הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית

9.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61704

⸱

28 באוגוסט 2020

1Department of Neuroscience, Mortimer B. Zuckerman Mind Brain Behavior Institute, Columbia University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את הכנת פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-סנטורינאלית האופקית (HEC) מעכברים המציגים פעילות אדווה ספונטנית של גל חד. פרוסות מודגרות בתא החזקת ממשק פשוט והקלטות מבוצעות בתנאים שקועים עם נוזל שדרתי מלאכותי זורם במהירות כדי לקדם חמצון רקמות ואת הופעתה הספונטנית של פעילות ברמת הרשת.

תקציר

חריף קוסמים במוח מציע גישה ניסיונית ניתנת להפעלה כדי לקבל תובנות על הארגון והתפקוד של מעגלים עצביים עם רזולוציה של תא יחיד באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, מיקרוסקופיה ופרמקולוגיה. עם זאת, שיקול מרכזי בתכנון ניסויים במבחנה הוא המידה שבה תכשירי פרוסות שונים מסכמים מחדש דפוסים נטורליסטיים של פעילות עצבית כפי שנצפו ב- vivo. במוח שלם, רשת ההיפוקמפוס מייצרת פעילות אוכלוסין מסונכרנת מאוד המשקפת את המצב ההתנהגותי של החיה, כפי שבא לידי ביטוי בתסביכי הגלים החדים (SWRs) המתרחשים במהלך מצבי ההתעוררות או השינה שאינה REM. SWRs וצורות אחרות של פעילות רשת יכולים לצוץ באופן ספונטני בפרוסות היפוקמפוס מבודדות בתנאים מתאימים. על מנת ליישם את ערכת הכלים החזקה של פרוסת המוח על חקירת פעילות רשת ההיפוקמפוס, יש צורך להשתמש בגישה המייעלת את בריאות הרקמות ושמירה על קישוריות תפקודית בתוך רשת ההיפוקמפוס. עכברים נוטרים באופן טרנס-קרדיאלי נוזל שדרתי מלאכותי קר המבוסס על סוכרוז. פרוסות אופקיות המכילות את ההיפוקמפוס נחתכות בעובי של 450 מיקרומטר כדי לשמר קישוריות סינפטית. פרוסות מתאוששות בתא בסגנון ממשק ומועברות לתא שקוע להקלטות. תא ההקלטה מיועד לתדלוק כפול של נוזל שדרתי מלאכותי בקצב זרימה גבוה כדי לשפר את החמצון של הפרוסה. פרוטוקול זה מניב רקמה בריאה המתאימה לחקירת פעילות רשת מורכבת וספונטנית במבחנה.

מבוא

מדידה אלקטרופיזיולוגית מפרוסות היפוקמפוס חיות במבחנה היא גישה ניסיונית רבת עוצמה עם יתרונות רבים. הנסיין יכול להשתמש במיקרוסקופ, מיקרומניפולטורים ומערכת הקלטה כדי לדמיין ולאסוף מדידות ישירות מתאי עצב בודדים ברקמה. פרוסות רקמות נגישות מאוד גם לצילום או משלוח תרופות לניסויים אופטוגנטיים, כימוגנטיים או תרופתיים.

רשת ההיפוקמפוס מייצרת פעילות אוכלוסין סינכרונית מאוד ב vivo, גלוי כמו תנודות בפוטנציאל השדה המקומי חוץ תאי1,2,3,4,5. שיטות פרוסת המוח כבר ממונפות כדי לקבל תובנה לתוך מנגנוני הסלולר והמעגלים שבבסיס תנודות רשת עצביות אלה. עבודת יסוד של מאייר ואח 'הוכיחה כי מתחמי גלים חדים (SWRs) יכולים לצוץ באופן ספונטני בפרוסות של ההיפוקמפוס הגחוני6,7. מחקרים מאוחרים יותר של חוקרים מרובים הבהירו בהדרגה היבטים רבים של SWRs, כולל תפקידם של נוירומודולטורים בוויסות מצב הרשת של ההיפוקמפוס8,9,10 והמנגנונים הסינפטיים המניעים את ההפעלה מחדש במבחנה של הרכבים עצביים שהיו פעילים בעבר במהלך התנהגות ב vivo11. ניסויים בפרוסות מוח סיפקו גם תובנה על תנודות טווח הגמא (30-100 הרץ), מצב רשת היפוקמפוס מובהק האמין לתמוך קידוד זיכרון להיזכר12,13. לבסוף, הכרה בתפקיד המרכזי של ההיפוקמפוס ומבנים הקשורים בפתופיזיולוגיה של אפילפסיה של האונה הרקתית14,15, חוקרים השתמשו בהכנות פרוסת היפוקמפוס כדי לחקור את הדור ואת התפשטות פעילות אפילפטיפורם. Carter et al. הוכיחו כי פרוסות קליפת המוח ההיפוקמפוס-entorhinal בשילוב שהוכנו מבעלי חיים אפילפטיים כרוניים יכול ליצור באופן ספונטני הפרשות אפילפטיפורם במבחנה16. לאחר מכן, Karlócai et al. חקר את המנגנונים שבבסיס הפרשות אפילפטיפורם בפרוסות היפוקמפוס באמצעות נוזל שדרתי מלאכותי שונה (ACSF) עם ריכוזי יון שונה (מופחת Mg2+ או גבוה K+) או תרופות נוספות (4AP או gabazine)17.

חוקרים פיתחו גישות רבות של פרוסות היפוקמפוס השונות בדרכים מרכזיות: (1) אזור ההיפוקמפוס הכלול בפרוסה (גב, ביניים או גחון); (2) נוכחות או היעדר רקמות חוץ-פימפו-קמפליות כגון קליפת המוח האנטורינלית; (3) הכיוון המשמש לחיתוך פרוסות (קורנל, קשת, אופקי או אלכסוני); ו-(4) התנאים שבהם נשמרת הרקמה לאחר ההחתמה (שקועה במלואה ב- ACSF או מוחזקת בממשק של ACSF ואוויר לח ועשיר קרבוגן).

הבחירה באיזו גישה חותכת להשתמש צריכה להיקבע על ידי המטרה הניסיונית. לדוגמה, פרוסות רוחביות או קורנליות של ההיפוקמפוס הגבי המתוחזק בתנאים שקועים שימשו ביעילות רבה לחקירת מעגלים תוך-פיוקמפוסים ופלסטיות סינפטית18,19,20. עם זאת, הכנות כאלה אינן יוצרות באופן ספונטני תנודות ברשת בקלות כמו פרוסות מההיפוקמפוס הגחוני21,22,23. למרות מצב של פעילות SWR מתמשכת ניתן לגרום על ידי גירוי tetanic בפרוסות רוחביות מן ההיפוקמפוס הגבי הגחוני24, SWRs ספונטניים נצפו בקלות רבה יותר פרוסות הגחון7,25.

