Method Article

הזרקה תוך-ואטראלית וכמות של פרמטרי זיהום במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי

DOI:

10.3791/61749

⸱

February 6th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטה של הזרקה תוך-ואטראלית וכמות חיידקית עוקבת במודל העכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי. ניתן להאריך פרוטוקול זה למדידת תגובות חיסוניות מארחות וביטוי גנים חיידקי ומארח.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים חיידקיים תוך עיניים מהווים סכנה לחזון. חוקרים משתמשים במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את הגורמים המארחים והחיידקיים ואת מסלולי התגובה החיסונית הקשורים לזיהום כדי לזהות מטרות טיפוליות קיימא ולבדוק תרופות למניעת עיוורון. טכניקת ההזרקה התוך-ויטריאלית משמשת להזרקת אורגניזמים, סמים או חומרים אחרים ישירות לחלל הירך בחלק האחורי של העין. כאן, הדגמנו טכניקת הזרקה זו כדי ליזום זיהום בעין העכבר ואת הטכניקה של כימות חיידקים תוך עיניים. Bacillus cereus גדל במדיה נוזלית עירוי לב המוח במשך 18 שעות ו resuspended לריכוז 100 מושבה להרכיב יחידות (CFU)/0.5 μL. עכבר C57BL/6J היה הרדמה באמצעות שילוב של קטמין וקסילאזין. באמצעות מיקרו-מיינר פיקוליטר ומחטי נימי זכוכית, הוזרק 0.5 מיקרו-ל' של ההשעיה של בצילוס אל תוך זיבת האמצע של עין העכבר. עין הבקרה ההפוך הוזרקה עם מדיה סטרילית (שליטה כירורגית) או לא הוזרקה (שליטה מוחלטת). ב 10 שעות לאחר זיהום, עכברים היו המתת דם, ועיניים נקצרו באמצעות פינצטה כירורגית סטרילית והוכנסו לצינור המכיל PBS סטרילי μL 400 ו 1 מ"מ חטוזי זכוכית סטרילית. עבור ELISAs או מיאלופרוקסידאז, מעכב פרוטאינאז נוסף לצינורות. עבור חילוץ RNA, מאגר התיזה המתאים נוסף. העיניים היו הומוגניות ב homogenizer רקמות במשך 1-2 דקות. הומוג'נים דוללים באופן סדרתי פי 10 ב-PBS ומעקב מדולל על צלחות אגר. שאר ההומוגנים אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס לצורך בדיקות נוספות. צלחות היו דגירה במשך 24 שעות CFU לכל עין היה לכמת. טכניקות אלה לגרום זיהומים לשחזור בעיני העכבר להקל על כימות של חיידקים קיימא, התגובה החיסונית המארחת, ו omics של ביטוי גנים מארח חיידקי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנדופתלמיטיס בקטריאלי הוא זיהום הרסני שגורם לדלקת, ואם לא מטופלים כראוי, יכול לגרום לאובדן ראייה או עיוורון. אנדופתלמיטיס נובעת כניסת חיידקים לתוך הפנים שלהעין 1,2,3,4,5. פעם אחת בעין, חיידקים לשכפל, לייצר רעלים וגורמים מזיקים אחרים, והוא יכול לגרום נזק בלתי הפיך לתאי רשתית עדינים ורקמות. נזק עיני יכול להיגרם גם על ידי דלקת, עקב הפעלת מסלולים דלקתיים המוביל זרם תאים דלקתיים לתוךהפנים של העין 1,5,6. אנדופתלמיטיס יכו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בוצעו בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ובהצהרה של האגודה לחקר הראייה והרופא לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון. הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (מספרי פרוטוקול 15-103, 18-043 ו-18-087).

