אנו מתארים כאן שיטה של הזרקה תוך-ואטראלית וכמות חיידקית עוקבת במודל העכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי. ניתן להאריך פרוטוקול זה למדידת תגובות חיסוניות מארחות וביטוי גנים חיידקי ומארח.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הזרקה תוך-ואטראלית וכמות של פרמטרי זיהום במודל עכבר של אנדופתלמיטיס חיידקי
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
זיהומים חיידקיים תוך עיניים מהווים סכנה לחזון. חוקרים משתמשים במודלים של בעלי חיים כדי לחקור את הגורמים המארחים והחיידקיים ואת מסלולי התגובה החיסונית הקשורים לזיהום כדי לזהות מטרות טיפוליות קיימא ולבדוק תרופות למניעת עיוורון. טכניקת ההזרקה התוך-ויטריאלית משמשת להזרקת אורגניזמים, סמים או חומרים אחרים ישירות לחלל הירך בחלק האחורי של העין. כאן, הדגמנו טכניקת הזרקה זו כדי ליזום זיהום בעין העכבר ואת הטכניקה של כימות חיידקים תוך עיניים. Bacillus cereus גדל במדיה נוזלית עירוי לב המוח במשך 18 שעות ו resuspended לריכוז 100 מושבה להרכיב יחידות (CFU)/0.5 μL. עכבר C57BL/6J היה הרדמה באמצעות שילוב של קטמין וקסילאזין. באמצעות מיקרו-מיינר פיקוליטר ומחטי נימי זכוכית, הוזרק 0.5 מיקרו-ל' של ההשעיה של בצילוס אל תוך זיבת האמצע של עין העכבר. עין הבקרה ההפוך הוזרקה עם מדיה סטרילית (שליטה כירורגית) או לא הוזרקה (שליטה מוחלטת). ב 10 שעות לאחר זיהום, עכברים היו המתת דם, ועיניים נקצרו באמצעות פינצטה כירורגית סטרילית והוכנסו לצינור המכיל PBS סטרילי μL 400 ו 1 מ"מ חטוזי זכוכית סטרילית. עבור ELISAs או מיאלופרוקסידאז, מעכב פרוטאינאז נוסף לצינורות. עבור חילוץ RNA, מאגר התיזה המתאים נוסף. העיניים היו הומוגניות ב homogenizer רקמות במשך 1-2 דקות. הומוג'נים דוללים באופן סדרתי פי 10 ב-PBS ומעקב מדולל על צלחות אגר. שאר ההומוגנים אוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס לצורך בדיקות נוספות. צלחות היו דגירה במשך 24 שעות CFU לכל עין היה לכמת. טכניקות אלה לגרום זיהומים לשחזור בעיני העכבר להקל על כימות של חיידקים קיימא, התגובה החיסונית המארחת, ו omics של ביטוי גנים מארח חיידקי.
מבוא
אנדופתלמיטיס בקטריאלי הוא זיהום הרסני שגורם לדלקת, ואם לא מטופלים כראוי, יכול לגרום לאובדן ראייה או עיוורון. אנדופתלמיטיס נובעת כניסת חיידקים לתוך הפנים שלהעין 1,2,3,4,5. פעם אחת בעין, חיידקים לשכפל, לייצר רעלים וגורמים מזיקים אחרים, והוא יכול לגרום נזק בלתי הפיך לתאי רשתית עדינים ורקמות. נזק עיני יכול להיגרם גם על ידי דלקת, עקב הפעלת מסלולים דלקתיים המוביל זרם תאים דלקתיים לתוךהפנים של העין 1,5,6. אנדופתלמיטיס יכו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בוצעו בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים במעבדה ובהצהרה של האגודה לחקר הראייה והרופא לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וחזון. הפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה (מספרי פרוטוקול 15-103, 18-043 ו-18-087).
1. מחטי זכוכית סטריליות
- הפעל את מושך פיפטה מחט.
- כוונן את ידית התנור עד שהצג יציג 12.6.
- פתחו את הדלת והאכילו ידנית את צינור נימי 5 μL דרך המהדק העליון ואת נימי התנור עד שחצי הצינורית משתרעת מתחת לתנור (איור 1A).