הבחנה פיזיולוגית ואנטומית אינהרנטית בין ההיפוקמפוס הגבי לבין ההיפוקמפוס הגחוני נתמכת על ידי מחקרים המבוצעים הן ב- vivo והן במבחנה26. הקלטות בחולדות חשפו מקצבי תטא עקביים מאוד לאורך ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, אך קוהרנטיות לקויה בין אזור הגחון לשאר ההיפוקמפוס27. SWRs ב vivo מפיצים בקלות בין ההיפוקמפוס הגבי והבינוני, ואילו SWRs שמקורם בהיפוקמפוס הגחוני נשארים לעתיםקרובות מקומיים 28. התחזיות האסוציאטיביות שמקורן בנוירונים פירמידליים CA3 המתגוררים בפרויקט ההיפוקמפוס הגבי והבינוני למרחקים ארוכים לאורך הציר האורך של ההיפוקמפוס. תחזיות CA3 שמקורן באזורים גחוני להישאר מקומיים יחסית, ולכן נוטים פחות להיות מנותק במהלך תהליך ההחתכה29,30. לפיכך, פרוסות גחון עשויות לשמר טוב יותר את הרשת החוזרת הנחוצה ליצירת סנכרון אוכלוסין. הנטייה של פרוסות גחון כדי ליצור פעילויות רשת ספונטניות במבחנה עשויה גם לשקף רגישות פנימית גבוהה יותר של נוירונים פירמידליים או עיכוב GABAergic חלש יותר בהיפוקמפוס הגחוני בהשוואה לאזורים הגביים יותר31. ואכן, פרוסות היפוקמפוס הגחוני רגישים יותר לפעילות אפילפטיפורם32,33. לפיכך, מחקרים רבים של תנודות רשת ספונטניות8,9,11,24 או פתולוגי16,34,35,36 תנודות רשת השתמשו באופן מסורתי בגישה חתוכה אופקית, לפעמים עם זווית קלה בכיוון הקדמי-עורפי, אשר מניב פרוסות רקמה במקביל למישור הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני.

קישוריות הרשת מושפעת באופן בלתי נמנע מהליך ההחתכה, שכן תאים רבים בפרוסה ינותק. הזווית ועובי הפרוסה והרקמה שנשמרו בהכנה יש לשקול לייעל את הקישוריות במעגלי העניין. מחקרים רבים השתמשו בפרוסות קליפת המוח האופקית המשולבת של ההיפוקמפוס -entorhinal (HEC) כדי לחקור אינטראקציות בין שני המבנים בהקשר של תנודות רשת פיזיולוגיות או פתולוגיות. Roth et al. ביצע הקלטות כפולות משדה המשנה CA1 של ההיפוקמפוס ושכבה V של קליפת המוח האנטורינאלית המדיאלית כדי להדגים התפשטות של פעילות SWR באמצעות פרוסת HEC37. מחקרים רבים על פעילות אפילפטיפורם השתמשו בהכנת פרוסת HEC כדי לחקור כיצד הפרשות אפילפטיפורם מתפשטות דרך רשת קורטיקוהיפוקאמפל16,35,36,38. חשוב לציין כי שימור הלולאה קורטיקוהיפוקאמפל שלם אינו תנאי מוקדם עבור SWRs ספונטניים, הפרשות אפילפטיפורם, או תנודות גמא; תנודות רשת יכולות להיווצר בפרוסות רוחביות של ההיפוקמפוס הגבי או הגחוני ללא רקמות פרהיפוקמפוס מחוברות21,22,23, 25,39,40,41. גורם חשוב יותר עבור הדור הספונטני של תנודות רשת בפרוסות היפוקמפוס עשוי להיות עובי של כל פרוסה, כמו פרוסה עבה יותר (400-550 מיקרומטר) ישמור קישוריות יותר ברשת CA2/CA3 חוזרת21,22,25.

למרות פרוסות HEC אופקי זוויתי (לחתוך עם זווית של כ 12 ° בכיוון הקדמי-עורפי) שימשו כדי ללמוד את הקישוריות הפונקציונלית של לולאת corticohippocampal11,16,34,35,42, הכנות זוויתיות כאלה אינם נדרשים לפעילות רשת ספונטנית43,44,45. עם זאת, השימוש במישור חתך זוויתי מאפשר לחוקר להכין באופן סלקטיבי פרוסות המשמרות בצורה הטובה ביותר את הלאמלה בעלת הכיוון הרוחבי של ההיפוקמפוס הגחוני או הבינוני, תלוי אם מוחלת זווית כלפי מטה או כלפי מעלה (איור 1). גישה זו דומה מבחינה מושגית לזו המשמשת את Papatheodoropoulos et al., 2002, אשר ניתח כל היפוקמפוס חינם ולאחר מכן השתמש במסוק רקמות כדי ליצור פרוסות רוחביות לאורך כל ציר הגב הגחוני21. לאור ההבחנה התפקודית הנ"ל בין ההיפוקמפוס הגחוני והידוכי הגבי, החוקרים צריכים לשקול את המקור האנטומי של פרוסות בעת תכנון ניסויים או פרשנות תוצאות. שימוש ברמפת אגר במהלך הליך ההחתכה הוא דרך פשוטה לייצר פרוסות מההיפוקמפוס הבינוני או הגחוני.

פרוסות היפוקמפוס יכולות להישמר בתא שקוע (עם הרקמה שקועה לחלוטין ב- ACSF), או בתא בסגנון ממשק (למשל, אוסלו או תא האס, עם פרוסות מכוסות רק על ידי סרט דק של מדיה זורמת). תחזוקת ממשק משפר חמצון של הרקמה, אשר מקדם הישרדות עצבית ומאפשר רמות גבוהות מתמשכת של פעילות interneuronal. באופן מסורתי, תנאי הקלטה שקועים משתמשים בקצב זרימה ACSF איטי יותר שאינו מספק חמצון רקמות נאות לביטוי יציב של תנודות ברמת הרשת. בפרוסות היפוקמפוס שקועות תנודות גמא הנגרמות על ידי קרבאכול נצפו רק באופן ארעי46,47, בעוד שהם יכולים להישמר ביציבות בתאי הקלטה ממשק10,48,49. ככזה, מחקרים רבים של פעילות ספונטנית מורכבת במבחנה הסתמכו על חדרי הקלטה ממשק לחקור מתחמי גל חדאדווה 6,7,8,9,10,25,37, תנודות גמא10,13, ופעילות אפילפטיפורם16,38,45,47.

בתא הקלטה בסגנון שקוע, ניתן להשתמש במטרה של מיקרוסקופ טבילה כדי לדמיין תאים בודדים ולמקד באופן סלקטיבי תאים בעלי מראה בריא להקלטות. ההכנה שקועה גם מאפשר שליטה עדינה על milieu הסלולר, כמו טבילה מקלה על פיזור מהיר של תרופות או תרכובות אחרות לרקמה. לפיכך, מתודולוגיה שונה שבה תנודות רשת יציבות נשמרות בתנאים שקועים מייצגת גישה ניסיונית רבת עוצמה. גישה זו באה לידי ביטוי על ידי העבודה של Hájos et al., שבו פרוסות ההיפוקמפוס להתאושש בתא החזקה בסגנון ממשק פשוט במשך כמה שעות לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע שונה עם קצב זרימה גבוה של ACSF (~ 6 mL / min) כדי לשפר את אספקת החמצן לרקמה12,48,49. בתנאים אלה, ניתן לשמור על רמות גבוהות של פעילות interneuron ותנודת רשת ספונטנית יציבה בתא הקלטה שקוע. גישה זו שונה מאפשרת לחוקרים לבצע הקלטות תיקון תא שלם מונחה חזותית ולאפיין את תרומתם של סוגי תאים שזוהו מורפולוגית לתנודות גמא הנגרמות על ידי carbachol12. SWRs יכול להתרחש גם באופן ספונטני פרוסות היפוקמפוס שקוע עם קצב זרימה מהיר של ACSF11,48,49. מאייר ואח ' הדגימו כי פרוסות היפוקמפוס שהתאוששו בתא ממשק לפני המעבר לתא הקלטה שקוע הציגו באופן אמין SWRs ספונטניים, ואילו פרוסות שהתאוששו שקועות בכומתה לפני ההעברה לתא הקלטה שקוע הראו תגובות שדה קטנות יותר, רמות נמוכות יותר של זרמים סינפטיים ספונטניים, ורק לעתים רחוקות מאוד הציגו SWRsספונטניים 43. Schlingloff et al. השתמשו במתודולוגיה משופרת זו כדי להדגים את תפקידם של תאי סל מבטאים parvalbumin בדור של SWRs ספונטני44.