1. מחטי זכוכית סטריליות

  1. הפעל את מושך פיפטה מחט.
  2. כוונן את ידית התנור עד שהצג יציג 12.6.
  3. פתחו את הדלת והאכילו ידנית את צינור נימי 5 μL דרך המהדק העליון ואת נימי התנור עד שחצי הצינורית משתרעת מתחת לתנור (איור 1A).
  4. ודא כי צינור נימי הוא חריץ "V" במהד....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יצירת inoculum לשחזור ודיוק של הליך הזרקת תוך ויטראלי הם צעדים מרכזיים בפיתוח מודלים של אנדופתלמיטיס מיקרוביאלית. כאן, הדגמנו את הליך ההזרקה תוך-ויטרית באמצעות גרם חיובי Bacillus cereus. הזרקנו 100 CFU/0.5 μL של B. cereus לאמצע זקיף של חמישה עכברי C57BL6. לאחר 10 שעות לאחר ההידלקות, ראינו צמיחה תוך עינית של B. cereus כ 1.8 x 105 CFU / עין. איור 1 מדגים את בניית מחטי הזכוכית כדי להעביר את החיידקים לאמצע עיני העכבר. בצילוס צריוס גדל על צלחת אגר דם.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפילו עם הזמינות של אנטיביוטיקה חזקה, תרופות אנטי דלקתיות, ניתוח vitrectomy, אנדופתלמיטיס חיידקי יכול לעוור את המטופל. מחקרים קליניים היו שימושיים בחקר אנדופתלמיטיס; עם זאת, מודלים ניסיוניים של אנדופתלמיטיס מספקים תוצאות מהירות לשחזור שניתן לתרגם להתקדמות ברמת הטיפול, וכתוצאה מכך תוצאה חזותית טובה יותר עבור חולים.

נפח ההיסטריה של עין העכבר הוא כ 7 μL40. נפח קטן זה מאפשר רק כמות מוגבלת של חומר להיות מוזרק. אין להזריק אמצעי אחסון הגדולים מ- 1.0 μL כדי למנוע נזק עיני. התהל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים כספיים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים לד"ר פנג לי ומארק דיטמר (ליבת הדמיה חיה של בעלי חיים OUHSC P30, מכון דין א. מקגי לעיניים, אוקלהומה סיטי, אישור, ארה"ב) על עזרתם. המחקר שלנו נתמך על ידי מענקי מכוני הבריאות הלאומיים R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 ו- R01EY024140. המחקר שלנו נתמך גם על ידי P30EY21725 (מענק NIH CORE להדמיה וניתוח בעלי חיים חיים, ביולוגיה מולקולרית והדמיה תאית). המחקר שלנו נתמך גם על ידי תוכנית המתלמדים הקדם-דוקטורט NEI Vision Science 5T32EY023202, מענק תמיכה במחקר של קרן הבריאות פרסביטריאנית, ומענק בלתי מוגבל למכון דין א. מקגי עין ממחקר למניעת עיוורון.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-20 ומיקרו; L pipetteRANINL0696003GNA
37oC IncubatorFisher Scientific11-690-625DNA
Bacto Brain Heart InfusionBD90003-032NA
Cell MicroinjectorMicroData Instrument, Inc.PM2000NA
מלקחיים קצה עדיןתרמו פישר מדעי12-000-122NA
חרוזי זכוכית 1.0 מ"מBioSpec11079110NA
חממה שייקרניו ברונסוויק סיינטיפיק סיינטיפיקNB-I2400NA
מיקרו-נימי 5 מיקרוליטרקימבל71900-5NA
מיקרו-פיפטה BevelerSutter Instrument Co.BV-10
NA מיקרוסקופ Axiostar PlusZeissNA
מיקרוסקופ OPMI LumeraZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecדגם 607NA
פיפטה רב ערוצית 30-300 ומיקרו; LBiohit15626090
NA פיפטה רב ערוצית 5-100 ומיקרו; LBiohit9143724NA
חולץ מחט/פיפטהKopf730NA
PBSGIBCOבדרגה מולקולרית
קוקטיילרוש4693159001בדרגה מולקולרית
KatenaK5-8228NA
1897315 מעכב פרוטאז מלקחיים לפעולה הפוכה

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intravitreal InjectionBacterial EndophthalmitisMouse ModelCFU QuantitationTissue HomogenizationSerial DilutionAgar Plate IncubationColony Forming UnitsProtease InhibitorGlass Capillary Needle

Related Articles