- ודא כי צינור נימי הוא חריץ "V" במהד....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
יצירת inoculum לשחזור ודיוק של הליך הזרקת תוך ויטראלי הם צעדים מרכזיים בפיתוח מודלים של אנדופתלמיטיס מיקרוביאלית. כאן, הדגמנו את הליך ההזרקה תוך-ויטרית באמצעות גרם חיובי Bacillus cereus. הזרקנו 100 CFU/0.5 μL של B. cereus לאמצע זקיף של חמישה עכברי C57BL6. לאחר 10 שעות לאחר ההידלקות, ראינו צמיחה תוך עינית של B. cereus כ 1.8 x 105 CFU / עין. איור 1 מדגים את בניית מחטי הזכוכית כדי להעביר את החיידקים לאמצע עיני העכבר. בצילוס צריוס גדל על צלחת אגר דם.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אפילו עם הזמינות של אנטיביוטיקה חזקה, תרופות אנטי דלקתיות, ניתוח vitrectomy, אנדופתלמיטיס חיידקי יכול לעוור את המטופל. מחקרים קליניים היו שימושיים בחקר אנדופתלמיטיס; עם זאת, מודלים ניסיוניים של אנדופתלמיטיס מספקים תוצאות מהירות לשחזור שניתן לתרגם להתקדמות ברמת הטיפול, וכתוצאה מכך תוצאה חזותית טובה יותר עבור חולים.
נפח ההיסטריה של עין העכבר הוא כ 7 μL40. נפח קטן זה מאפשר רק כמות מוגבלת של חומר להיות מוזרק. אין להזריק אמצעי אחסון הגדולים מ- 1.0 μL כדי למנוע נזק עיני. התהל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין קונפליקטים כספיים לחשוף.
תודות
המחברים מודים לד"ר פנג לי ומארק דיטמר (ליבת הדמיה חיה של בעלי חיים OUHSC P30, מכון דין א. מקגי לעיניים, אוקלהומה סיטי, אישור, ארה"ב) על עזרתם. המחקר שלנו נתמך על ידי מענקי מכוני הבריאות הלאומיים R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 ו- R01EY024140. המחקר שלנו נתמך גם על ידי P30EY21725 (מענק NIH CORE להדמיה וניתוח בעלי חיים חיים, ביולוגיה מולקולרית והדמיה תאית). המחקר שלנו נתמך גם על ידי תוכנית המתלמדים הקדם-דוקטורט NEI Vision Science 5T32EY023202, מענק תמיכה במחקר של קרן הבריאות פרסביטריאנית, ומענק בלתי מוגבל למכון דין א. מקגי עין ממחקר למניעת עיוורון.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2-20 ומיקרו; L pipette | RANIN | L0696003G | NA |
| 37oC Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | NA |
| Bacto Brain Heart Infusion | BD | 90003-032 | NA |
| Cell Microinjector | MicroData Instrument, Inc. | PM2000 | NA |
| מלקחיים קצה עדין | תרמו פישר מדעי | 12-000-122 | NA |
| חרוזי זכוכית 1.0 מ"מ | BioSpec | 11079110 | NA |
| חממה שייקר | ניו ברונסוויק סיינטיפיק סיינטיפיק | NB-I2400 | NA |
| מיקרו-נימי 5 מיקרוליטר | קימבל | 71900-5 | NA |
| מיקרו-פיפטה Beveler | Sutter Instrument Co. | BV-10 | |
| NA מיקרוסקופ Axiostar Plus | Zeiss | NA | |
| מיקרוסקופ OPMI Lumera | Zeiss | NA | |
| Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | דגם 607 | NA |
| פיפטה רב ערוצית 30-300 ומיקרו; L | Biohit | 15626090 | |
| NA פיפטה רב ערוצית 5-100 ומיקרו; L | Biohit | 9143724 | NA |
| חולץ מחט/פיפטה | Kopf | 730 | NA |
| PBS | GIBCO | בדרגה מולקולרית | |
| קוקטייל | רוש | 4693159001 | בדרגה מולקולרית |
| Katena | K5-8228 | NA |
מקורות
- Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
- Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