הפרוטוקול הבא מציג שיטת חתך שבאמצעותה ניתן לשחזר נוירונים פעילים באופן ספונטני בפרוסות היפוקמפוס אופקיות בתנאי ממשק ולאחר מכן להישמר בתא הקלטה שקוע המתאים למניפולציות תרופתיות או אופטוגנטיות והקלטות מונחות ויזואלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולומביה (AC-AAAU9451).

1. הכנת פתרונות

  1. הכינו פתרון חיתוך סוכרוז לחיתוך כמתואר בטבלה 1.
    הערה: לאחר הכנת 1 L של פתרון סוכרוז, להקפיא כמות קטנה (כ 100-200 מ"ל) במגש קרח. קוביות קרח סוכרוז קפואות אלה יתמזגו לתוך תרחיף קרח (ראה שלב 4.3).
  2. הכן נוזל שדרתי מלאכותי (ACSF) להקלטה כמתואר בטבלה 2.
  3. הכן 1 M של NaCl עבור פיפטות גירוי על ידי המסת 0.05844 גרם של NaCl ב 1 מ"ל של מים מטוהרים כי כבר מסונן כדי להסיר מתכות עקבות וזיהומים אחרים.
    הערה: פתרון חיתוך סוכרוז ו- ACSF צריך להיות מוכן טרי עבור כל ניסוי.

2. הכינו רמפת אגר

  1. הכן 4% אגר (למשל, 2 גרם אגר ב 50 מ"ל של מים) על ידי המסת אבקת אגר לתוך מים מטוהרים כי כבר מסונן כדי להסיר מתכות עקבות וזיהומים אחרים. מחממים את התערובת במיקרוגל עד שהיא רק מתחילה לרתיחה (כ 30-60 שניות). יוצקים את האגר המותך לתבנית ומאפשרים לו להתקרר ולהתמצק ב-4 מעלות צלזיוס במקרר בשיפוע של כ-12 מעלות.
    הערה: עבור עובש, ניתן להשתמש בכל מיכל זכוכית או פלסטיק להגדיר בזווית, עם אגר מותך מספיק שפכו כדי ליצור רמפה של 4 ס"מ אורך כ 0.8 ס"מ גובה.

3. לביים את אזור ההחתכה

  1. מלא 400 מל המכילה תא התאוששות פרוסה עם כ 250 מל של ACSF; מניחים אותו באמבט מים מחומם ל 32 מעלות צלזיוס ולהתחיל מבעבע עם קרבוגן (95% גז חמצן / 5% גז פחמן דו חמצני).
    הערה: מלאו את ההתאוששות בנוזל מספיק כדי למקם את רשת הניילון של תא המעצר ממש על פני הפתרון, כך שהפרוסות יוחזקו בממשק של תערובת התמיסה החמה והאוויר (איור 1). מניחים חתיכות קטנות של נייר עדשה על רשת ניילון. הפרוסות ישכבו על גבי נייר העדשה, אשר מאוחר יותר ניתן להשתמש בהם כדי להעביר פרוסות בנפרד לתא ההקלטה (ראה שלב 6.6).
  2. מניחים בקבוקון עם תמיסת סוכרוז לתוך דלי קרח כדי לצנן ולהתחיל מבעבע עם פחמימן.
    הערה: יש לחמם ולצנן את תמיסת ההתאוששות והסוכרוז, בהתאמה, עם קרבוגן מבעבע לפחות 30 דקות לפני שהעכבר ממוקם בתא האיזופלוראן.
  3. מוציאים את המגש של קוביות קרח תמיסת סוכרוז קפואה מראש מהמקפיא ומניחים על הספסל להפשרה חלקית.
  4. מניחים חצי אחד של סכין גילוח נקי פיפיות למיקרוטום ומכיילים במידת הצורך. מניחים בצד את החצי השני של סכין הגילוח לשימוש במהלך הניתוח.
  5. הפעל קו קרבוגן ובדיקת טמפרטורה לתוך תא השיתוך ולהקיף בקרח כדי לצנן את התא.
  6. מכינים ספסל נקי או שולחן מכוסה בשני רפידות ספיגה חד פעמיות. לפרוס את כל כלי הניתוח ושלוש חתיכות של קלטת מעבדה על כרית שמאל, שבו זלוף transcardial יבוצע.
    הערה: כלי ניתוח כוללים מספריים בון קטן, מספריים dissector, מרית גדולה / כף, microspatula, אזמל עם להב חדש, מרית, מספריים כירורגיים חדים / בוטים, מלקחיים רקמות גדולות, מלקחיים רקמה קטנה (ראה טבלה של חומרים).
  7. על כרית סופגת אחרת מימין לאזור הזירוי, מניחים פיסת נייר סינון עגולה לתוך המכסה של צלחת פטרי זכוכית בקוטר 100 מ"מ. מניחים את החלק התחתון של צלחת פטרי ליד המכסה ומניחים קו קרבוגן לתוך שתי חתיכות של המנה.
  8. השתמש סכין גילוח או אזמל לחתוך רמפה קטנה של אגר (כ 4 ס"מ לאורך המשטח הזוויתי, 0.8 ס"מ גובה, 2 ס"מ רוחב). חותכים חתיכה של הרמפה מהקצה הגבוה ולהפוך אותו כדי ליצור בלוק גיבוי של אגר. השתמש דבק cyanoacrylate כדי להדביק את רמפת אגר בלוק גיבוי לפלטפורמת החיתוך ולהניח בצד.
    הערה: בלוק הגיבוי של אגר מסייע לייצב את המוח במהלך החיתוך ומספק משטח שעליו ניתן לנתח רקמות מיותרות מכל פרוסה(איור 1).

