ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

Summary

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

Abstract

ההצלחה של השתלת רקמה שגודלה במעבדה או מכשיר רפואי באדם כפופה לתגובה החיסונית של המארח המקבל. בהתחשב בשתל כגוף זר, תגובה חיסונית עוינת ולא מווסתת עלולה לגרום לדחיית השתל, בעוד תגובה מווסתת והחזרת הומאוסטזיס יכולה להוביל לקבלתו. ניתוח המיקרו-סביבות של שתלים המנותחים תחת הגדרות in vivo או ex vivo יכול לסייע בהבנת דפוס התגובה החיסונית, אשר בסופו של דבר יכול לסייע בפיתוח דורות חדשים של ביו-חומרים. ציטומטריית זרימה היא טכניקה ידועה לאפיון תאי מערכת החיסון ותת-קבוצותיהם בהתבסס על סמני פני התא שלהם. סקירה זו מתארת פרוטוקול המבוסס על חיתוך ידני, עיכול אנזימטי וסינון באמצעות מסננת תאים לבידוד מתרחיפים אחידים של תאים מרקמת השתל המנותחת. יתר על כן, הוסבר פרוטוקול צביעת ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים, יחד עם שלבים להגדרות ציטומטר ראשוניות כדי לאפיין ולכמת תאים מבודדים אלה על ידי ציטומטריית זרימה.

Introduction

ההתקדמות בתחום הרפואה הובילה לשימוש תכוף בחומרים מושתלים לתמיכה בתפקוד או צמיחה מחדש של רקמות פגועות ^1,2. אלה כוללים מכשירים כגון קוצבי לב, שתלים קוסמטיים משחזרים, ולוחות אורתופדיים המשמשים לקיבוע שבר עצם ^3,4. עם זאת, החומרים המשמשים לייצור שתלים אלה והמיקומים שבהם הם מושתלים ממלאים תפקיד חשוב בקביעת ההצלחה של שתלים אלה ^5,6,7. כגופים זרים, שתלים אלה יכולים ליצור תגובה חיסונית מהמארח שיכולה להוביל לדחייה או לסבילות⁸. גורם זה הניע את המחקר הביו-חומרי ליצור חומרים שיכולים למשוך את התגובה החיסונית הרצויה לאחר ההשתלה 9,10,11,12.

התגובה החיסונית היא דרישה חיונית בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כאשר רקמה או איבר גדלים סביב שלד ביו-חומרי (פיגום) במעבדה להחלפת רקמה או איבר פגומים^13,14,15,16. ברפואה רגנרטיבית, המטרה היא להחליף רקמות חסרות או פגומות באמצעות שימוש בתאים, אותות ופיגומים, שכל אחד מהם יכול להיות מווסת במידה רבה על ידי תגובות חיסוניות¹⁷. יתר על כן, גם כאשר רוצים חוסר תגובה חיסונית, לעיתים רחוקות מאוד מדובר בהיעדר פעילות חיסונית ולא בנוכחות פרופיל ויסות רצוי¹⁸ . טכניקות כגון ציטומטריית זרימה יכולות למלא תפקיד משמעותי באפיון דפוס התגובה החיסונית לביו-חומרים שונים המשמשים לציפוי מכשירי שתלים או לפיתוח פיגומים להנדסת רקמות¹⁹.

מידע זה, בתורו, יסייע בסופו של דבר בפיתוח ביו-חומרים לשתלים שיכולים להיות נסבלים היטב על ידי מערכת החיסון או בפיתוח פיגומים שיכולים למלא תפקיד בונה בהנדסת רקמות. הכנה נכונה של דגימות לניתוח לפי ציטומטריית זרימה היא צעד חשוב למניעת תוצאות לא מדויקות באפיון חיסוני באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי^20,21. לכן, סקירה זו מציגה מתודולוגיה מפורטת שניתן להשתמש בה לבידוד תאים מרקמת פיגום, צביעת תרחיף התא וניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

Protocol

הערה: איור 1 נותן סקירה כללית של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה.

