מאמר שיטה

בחירה בסיוע של סמנים ביולוגיים לפי גודל אפקט ניתוח מפלה ליניארי (LEfSe) בנתוני מיקרוביום

DOI:

10.3791/61715

⸱

16 במאי 2022

 ,  , 
1Marine Resources Research Centre, Tianjin Research Institute for Water Transport Engineering, M.O.T., 2Key Laboratory of Regional Energy Systems Optimization, Ministry of Education, College of Environmental Science and Engineering, North China Electric Power University, 3School of Environmental Science and Engineering, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

במאמר זה

Retraction Notice

The article <em>בחירה בסיוע של סמנים ביולוגיים לפי גודל אפקט ניתוח מפלה ליניארי (LEfSe) בנתוני מיקרוביום</em> (10.3791/61715) has been retracted by the journal upon the authors' request due to a conflict regarding the data and methodology.

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LEfSe (גודל אפקט LDA) הוא כלי לכריית סמנים ביולוגיים בממדים גבוהים לזיהוי תכונות גנומיות (כגון גנים, מסלולים וטקסונומיות) המאפיינות באופן משמעותי שתי קבוצות או יותר בנתוני מיקרוביום.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יש תשומת לב הולכת וגוברת לגנומים ביולוגיים סגורים בסביבה ובבריאות. כדי לחקור ולחשוף את ההבדלים הבין-קבוצתיים בין דגימות או סביבות שונות, חשוב לגלות סמנים ביולוגיים עם הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות. היישום של ניתוח מפלה ליניארי גודל אפקט (LEfSe) יכול לעזור למצוא סמנים ביולוגיים טובים. בהתבסס על נתוני הגנום המקוריים, מתבצעים בקרת איכות וכימות של רצפים שונים המבוססים על מסה או גנים. ראשית, מבחן הדירוג Kruskal-Wallis שימש כדי להבחין בין הבדלים ספציפיים בין קבוצות סטטיסטיות וביולוגיות. לאחר מכן, מבחן הדירוג של וילקוקסון בוצע בין שתי הקבוצות שהושגו בשלב הקודם כדי להעריך אם ההבדלים היו עקביים. לבסוף, ניתוח מפלה ליניארי (LDA) נערך כדי להעריך את ההשפעה של סמנים ביולוגיים על קבוצות שונות באופן משמעותי בהתבסס על ציוני LDA. לסיכום, LEfSe סיפק את הנוחות לזיהוי סמנים ביולוגיים גנומיים המאפיינים הבדלים סטטיסטיים בין קבוצות ביולוגיות.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סמנים ביולוגיים הם מאפיינים ביולוגיים שניתן למדוד ויכולים להצביע על כמה תופעות כגון זיהום, מחלה או סביבה. ביניהם, סמנים ביולוגיים פונקציונליים עשויים להיות פונקציות ביולוגיות ספציפיות של מינים בודדים או משותף למינים מסוימים, כגון גן, חלבון, מטבוליט ומסלולים. חוץ מזה, סמנים ביולוגיים טקסונומיים מצביעים על מין יוצא דופן, קבוצה של אורגניזמים (ממלכה, פילום, מעמד, סדר, משפחה, סוג, מינים), משתנה רצף האמפליקונים (ASV)1, או היחידה הטקסונומית המבצעית (OTU)2. על מנת למצוא סמנים ביולוגיים במהירות ובדייקנות רבה יותר, יש צורך בכלי לניתוח הנתונים הביולוגיים. ההבדלים בין שיעורים יכולים להיות מוסברים על ידי LEfSe בשילוב עם בדיקות סטנדרטיות למשמעות סטטיסטית ובדיקות נוספות המקודדות עקביות ביולוגית ורלוונטיות השפעה3. LEfSe זמין כמודול גלקסיה, נוסחת קונדה, תמונת docker, ונכלל בביובקרי (VM וענן)4. בדרך כלל, ניתוח המגוון המיקרוביאלי משתמש לעתים קרובות בבדיקה לא פרמטרית להפצה לא בטוחה של קהילת מדגם. בדיקת סכום הדירוג היא שיטת בדיקה לא פרמטרית, המשתמשת בדירוג הדגימות כדי להחליף את ערך הדגימות. על פי ההבדל של קבוצות מדגם, זה יכול להיות מחולק לשתי דגימות עם מבחן סכום הדירוג וילקוקסון לתוך דגימות מרובות עם מבחן Kruskal-Wallis 5,6. ראוי לציין, כאשר ישנם הבדלים משמעותיים בין קבוצות מרובות של דגימות, יש לבצע בדיקת סכום דרגה של השוואה זוגית של דגימות מרובות. LDA (אשר מייצג ניתוח מפלה ליניארי) שהומצא על ידי רונלד פישר בשנת 1936, הוא סוג של למידה מפוקחת, הידוע גם בשם מפלה ליניארי של פישר7. זהו אלגוריתם קלאסי ופופולרי בתחום הנוכחי של כריית נתונים למידת מכונה.