4. זלוף טרנסקרדיאלי

  1. להשעות מזרק קיבולת 60 מ"ל כמו מאגר עבור פתרון חיתוך סוכרוז כ 18 סנטימטרים מעל הספסל (למשל, באמצעות מהדק מסתובב שלושה ראשים על עמוד אנכי). מחברים את הצינור לתחתית המאגר, מפעילים את הצינור דרך מהדק רולר, ומחברים את הקצה השני של הצינור למחט נקייה של 20 ג'י.
  2. מלאו את מאגר ה-60 מ"ל בכ-30 מ"ל של תמיסת סוכרוז צוננת והכוונו קו קרבוגן לתוך מאגר סוכרוז כדי לבעבע ללא הרף את הפרפוזיט.
    הערה: ודא כי סוכרוז זורם דרך צינורות ומחט ללא כל בועות לכודים. קצב הזרימה צריך להיות מהיר מספיק כדי שיהיה זרם קבוע ומתמשך של סוכרוז נוטף מהמחט.
  3. באמצעות בלנדר, למחוץ ולערבב את סוכרוז קפוא לתוך תרחיף קרח ולהשתמש מרית גדול / כפית כדי להפיץ את תרחיף.
    1. מניחים כמות קטנה של תרחיף סוכרוז סביב הקצוות של מכסה צלחת פטרי זכוכית. מוסיפים כמות קטנה של תרחיף סוכרוז לתחתית צלחת פטרי.
    2. מוסיפים בערך 20-30 מ"ל של תרחיף סוכרוז למאגר נוזלי הזיעה, ומערבבים אותו היטב עם 30 מ"ל של סוכרוז נוזלי צונן עד שהמאגר מכיל תערובת של סוכרוז קר מאוד, נוזלי בעיקר עם תמיסת שארית קפואה.
  4. הנח את העכבר לתוך תא המחובר לאייד isoflurane. עם חמצן זורם בערך 2 L / min, להפוך את החוגה של מאדה כדי לספק isoflurane ב 5% ריכוז ולהתחיל טיימר.
    הערה: שמור על טיימר זה הולך לאורך כל ההחתכה כדי לאמוד כמה מהר הפרוסות מתקבלות. ההליך צריך להיעשות מהר ככל האפשר, כך שהחתכה הושלמה, והרקמה מתאוששת בתא הממשק תוך 15-20 דקות מהחיה הנכנסת לתא האיזופלורן. צפה בעכבר כדי להבטיח מצב של הרדמה עמוקה מושגת. לאחר מינימום של 5 דקות, העכבר צריך להיות מורדם עמוק ולא מגיב לצבוט בוהן.
  5. מיד לפני הסרת העכבר מתא איזופלוראן, מלאו את מכסה צלחת פטרי בתמיסת סוכרוז צוננת לעומק של כ-3-5 מ"מ ומלאו את תחתית צלחת הפטרי בתמיסת סוכרוז צוננת לעומק של כ-1.0 ס"מ.
  6. מעבירים במהירות את העכבר למשטח הספיגה השמאלי ומשתמשים ב-3 פיסות הסרט כדי לאבטח את המזנבות והזנב. בצע קמצוץ בוהן אחורי כדי לוודא שהעכבר אינו מגיב לפני ביצוע חתך כלשהו. באמצעות מלקחיים רקמה גדולה ומספריים כירורגיים, אוהל את העור ולעשות חתך לאורך מתחתית עצם החזה לחלק העליון של החזה. באמצעות מלקחיים למשוך על עצם החזה ולהשתמש במספריים לחתוך דרך הסרעפת.
    הערה: המיקום הראשוני של העכבר וכמה חתכים ראשונים כדי לנתק את הסרעפת צריך להתבצע מהר ככל האפשר כדי להבטיח שהעכבר לא יחזור להכרה. כדי להבטיח עומק נאות של הרדמה לאורך כל ההליך, חרוט האף יכול להיות ממוקם על העכבר כדי לספק isoflurane במהלך זלוף.
  7. השתמש במספריים כדי לחתוך דרך כלוב הצלעות מכל צד, חיתוך בתנועה אחת גדולה לכיוון הנקודה שבה forelimb פוגש את הגוף. עם המלקחיים, להניף את החלק הקדמי של כלוב הצלעות משם למעלה לכיוון הראש, ולאחר מכן להסיר אותו באופן מלא עם חתך אופקי באמצעות מספריים גדולים. להחזיק את הלב במקום באמצעות מלקחיים גדולים ולהכניס את מחט זלוף 20 G לתוך החדר השמאלי. ברגע שהמחט ממוקמת כראוי, הצד השמאלי של הלב צריך להחוויר במהירות כמו פתרון סוכרוז מצונן ממלא את החדר.
  8. השתמש מספריים dissector קטן לחתוך לתוך אטריום הנכון ולאפשר את הדם לזרום מתוך מערכת הדם. אם החתכים מבוצעים כראוי, צריך להיות נזק מינימלי ללב, וזה צריך להמשיך לשאוב לאורך כל הזעתר.
    הערה: חתיכות מגולגלות של נייר טישו יכול לשמש כדי לפתיל את דם פתרון סוכרוז מהלב ולשמור על הראות של מחט זלוף במהלך ההליך.
  9. ודא כי מחט זלוף נשאר במקום ולא נופל מתוך החדר השמאלי. עם קצב זרימה ומיקום נאותים, הכבד יתחיל להחוויר לצבע שיזוף/בז' בהיר עם 20-30 שניות.
  10. לאחר 30-45 שניות, השתמש במספריים הגדולים כדי לערוף את ראשו של העכבר. מחזיקים את הראש ביד שמאל, דוחפים או מקלפים את העור מהגולגולת. אצל חיה מפוזרת היטב, הגולגולת צריכה להיות חיוורת מאוד, והמוח צריך להופיע בצבע ורוד בהיר מאוד (מתקרב לבן) דרך הגולגולת ללא כלי דם גלויים בבירור.