1) הכנת ריאגנטים

1. הכינו מדיה לדילול אנזימים ולתרבית רקמות.
   1. הוסף 5 מ"ל של תמיסת חיץ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ל-500 מ"ל של סל"ד בינוני ונער היטב. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
2. חשב את נפח תמיסת האנזים.
   הערה: נפח תמיסת האנזים הוא נפח התווך המכיל את האנזימים (collagenase ו- DNase I) הדרושים לעיכול רקמות חתוכות לקוביות בצלחות 6 בארות; זה תלוי במספר הדגימות.
   1. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את אמצעי האחסון הנדרש:
      (מספר הדגימות לעיכול) × 5 מ"ל של סל"ד ללא סרום עם חיץ HEPES של 10 mM
      הערה: לדוגמה, עבור 0.1 עד 0.3 גרם של טחול מנותח, השתמש 5 מ"ל של מדיום כדי להכין את תמיסת האנזים. פרוטוקול העיכול האנזימטי המתואר בכתב יד זה מיועד בעיקר לרקמות רכות (בטווח שבין 0.1 ל-1 גרם) המנותחות מעכברים הכוללות את המוח, הכליות, העור, הכבד, הריאות, הטחול, השרירים וכן קפסולות סביב שתלים תת-עוריים העשויים מחומרים סינתטיים או חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. עיכול רקמות סחוס קשות עשוי לדרוש תנאים שונים ונפחים שונים של אנזימי עיכול, אשר ניתן לברר רק על ידי אופטימיזציה.
   2. חשב את כמות collagenase ו- DNase שהייתי צריך עבור תמיסת אנזים.
      הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש ב-0.25 מ"ג/מ"ל של קולגנאז ו-0.2 מ"ג/מ"ל של DNase I. ריכוזי העבודה הנדרשים עבור collagenase ו- DNase יכולים להשתנות עבור סוגים שונים של רקמות¹⁹.
3. הכינו תמיסת צבע בכדאיות בקנ"מ 1:1000 על ידי הוספת 1 מיקרוליטר של צבע הכדאיות (ראו טבלת חומרים) ל-999 מיקרוליטר של מלח חוצץ פוספט (PBS) ומערבלו את התמיסה. יש לאחסן את התמיסה בחושך בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
4. הכינו את מאגר הצביעה על ידי הוספת גרם אחד של אלבומין בסרום בקר (BSA) ל-100 מ"ל PBS, וערבבו את התמיסה עד להמסת BSA לחלוטין. יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.

2) הגדרת לוחות עיכול אנזימטיים

1. הגדר צלחת 6 בארות עם מסננות תאים 70 מיקרומטר בכל באר. מוסיפים 3 מ"ל של המדיום המוכן משלב 1.1.1 לכל באר, ודגרים על קרח.
2. יש לאחסן את המדיה הנותרת (2 מ"ל/באר) באינקובטור או באמבט מים בטמפרטורה של 37°C להשעיית הכמות המחושבת של collagenase ו-DNase I (שלב 1.2.2).