כאן, בדיקת LEfSe עברה אופטימיזציה על ידי שרתי קונדה וגלקסי. שלוש קבוצות של רצפי גנים rRNA 16S מנותחות כדי להדגים את ההבדלים המשמעותיים בין קבוצות שונות עם עשרות LDA של קהילות מיקרוביות ותוצאות הדמיה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הפרוטוקול היה מקור ושונה מהמחקר של Segata et al.3. השיטה מסופקת https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse.

1. הכנת קובץ קלט לניתוח

  1. הכן את קובץ הקלט (טבלה 1) של LEfSe, אשר יכול להיווצר בקלות על ידי זרימות עבודה רבות8 או פרוטוקולים קודמים9 עם הקבצים המקוריים (קובץ מדגם וקובץ ביאור מינים מתאים).

2. ניתוח מקורי של LEfSe (מוגבל לשרת לינוקס)

  1. התקנת LEfSe
    הערה: מומלץ להתקין את צינור LEfSe עם Conda10.
    1. הפעל את הפקודות הבאות כדי לא לכלול את האפשרות של התנגשות יחסי תלות. צור סביבת קונדה עבור LEfSe (שלב זה מומלץ אך אינו נדרש).). -n מייצג את שם הסביבה.
      $ conda create -n LEfSe-env
    2. כדי להפעיל את סביבת LEfSe שנוצרה, הפעל את:
      $ source activate LEfSe-env
    3. כדי להתקין את LEfSe עם bioBakery ערוץ שבו -c מייצג את שם הערוץ, הפעל:
      $ conda install -c biobakery lefse
  2. עיצוב נתונים עבור LEfSe
    1. הפעל את הפקודה הבאה כדי לעצב את הקובץ המקורי לתבנית הפנימית עבור LEfSe. טבלה.txt קובץ הקלט Table-reformat.in הוא קובץ הפלט. -c משמש להגדרת התכונה, המשמשת כמחלקה (ברירת מחדל 1) ו- -o משמש להגדרת ערך הנורמליזציה (ברירת המחדל -1.0 כלומר ללא נורמליזציה).
      $ שולחן format_input.py.txt Table-reformat.in -c 1 -o 10000000
  3. חישוב גודל אפקט ניתוח מפלה ליניארי (LDA)
    1. הפעל את הפקודה הבאה. מטרת שלב זה היא לבצע LDA של התוצאה הקודמת וליצור את קובץ התוצאה עבור visualization. Table-reformat.in נוצרת באמצעות השלב הקודם ומשמשת כקובץ הקלט בשלב זה. Table-reformat.res הוא קובץ התוצאה.
      $ run_lefse.py Table-reformat.in Table-reformat.res
  4. פריט חזותי לפי התוויות
    1. התווה את תוצאות LEfSe. כדי להתוות את גודל האפקט של סמנים ביולוגיים בקובץ PDF,. Table-reformat.res נוצר באמצעות השלב הקודם ו- LDA.pdf הוא קובץ ההתוויה. –format משמש להגדרת תבנית קובץ הפלט.
      $ plot_res.py Table-reformat.res LDA.pdf --format pdf
    2. תכנן את הקלדוגרמה. לצייר את עץ המינים ולהציג את סמנים ביולוגיים בקלדוגרמה. קלדוגרמה.pdf הוא קובץ הפלט.
      $ plot_cladogram.py Table-reformat.res cladogram.pdf --format pdf
    3. התוויית תכונה אחת (אופציונלי) כדי להתוות את ההבדלים של סמן ביולוגי יחיד בין קבוצות שונות. -f משמש להגדרת תכונות העלילה. אם הוגדר אחד מהם, יש לתת את ה- -feature_name.
      $ plot_features.py -f אחד --feature_name "k__Bacteria.p__Firmicutes.c__Bacilli.o__Bacillales" --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res Bacillales.pdf
    4. התווה את התכונות הדיפרנציאליות (אופציונלי) כדי לצייר את כל התכונות, אך יש יותר מדי מה לעשות בזהירות. --הארכיון משמש כדי לבחור אם לדחוס את התוצאות. ./ פירושו נתיב התוצאות.
      $ plot_features.py -f diff --archive none --format pdf Table-reformat.in Table-reformat.res ./