5. לחלץ את המוח לחתוך פרוסות

  1. באמצעות מספריים בון קטן, לעשות שני חתכים לרוחב דרך הגולגולת לכיוון קו האמצע בחלק הקדמי של הגולגולת, ליד העיניים. לעשות שני חתכים נוספים משני צדי בסיס הגולגולת.
  2. מעבירים את הראש לתחתית צלחת הפטרי מזכוכית, שם הוא אמור להיות שקוע בעיקר בתמיסת סוכרוז צוננת. השתמש במספריים בון קטנים כדי לחתוך את קו האמצע לאורך הגולגולת, מושך עם המספריים כדי למזער את הנזק לרקמת המוח הבסיסית. באמצעות מלקחיים רקמה קטנה, לתפוס בחוזקה כל צד של הגולגולת להניף אותו למעלה והתרחקות מהמוח, כמו פתיחת ספר.
  3. השתמש באצבעות יד שמאל כדי להחזיק את מדפים של הגולגולת פתוח ולהכניס את microspatula מתחת למוח ליד נורות חוש הריח. להפוך את המוח מתוך הגולגולת לתוך סוכרוז ולהשתמש microspatula לנתק את גזע המוח. לשטוף את המוח כדי להסיר כל שאריות דם, פרווה, או רקמות אחרות.
  4. השתמש מרית גדולה / כף להעביר את המוח למכסה של צלחת פטרי זכוכית. כאשר החצי השני של סכין הגילוח בעל הקצוות הכפולים הוקצה בעבר, בצע שני חתכים קורונל כדי להסיר תחילה את המוח הקטן ולאחר מכן את החלק הצדדי ביותר של המוח, כולל נורות הריח (איור 1).
  5. החל דבק ציאנואקרילאט על רמפת אגר. בקצרה מאוד למקם את המוח על פיסת נייר מסנן יבש באמצעות מלקחיים רקמה גדולה ולאחר מכן מיד להעביר אותו רמפת אגר, הצבת פני השטח הגחוני של המוח על דבק.
    הערה: עבור פרוסות של ההיפוקמפוס ביניים, המוח צריך להיות מכוון עם הקדמי הפונה במעלה השיפוע של הרמפה, ואת האחורי קרוב יותר הלהב. עבור פרוסות של ההיפוקמפוס הגחוני, לכוון את המוח עם הקצה האחורי הצביע במורד השיפוע של הרמפה, עם הקצה האחורי בחלק העליון של הרמפה, רחוק יותר מן הלהב. בכל מקרה, המוח צריך להיות ממוקם בחלק העליון של הרמפה, כך שהמשטח החתוך של המוח יוצר קשר עם בלוק הגיבוי של אגר(איור 1).
  6. מניחים את פלטפורמת ההחתכה עם האגר והמוח לתוך תא ההחתכה של המיקרוטום וטובלים לחלוטין בתמיסת סוכרוז צוננת. השתמש מרית גדולה / כף להעביר כמה תרחיף סוכרוז לתא, תוך ערבוב להמיס כל סוכרוז קפוא במהירות להוריד את הטמפרטורה של התערובת ~ 1 -2 מעלות צלזיוס.
    הערה: צפה במד הטמפרטורה לאורך כל ההחתכה. אם תמיסת סוכרוז מתחממת מעל 3 מעלות צלזיוס, מוסיפים עוד תרחיף ומערבבים כדי להוריד את הטמפרטורה.
  7. חותכים פרוסות בעובי של 450 מיקרומטר עם מהירות microtome מוגדר 0.07 מ"מ / s. כאשר כל פרוסה משוחררת, השתמש במלקחיים של הרקמה הקטנה ובאזמל חד כדי להפריד תחילה בין שתי ההמיספרות, ולאחר מכן כדי לחתוך רקמה עד שהפרוסה תורכב בעיקר מאזורי ההיפוקמפוס והפרהיפוס(איור 1).
  8. השתמש פיפטה העברת פלסטיק להעביר את הפרוסות בנפרד לתא שחזור ממשק, להבטיח כי הם ממוקמים בממשק של ACSF ואת האוויר עם רק מניסקוס דק של ACSF מכסה את הפרוסות. סגור בחוזקה את מכסה התא ואפשר לפרוסות להתאושש ב 32 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
  9. לאחר ההתאוששות הראשונית ב 32 מעלות צלזיוס, להביא את תא התאוששות ממשק מתוך אמבט המים ומניחים על stirrer להגדיר למהירות איטית, כך בר ערבוב מגנטי מקדם את זרימת הדם של ACSF בתוך התא. אפשרו לו להתקרר בהדרגה לטמפרטורת החדר כשהפרוסות מתאוששות למשך 90 דקות נוספות. ודא כי תא ההתאוששות הוא מבעבע ללא הרף עם פחמימן ולא לאפשר בועות גדולות להילכד מתחת לפרוסות.

6. בצע הקלטות של פוטנציאל שדה מקומי (LFP) של פעילות ספונטנית

  1. היכונו להקלטות LFP על ידי הפעלת כל הציוד הדרוש, כולל המחשב שבו פועלת תוכנת הרכישה, הצג המחובר למחשב, הממריץ, המיקרו-מניפולטור, בקר הטמפרטורה, מקור אור המיקרוסקופ, המצלמה המחוברת למיקרוסקופ, מגבר המיקרואלקטרוניקה, הדיגיטייזר והמשאבה הפריפריאלית. אם אתה משתמש במערכת ואקום מרכזית, פתח את שסתום הקיר כדי להכין את קו הוואקום שיסיר את ACSF מתא ההקלטה.
  2. מלאו את המאגר המחומם ב- ACSF, ולאחר מכן הניחו קצה אחד של הצינור לתוך ה-400 מל המכילה את ה- ACSF המבעבע. הפעל את המשאבה peristaltic כדי לכוון ACSF מן הכף 400 מ"ל אל המאגר מחומם, ומהמאגר ואילך לתא ההקלטה. הקש או צבוט את הצינור כדי לשחרר את כל בועות לכודים.
  3. כוונן את המשאבה המיליסטית כדי להבטיח שקצב הזרימה של ACSF דרך תא ההקלטה יהיה מהיר (~ 8-10 מ"ל/דקה). השתמש בבדיקת טמפרטורה כדי להבטיח כי ACSF הוא 32 °C (69 °F) במרכז תא ההקלטה.
