיה של מכרסמיםהכנת פרוסותאלקטרופיזיולוגיה תאיתהכנת פרוסות מוח

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.