3. ניתוח מקוון של LEfSe (גלקסיה)

  1. עבור אל שרת הגלקסיה huttenhower11: http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy.
  2. העלה את הקבצים. לחץ על לחצן החץ למעלה בחלונית הימנית והעלה את הקובץ. לחץ על בחר קובץ מקומי כדי לבחור את קובץ הקלט ולבחור את הטבלאי של העיצוב ולאחר מכן לחץ על לחצן התחל .
    הערה: בהתייחסו לדף האינטרנט (https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse), השתמש בקובץ ה- Script (taxonomy_summary. R) כדי ליצור את קובץ הקלט של LEfSe, והתבנית (כל עמודה עם שם קבוצה, כל שורה עם רמת ביאור שונה המופרדת על-ידי "|") נדרשת כפי שמוצג בטבלה 1. מבט כולל סכמטי על תהליך ההעלאה מוצג באיור 1.
  3. עצב את הנתונים עבור LEfSe. לחץ על | LEfSe עצב נתונים עבור LEfSe בקישור בחלונית הימנית ובחר את השורות הספציפיות למחלקה בקובץ ולחץ על לחצן הפעל . מבט כולל סכמטי על התהליך התפעולי ועל הפרמטרים שבהם נעשה שימוש מוצג באיור 2.
  4. חשב את גודל אפקט ה- LDA. לחץ על | LEfSe הקישור גודל אפקט LDA (LEfSe) בחלונית הימנית ובחר ערכי פרמטרים בהתאם לדרישות הניתוח. לחץ על בצע. מבט כולל סכמטי על התהליך התפעולי ועל הפרמטרים שבהם נעשה שימוש מוצג באיור 3.
  5. התווה את תוצאות LEfSe. לחץ על | LEfSe התווה את הקישור תוצאות LEfSe בחלונית הימנית ולחץ על לחצן הפעל . מבט כולל סכמטי על התהליך התפעולי ועל הפרמטרים שבהם נעשה שימוש מוצג באיור 4.
  6. תכנן את הקלדוגרמה. לחץ על קלאודוגרמה של התווה בחלונית הימנית ולחץ על לחצן בצע לאחר בחירת ערכי הפרמטרים. מבט כולל סכמטי על התהליך התפעולי ועל הפרמטרים שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 5.
  7. התווה תכונה אחת על-ידי לחיצה על התכונה 'התווה תכונה אחת' בחלונית הימנית ולחיצה על לחצן בצע לאחר בחירת ערכי פרמטרים. מבט כולל סכמטי על התהליך התפעולי והפרמטרים שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 6.
  8. התווה תכונות דיפרנציאליות על-ידי לחיצה על התוויית תכונות דיפרנציאליות בחלונית הימנית והיצמדות ללחצן בצע לאחר בחירת ערכי פרמטרים. מבט כולל סכמטי על התהליך התפעולי והפרמטרים שבהם נעשה שימוש מוצגים באיור 7.
    הערה: ניתן להציג באופן חזותי איורים שנוצרו ולהוריד אותם מול הפלט שנוצר בחלונית השמאלית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LDA עשרות קהילות מיקרוביות עם הבדלים משמעותיים בכל קבוצה על ידי ניתוח רצפי הגנים rRNA 16S של שלוש דגימות מוצג באיור 8. צבע ההיסטוגרמה מייצג קבוצות שונות, בעוד האורך מייצג את ציון LDA, שהוא ההשפעה של המין עם הבדלים משמעותיים בין קבוצות שונות. ההיסטוגרמה מציגה את המינים עם הבדלים משמעותיים שציון ה- LDA שלהם גדול מהערך המוגדר מראש. הערך המוגדר המוגדר מראש המוגדר כברירת מחדל הוא 2.0, כך שרק ערכים מוחלטים של ניקוד LDA (abscissa) הגדולים מ- 2.0 מוצגים בתרשים.