    הערה: אם ACSF מועבר לתא ההקלטה באמצעות משאבה פריסטלית, קצב זרימה גבוה עלול לגרום לתנודות משמעותיות בקצב הזרימה. ניתן להשיג קצבי זרימה עקביים באמצעות עמעום פועם פשוט המורכב מסדרה של מזרקים ריקים המשולבים בצנרת (איור 2).
  4. הכן גירוי והקלטת פיפטות מנימים זכוכית בורוסיליקט באמצעות משיכה חוט מחומם. יש להגדיר את פרוטוקול Puller להניב פיפטות עם התנגדות של 2-3 MOhm לגירוי או אלקטרודות הקלטה פוטנציאליות שדה מקומי.
  5. מילוי פיפטות גירוי עם 1 M NaCl ו- LFP פיפטות עם ACSF.
  6. להדק בקצרה את הצינור ולכבות את המשאבה כדי להשהות את זרימת ACSF. מעבירים פרוסה לתא ההקלטה בעזרת מלקחיים עדינים כדי לתפוס פינה בנייר העדשה שהפרוסה מונחת עליו- הפרוסה תידבק לנייר העדשה. מניחים את נייר העדשה ופורסים לתא ההקלטה כשהפרוסה פונה כלפי מטה, ואז "מקלפים" את נייר העדשה ומשאירים את הפרוסה שקועה בתא ההקלטה. אבטחו את הפרוסה בעזרת נבל.
    הערה: ניתן לרכוש נבלים המיוצרים מראש או מיוצרים במעבדה באמצעות חתיכת נירוסטה בצורת U או פלטינה וסיבי ניילון משובחים.
  7. מניחים פיפטה גירוי מלא NaCl במיקרומניפולטור ידני ולאט לאט לקדם את קצה פיפטה לתוך פני השטח של הפרוסה (למשל, בשכבת רדיואטום שכבה) בזווית של כ 30-45 מעלות. ברגע שקצה הפיפט נכנס לרקמה, מקדמים את הפיפט קדימה לאט ונמנעים מתנועות גדולות בכיוון לרוחב או אנכי שעלולות לגרום נזק לאקסונים שלא לצורך בתוך הפרוסה. מניחים את קצה פיפטה לפחות 50-100 מיקרומטר עמוק לתוך הפרוסה, כדי למנוע תאים ליד פני השטח שנפגעו במהלך השיתוך.
  8. הנח פיפטה LFP מלאה ACSF לתוך מחזיק פיפטה מחובר micromanipulator ממונע. החל לחץ חיובי קל מאוד באמצעות לחץ הפה או מזרק 1 מ"ל מחובר באמצעות שסתום stopcock ואורך קצר של צינורות למחזיק פיפטה.
    הערה: מיקום פיפטות LFP בתוך הפרוסה כדי לתעד את אותות העניין: במקרה של אדוות גל חדות, פיפטה LFP אחת צריכה להיות ממוקמת בפירמידת השכבות (SP) ופיפט שני בשכבה רדיואטום (SR). תצורה זו מאפשרת הקלטות בו-זמניות של הגל החד השלילי ב-SR ותנודת האדווה בתדר גבוה ב-SP (איור 3).
  9. באמצעות micromanipulator לאט לקדם את קצה פיפטה LFP לאזור העניין (למשל, שכבת תא פירמידלי CA1) בזווית של כ 30-45 °. מניחים את קצה פיפטה לפחות 50-100 מיקרומטר עמוק לתוך הפרוסה, כדי למנוע תאים ליד פני השטח שנפגעו במהלך השיתוך. תוך כדי קידום פיפטה LFP, לספק ללא הרף דופק בדיקת מתח קטן באמצעות תוכנת הרכישה ולצפות לעלייה פתאומית בהתנגדות אלקטרודה. הדבר עשוי להצביע על כך שהפיפט סתומה או נלחצה כנגד תא.
  10. לאחר פיפטה LFP ממוקם באזור של עניין, בזהירות לשחרר את הלחץ החיובי על ידי פתיחת השסתום על צינורות מחובר מחזיק פיפטה.
  11. כדי להקליט את ה- LFP במיקום שני בו-זמנית, חזור על שלבים 6.8-6.10 עם פיפטה ומיקרו-מניפולטור שני.
  12. השתמש במגבר microelectrode בתצורת ההידוק הנוכחית כדי לתעד פעילות ספונטנית בפוטנציאל השדה המקומי לאחר שימוש בפונקציית איזון הגשר בתוכנת הרכישה כדי לתקן את ההתנגדות לסדרה של פיפטה. SWRs ספונטניים יופיעו כהטיות חיוביות בפוטנציאל החוץ-תאי של שכבת SP (איור 3).
  13. על מנת לתעד פוטנציאל שדה מעורר, השתמש בממריצים המחוברים לדיגיטייזר כדי לספק פעימת מתח מרובע קצרה (200 אותנו) דרך פיפטה גירוי מלא NaCl. כוונן את חוגת מתח הגירוי כדי לעורר מגוון משרעת תגובה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מוצגות להלן הקלטות מייצגות מפרוסות HEC שהוכנו כמתואר בפרוטוקול זה. לאחר התאוששות בתא מעצר ממשק (איור 1C), פרוסות מועברות בנפרד לתא הקלטה שקוע (איור 2B). תא ההקלטה מסופק עם ACSF רווי קרבוגן באמצעות משאבה פריסטלית(איור 2A). המשאבה שואבת תחילה ACSF מן הכף מחזיק לתוך מאגר מחומם. קווי קרבוגן ממוקמים הן לתוך ההחזקה והן למאגר המחומם כדי לספק חמצון מתמשך של התקשורת. עמעום פועם, המורכב מסדרה של מזרקים מלאים באוויר, ממוקם בין המשאבה peristalt...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ישנם מספר צעדים בפרוטוקול חיתוך זה שנועד לקדם את בריאות הרקמות ולהעדיף את הופעתה של פעילות רשת נטורליסטית ספונטנית: העכבר חדור באופן טרנסקרדיאלי עם פתרון חיתוך סוכרוז מצונן; פרוסות קליפת המוח האופקית-סנטוריניאלית (HEC) נחתכות בעובי של 450 מיקרומטר מההיפוקמפוס הבינוני או הגחוני; פרוסות להתאושש בממשק של ACSF מחומם ואוויר לח, פחמימן עשיר; במהלך הקלטות פרוסות הם superfused עם ACSF מחומם ל 32 °C (60 °F) ונמסר בקצב זרימה מהיר עם superfusion משטח כפול בתא הקלטה שקוע.

בריאות פרוסה היא בעלת חשיבות עליו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחבר אין מה לחשוף.

תודות

המחבר רוצה להודות לסטיב סיגלבאום על התמיכה. המימון ניתן על ידי 5R01NS106983-02, כמו גם 1 F31 NS13466-01.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדפסת תלת מימדLulzbotLulzBot TAZ 6
מחזיק דגירה של פרוסות מוח חריפותNIH חילופי הדפסת תלת מימד NIH3DPX-001623עוצב על ידי ChiaMing Lee, זמין בכתובת
https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 Adenosine 5′-triphosphate מלח מגנזיוםסיגמא אולדריץ'A9187-500MG
Ag-Cl כדורי קרקעWarner64-1309, (E205)
אגרבקטון, דיקינסון214530-500 גרם
חומצה אסקורביתאלפא אסאר36237
(250 מ"ל)קימקס14000-250
(400 מ"ל)בלנדר קימקס14000-400
ביוציטיןסיגמא אולדריץ'B4261
אוסטרBRLY07-B00-NP0
מספריים בון, בקטון קטן, Dickinson14184-09
נימי זכוכית בורוסיליקט עם נימה (OD 1.5 מ"מ, תעודת זהות 0.86 מ"מ, אורך 10 ס"מ)עדיפים Sutter InstrumentsBF150-86-10HPנימים מלוטשים באש.
תמיסת סידן כלוריד (1 M)G-BiosciencesR040
אולימפוסOLY-150
גז קרבוגן דחוס (95% חמצן / 5% פחמן דו חמצני)איירגזX02OX95C2003102
חמצן דחוסAirgasOX 200
ממריץ מבודד במתח קבועDigitimer Ltd.DS2A-Mk.II
כיסויים (22x50 מ"מ)VWR16004-314
דבק ציאנואקרילטKrazy GlueKG925השתמש באופן אידיאלי בטופס המברשת
לתוכנת רכישת נתוניםAxographN/Aכל תוכנה מקבילה (למשל pClamp) תעבוד.
מחשב שולחני של תחנת עבודה Dell Precision T1500 בתצורת Towerשל Dell N/Aתלוי במחשב הספציפי - כל מחשב יפעל כל עוד הוא יכול להפעיל תוכנה לרכישת אלקטרופיזיולוגיה.
Digidata 1440Aמכשירים מולקולריים1-2950-0367
טיימר דיגיטליVWR62344-6414 ערוצים טיימר הניתן למעקב
רפידות ספיגה חד פעמיותVWR56616-018
מספריים דיסקטורFine Science Tools14082-09
סכיני גילוח כפולים PersonnaBP9020
כפול אוטומטי בקר טמפרטורהWarner Instrument CorporationTC-344B
תא הקלטה מותאם למשטח כפול או זרימה למינריתN/AN/Aהחדר המוצג בפרוטוקול זה מיוצר בהתאמה אישית. מקבילה מסחרית תהיה ה-RC-27L של וורנר אינסטרומנטס.
מתלה ציודאוטומציה מדעיתFR-EQ70 "מתלה אינו הכרחי אך שימושי לארגון אלקטרופיזיולוגיה
אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתית'יאתר)- N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (EGTA)סיגמא אולדריץ'324626-25GM
נייר סינוןWhatman1004 070
בקנה מידה עדיןמטלר טולדוXS204DR
חולץ מיקרופיפטה בוער/חוםSutter InstrumentsP-97
צלחת פטרי זכוכית (100 x 15 מ"מ)קורנינג3160-101
גלוקוזפישר סיינטיפיקD16-1
גואנוזין 5&פריים;-טריפוספט נתרן מלח הידרטסיגמא אולדריץ'G8877-250MG
דליי קרחסיגמא אולדריץ'BAM168072002-1EA
וופורייזר isofluraneשירותי הרדמה כלליתTec 3
קלטת מעבדהFisher Scientific15-901-10R
FisherScientific11-996
מקור אורOlympusTH4-100
תמיסת מגנזיום כלוריד (1 מ')איכות ביולוגית351-033-721EA מגנטית
מוטות ערבובפישר סיינטיפיק14-513-56מספר הקטלוג יהיה תלוי בגודל מוט הערבוב.
מיקרומניפולטורלואיגס & NeumannSM-5
מיקרומניפולטור (ידני)ScientificaLBM-2000-00
מיקרוסקופאולימפוסBX51WI
מיקרומריתFine Science Tools10089-11
צגDell2007FPb
MultiClamp 700B מגבר מיקרואלקטרודההתקנים מולקולרייםMULTICLAMP 700Bה-MultiClamp 700B צריך לכלול במות ראש, מחזיקי פיפטות ותא דגם.
N-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-N′-(2-חומצה אתנסולפונית), (HEPES)מחט סיגמא אולדריץ'H3375-25G
(20 מד, אורך 1.5בקטון, דיקינסון305176
נימה ניילוןYLI Wonder Invisible Thread212-15-004גודל 0.004. החתול הזה. # הוא מרשת
ניילוןתאגיד וורנר אינסטרומנטס 64-0198
משאבה פרסטלטיתמכשיר הרווארד70-2027
פוספוקריאטין די (טריס) מלחסיגמא אולדריץ'P1937-1G
מחזיקי פיפטותמכשירים מולקולריים1-HL-U
דיוקעולמיPT0203
נימה של חומצה פולילקטית (PLA)UltimakerRAL 9010
אשלגן כלוריSigma AldrichP3911-500G
אשלגן גלוקונאטSigma Aldrich1550001-200MG
אשלגן הידרוקסידSigma Aldrich60377-1KG
סכיני גילוחVWR55411-050
מהדק רולרהעולם Precision Instruments14041
קנה מידהמטלר טולדוPM2000
ידית אזמלFine Science Tools10004-13
פרוסת נבלוורנרSHD-26GH/2
נתרן ביקרבונטפישר כימיקלS233-500
נתרן כלוריסיגמא אולדריץ'S9888-1KG
נתרן פוספט מונו-בסיסי נטול מיםפישר כימיS369-500
נתרן פירובטפישר כימיBP356-100
מריתVWR82027-520
מרית/כף, גדולVWR470149-442
להבי אזמל סטרילייםנוצה72044-10
בוחש / פלטה חמהקורנינג6795-220
שסתומי תא עצירה, חד כיווניWorld Precision Instruments14054
שסתומי עצירה, 3 כיווניםWorld Precision Instruments14036
סוכרוזAcros OrganicsAC177142500
תמיכה עבור מהדקים מסתובביםFisher Scientific14-679Q
מספריים כירורגיים, כלים מדעיים עדינים חדים / קהיםמזרק 14001-12
(1 מ"ל)בקטון, דיקינסון
(60 מ"ל עם קצה Luer-Lok)בקטון, דיקינסון 309653
מהדק תלת שינייםפישר סיינטיפיק05-769-8Q
מלקחיים לרקמות,כלי מדע עדינים11021-15
מלקחיים לרקמות,כלי מדע עדינים11023-10
פיפטות העברהפישר סיינטיפיק13-711-7M
צינורותTygonE-3603ID 1/16 אינץ', OD 3/16 אינץ'
צינורותTygonR-3603ID 1/8 אינץ', OD 1/4 אינץ'
גריז ואקוםDow Corning14-635-5D
רוטט להב מיקרוטוםLeicaVT 1200S
שולחן שיכוך רעידות עם כלוב פאראדיימיקרו-G / TMC-ametek2536-516-4-30PE
בקבוק נפחי (1 ליטר)KimaxKIM-28014-1000
(2 ליטר)PYREX65640-2000
אמבט מים חמיםVWR1209
 