סמנים ביול...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מתואר הפרוטוקול לזיהוי ואפיון של סמנים ביולוגיים בקבוצות שונות. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות עבור סוגי מדגם אחרים, כגון OTUs של מיקרואורגניזמים. השיטה הסטטיסטית של LEfSe יכולה למצוא את המיקרואורגניזמים האופייניים בכל קבוצה (ברירת המחדל היא LDA >2), כלומר, המיקרואורגניזמים הנפוצים יותר בקבוצה זו ביחס לאחרים12. LEfSe זמין הן בגרסאות לינוקס מקוריות והן בגרסאות לינוקס באינטרנט שבהן משתמשים יכולים גם לבצע ניתוח LEfSe בדפי אינטרנט. LEfSe מבוסס על אלגוריתם LDA וזקוק לרמת מין כדי לצייר עץ מין. ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מקרנות מחקר בסיסיות עבור מכוני המחקר המרכזיים לרווחת הציבור (TKS17020205) והקרן לפיתוח המדע והטכנולוגיה, ומכון המחקר טיאנג'ין להנדסת תחבורה מים (TIWTE), M.O.T. (KJFZJJ17020201).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
לא נעשה שימוש בחומרים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bolyen, E., et al. Reproducible, interactive, scalable and extensible microbiome data science using QIIME 2. Nature Biotechnology. 37 (8), 852-857 (2019).
  2. Knight, R., et al. Best practices for analysing microbiomes. Nature Reviews. Microbiology. 16 (7), 410-422 (2018).
  3. Segata, N., et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation. Genome Biology. 12 (6), 60(2011).
  4. McIver, M., Sayoldin, B., Shafquat, A. Biobakery / lefse [tool]. , Available from: https://bitbucket.org/biobakery/biobakery/wiki/lefse (2019).
  5. Kruskal, W. H. A nonparametric test for the several sample problem. The Annals of Mathematical Statistics. 23 (4), 525-540 (1952).
  6. Wilcoxon, F. Individual comparisons by ranking methods. Biometrics Bulletin. 1 (6), 80-83 (1945).
  7. Fisher, R. A. The use of multiple measurements in taxonomic problems. Annals of Eugenics. 7 (1), 179-188 (1936).
  8. Liu, Y. X., et al. A practical guide to amplicon and metagenomic analysis of microbiome data. Protein and Cell. 41 (7), 1-16 (2020).
  9. Shahi, S. K., Zarei, K., Guseva, N. V., Mangalam, A. K. Microbiota analysis using two-step PCR and next-generation 16S rRNA gene sequencing. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e59980(2019).
  10. Grüning, B., et al. Bioconda: sustainable and comprehensive software distribution for the life sciences. Nature Methods. 15 (7), 475-476 (2018).
  11. Blankenberg, D., Chilton, J., Coraor, N. Galaxy external display applications: closing a dataflow interoperability loop. Nature Methods. 17 (2), 123-124 (2020).
  12. Langille, M. G. I., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
  13. Shilei, Z., et al. Reservoir water stratification and mixing affects microbial community structure and functional community composition in a stratified drinking reservoir. Journal of Environmental Management. 267, 110456(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Linear Discriminant AnalysisBiomarker SelectionMicrobiome DataKruskal Wallis TestWilcoxon Rank TestLDA Effect SizeLEfSe AnalysisGalaxy ServerPrincipal Component AnalysisGenomic Biomarkers