מצלמת מדויקת המספר הקטלוגי נייר עדשה ) Amazon.com חוט פלטינה מזרק 309659 גדולים קטנים בקבוק נפח

מקורות

  1. Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
  2. Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
  3. Buzsáki, G., Horváth, Z., Urioste, R., Hetke, J., Wise, K. High-frequency network oscillation in the hippocampus. Science. 256, 1025-1027 (1992).
  4. Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents — EEG, ECoG, LFP and spikes. Nature Reviews Neuroscience. 13, 407-420 (2012).
  5. Buzsáki, G. Hippocampal sharp wave-ripple: A cognitive biomarker for episodic memory and planning. Hippocampus. 25, 1073(2015).
  6. Maier, N., et al. Reduction of high-frequency network oscillations (ripples) and pathological network discharges in hippocampal slices from connexin 36-deficient mice. Journal of Physiology. 541, 521-528 (2002).
  7. Maier, N., Nimmrich, V., Draguhn, A. Cellular and network mechanisms underlying spontaneous sharp wave-ripple complexes in mouse hippocampal slices. Journal of Physiology. 550, 873-887 (2003).
  8. ul Haq, R., et al. Adrenergic modulation of sharp wave-ripple activity in rat hippocampal slices. Hippocampus. 22, 516-533 (2012).
  9. ul Haq, R., et al. Serotonin dependent masking of hippocampal sharp wave ripples. Neuropharmacology. 101, 188-203 (2016).
  10. Maier, P., Kaiser, M. E., Grinevich, V., Draguhn, A., Both, M. Differential effects of oxytocin on mouse hippocampal oscillations in vitro. European Journal of Neuroscience. 44, 2885-2898 (2016).
  11. Mizunuma, M., et al. Unbalanced excitability underlies offline reactivation of behaviorally activated neurons. Nature Neuroscience. 17, 503-505 (2014).
  12. Hájos, N., et al. Spike timing of distinct types of GABAergic interneuron during hippocampal gamma oscillations in vitro. Journal of Neuroscience. 24, 9127-9137 (2004).
  13. Geschwill, P., et al. Synchronicity of excitatory inputs drives hippocampal networks to distinct oscillatory patterns. Hippocampus. , (2020).
  14. Rutecki, P. A., Grossmann, R. G., Armstrong, D., Irish-Loewen, S. Electrophysiological connections between the hippocampus and entorhinal cortex in patients with complex partial seizures. Journal of Neurosurgery. 70, 667-675 (1989).
  15. Lothman, E. W., Bertram, E. H., Stringer, J. L. Functional anatomy of hippocampal seizures. Progress in Neurobiology. 37, 1-82 (1991).
  16. Carter, D. S., Deshpande, L. S., Rafiq, A., Sombati, S., Delorenzo, R. J. Characterization of spontaneous recurrent epileptiform discharges in hippocampal - cortical slices prepared from chronic epileptic animals. Seizure: European Journal of Epilepsy. 20, 218-224 (2011).
  17. Karlócai, M. R., et al. Physiological sharp wave-ripples and interictal events in vitro: What's the difference. Brain. 137, 463-485 (2014).
  18. Leroy, F., et al. Input-timing-dependent plasticity in the hippocampal CA2 region and its potential role in social memory. Neuron. 95, 1089-1102 (2017).
  19. Sun, Q., et al. Proximodistal heterogeneity of hippocampal CA3 pyramidal neuron intrinsic properties, connectivity, and reactivation during memory recall. Neuron. 95, 656-672 (2017).
  20. Masurkar, A. V., et al. Medial and lateral entorhinal cortex differentially excite deep versus superficial CA1 pyramidal neurons. Cell Reports. 18, 1-13 (2017).
  21. Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous, low frequency (∼2-3 Hz) field activity generated in rat ventral hippocampal slices perfused with normal medium. Brain Research Bulletin. 57, 187-193 (2002).
  22. Papatheodoropoulos, C., Kostopoulos, G. Spontaneous GABAA-dependent synchronous periodic activity in adult rat ventral hippocampal slices. Neuroscience Letters. 319, 17-20 (2002).
  23. Kubota, D., Colgin, L. L., Casale, M., Brucher, F. A., Lynch, G. Endogenous waves in hippocampal slices. Journal of Neurophysiology. 89, 81-89 (2003).
  24. Behrens, C. J., Van Den Boom, L. P., De Hoz, L., Friedman, A., Heinemann, U. Induction of sharp wave - complexes in vitro and reorganization of hippocampal networks. Nature Neuroscience. 8, 1560-1567 (2005).
  25. Kouvaros, S., Papatheodoropoulos, C. Prominent differences in sharp waves, ripples and complex spike bursts between the dorsal and the ventral rat hippocampus. Neuroscience. 352, 131-143 (2017).
  26. Strange, B. A., Witter, M. P., Lein, E. S., Moser, E. I. Functional organization of the hippocampal longitudinal axis. Nature Reviews Neuroscience. 15, 655-669 (2014).
  27. Patel, J., Fujisawa, S., Berényi, A., Royer, S., Buzsáki, G. Traveling Theta Waves along the Entire Septotemporal Axis of the Hippocampus. Neuron. 75, 410-417 (2012).
  28. Patel, J., Schomburg, E. W., Berényi, A., Fujisawa, S., Buzsáki, G. Local generation and propagation of ripples along the septotemporal axis of the hippocampus. Journal of Neuroscience. 33, 17029-17041 (2013).
  29. Fricke, R., Cowan, W. M. An autoradiographic study of the commissural and ipsilateral hippocampo-dentate projections in the adult rat. Journal of Comparative Neurology. 181, 253-269 (1978).
  30. Ishizuka, N. O. R., Weber, J., Amaral, D. G. Organization of intrahippocampal projections originating from CA3 pyramidal cells in the rat. The Journal of Comparative Neurology. 623, 580-623 (1990).
  31. Papatheodoropoulos, C. Electrophysiological evidence for long-axis intrinsic diversification of the hippocampus. Frontiers in Bioscience - Landmark. 23, 109-145 (2018).
  32. Gilbert, M., Racine, R. J., Smith, G. K. Epileptiform burst responses in ventral vs dorsal hippocampal slices. Brain Research. 361, 389-391 (1985).
  33. Papatheodoropoulos, C., Moschovos, C., Kostopoulos, G. Greater contribution of N-methyl-D-aspartic acid receptors in ventral compared to dorsal hippocampal slices in the expression and long-term maintenance of epileptiform activity. Neuroscience. 135, 765-779 (2005).
  34. Jones, R. S. G., Heinemann, U. Synaptic and intrinsic responses of medial entorhinal cortical cells in normal and magnesium-free medium in vitro. Journal of Neurophysiology. 59, (1988).
  35. Rafiq, A., Delorenzo, R. J., Coulter, D. A. Generation and propagation of epileptiform discharges in a combined entorhinal cortex / hippocampal slice. Journal of Neurophysiology. 70, 1962-1974 (1993).
  36. Stoop, R., Pralong, E. Functional connections and epileptic spread between hippocampus, entorhinal cortex and amygdala in a modified horizontal slice preparation of the rat brain. European Journal of Neuroscience. 12, 3651-3663 (2000).
  37. Roth, F. C., Beyer, K. M., Both, M., Draguhn, A., Egorov, A. V. Downstream effects of hippocampal sharp wave ripple oscillations on medial entorhinal cortex layer V neurons in vitro. Hippocampus. 26, 1493-1508 (2016).
  38. Bertsche, A., Bruehl, C., Pietz, J., Draguhn, A. Region- and pattern-specific effects of glutamate uptake blockers on epileptiform activity in rat brain slices. Epilepsy Research. 88, 118-126 (2010).
  39. Wu, C., Shen, H., Luk, W. P., Zhang, L. A fundamental oscillatory state of isolated rodent hippocampus. Journal of Physiology. 540, 509-527 (2002).
  40. Colgin, L. L., Jia, Y., Sabatier, J. M., Lynch, G. Blockade of NMDA receptors enhances spontaneous sharp waves in rat hippocampal slices. Neuroscience Letters. 385, 46-51 (2005).
  41. Ellender, T. J., Nissen, W., Colgin, L. L., Mann, E. O., Paulsen, O. Priming of hippocampal population bursts by individual perisomatic-targeting interneurons. The Journal of Neuroscience. 30, 5979-5991 (2010).
  42. Xiong, G., Metheny, H., Johnson, B. N., Cohen, A. S. A. Comparison of different slicing planes in preservation of major hippocampal pathway fibers in the mouse. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 1-17 (2017).
  43. Maier, N., Morris, G., Johenning, F. W., Schmitz, D. An approach for reliably investigating hippocampal sharp wave-ripples in vitro. PLoS One. 4, 6925(2009).
  44. Schlingloff, D., Kali, S., Freund, T. F., Hajos, N., Gulyas, A. I. Mechanisms of sharp wave initiation and ripple generation. Journal of Neuroscience. 34, 11385-11398 (2014).
  45. McCloskey, D. P., Scharfman, H. E. Progressive, potassium-sensitive epileptiform activity in hippocampal area CA3 of pilocarpine-treated rats with recurrent seizures. Epilepsy Research. 97, 92-102 (2011).
  46. McMahon, L. L., Williams, J. H., Kauer, J. A. Functionally distinct groups of interneurons identified during rhythmic carbachol oscillations in hippocampus in vitro. Journal of Neuroscience. 18, 5640-5651 (1998).
  47. Pöschel, B., Heinemann, U., Draguhn, A. High frequency oscillations in the dentate gyrus of rat hippocampal slices induced by tetanic stimulation. Brain Research. 959, 320-327 (2003).
  48. Hájos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29, 319-327 (2009).
  49. Hájos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183, 107-113 (2009).
  50. Dengler, C. G., Yue, C., Takano, H., Coulter, D. A. Massively augmented hippocampal dentate granule cell activation accompanies epilepsy development. Nature Publishing Group. , 1-17 (2017).
  51. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N -methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. 132, 1-13 (2018).
  52. Westerhof, N., Lankhaar, J. W., Westerhof, B. E. The arterial windkessel. Medical and Biological Engineering and Computing. 47, 131-141 (2009).
  53. Shi, W. X., Bunney, B. S. A small volume chamber for electrical recording from submerged brain slices and a pulse-free medium supply system using a peristalic pump. Journal of Neuroscience Methods. 35, 235-240 (1990).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ריפלים של גלי-חדים ספונטנייםפרפוזיה טרנס-קרדיאליתפרוסות מוח אופקיותתא התאוששות בממשקהקלטות בתא טבולסופרפוזיה כפולה של פני השטחהקלטת פוטנציאל שדה מקומיACSF עם בועיות קרבוגן
חריף המוח עכבר חותכת לחקור פעילות רשת היפוקמפוס ספונטנית
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.