3) בידוד תאים

1. מניחים את השתלים/הרקמה המנותחים בצלחות, וחותכים דק בעזרת מספריים. לחלופין, השתמש בשיטת הפרעה מכנית באמצעות דיסוצייאטור רקמות או הומוגנייזר ידני. בשל המספר הגבוה של לויקוציטים, יש לנתח את הטחול כדי להשתמש בו כבקרת כתמים בכל ריצה.
   הערה: מכיוון שחומרים מסוימים גורמים לרמות גבוהות יותר של פיברוזיס, פרוטוקול זה ישים הן עבור חומרים פיברוטיים מאוד והן עבור חומרים פיברוטיים מינימליים. עם זאת, יש להעריך כל שיטת עיבוד הן מבחינת תפוקת התאים והן מבחינת הכדאיות לאחר העיכול לפני הצביעה. הימנע זיהום דם היקפי במהלך דיסקציה.
2. הוסף collagenase ו- DNase I (נפח מחושב בשלב 1.2.2) ל- RPMI הנותר (2 מ"ל) שחומם ל- 37 ° C. הוסף 2 מ"ל של תמיסת האנזים המלאה לכל באר.
3. הניחו את הצלחות בשייקר מודגר למשך 45 דקות ב-37°C וב-100 סל"ד.
   הערה: היזהר בעת ערימת צלחות מכיוון שהדבר עלול לעכב העברת חום נכונה.
4. בינתיים, הכינו קצה לחלוקת מתלים על ידי קיצוץ 3-4 מ"מ מקצה קצה 1000 μL עם מספריים. לאחר הדגירה, פיפטה את התרחיף בבארות למעלה ולמטה כדי לערבב אותו היטב באמצעות קצה קצוץ. מניחים את מסננת התא על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל ומעבירים את התמיסה המעוכלת דרך מסננת התא.
   הערה: מסננת התאים בגודל 70 מיקרומטר מספיקה כדי להפריד תאים מביו-חומר מושתל, כגון אלגינט. אם נדרש טוהר רב יותר, השתמש בתהליכים כגון הפרדת שיפוע צפיפות כדי להשיג אוכלוסייה מועשרת של לויקוציטים.
5. שטפו את הבארות בתמיסת PBS 1x, והעבירו את נפח השטיפה דרך המסננת, ולאחר מכן הוסיפו את שטיפות המסננת בתמיסת PBS 1x עד שהנפח בצינור מגיע ל-50 מ"ל.
   הערה: PBS 1x חייב להיות בטמפרטורת החדר כדי למנוע כל עלייה בצמיגות העיכול ולאפשר כדורי תאים במהלך צנטריפוגה.
6. צנטריפוגה את הצינור ב 300 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הצנטריפוגה, יש לשאוף את הסופרנאטנט בזהירות באמצעות פיפטה סרולוגית מבלי להפריע לכדורית. להשעות מחדש את הגלולה ב 1000 μL של 1x PBS, ולהעביר את המתלה לצינור מיקרוצנטריפוגה.
7. מערבבים 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של כחול טריפאן, וטוענים את המתלה על שקופיות תא ספירה לספירת תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או על המוציטומטר לספירה בשיטה המקובלת תחת מיקרוסקופ. לחלופין, השתמש בחרוזים לספירת תאי ציטומטריה של זרימה.

4) צביעה לציטומטריית זרימה

1. ראו איור 2 לדוגמה פריסת לוחות עבור ניסוי של 14 צבעים עם 45 דגימות, פקדי פלואורסצנטיות פחות אחד (FMO), בקרות פיצוי ובקרת דגימת טחול מוכתמת במלואה. לאחר הערכת המספר הכולל של תאים, חשב את נפח תרחיף התא הדרוש לצביעת 1 × 10⁶ תאים עבור כל דגימה, ו- 0.5 × 10⁶ תאים עבור כל פיצוי ובקרת FMO. הוציאו את הנפח הנדרש של תרחיף התא לבארות של צלחת V תחתונה 96 בארות, והשלימו את הנפח ל -100 μL עם PBS 1x.
   הערה: לדוגמה, אם 1000 μL של תרחיף תאים המתקבל בשלב 3.6 מכילים 40 × 10 6 תאים, אז עבור 1 × 10 6 תאים, 1000/40 × 10⁶ = 25 μL של השעיית תאים יידרש.
2. צנטריפוגו את הצלחת ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, לשאוף את supernatant, ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים בבארות הדגימה ובבאר בקרת פיצוי כדי לקבוע כדאיות, עם 100 μL של תמיסה 1:1000 של צבע הכדאיות (ראה טבלה של חומרים).
3. עבור תאים בבארות פיצוי אחרות, כמו גם FMO ובארות לא מוכתמות, להשעות אותם עם 100 μL של 1x PBS.
4. לדגור על התאים בחושך במשך 30 דקות ב 4 ° C.
5. בינתיים, הכינו קוקטייל נוגדנים משטח להכתמת הדגימה ובקרות FMO: 50 מיקרוליטר לדגימה או FMO. ראו טבלה 1 לדוגמה של קוקטייל הנוגדנים.
6. לאחר הדגירה, להוסיף 100 μl של 1x PBS לכל באר, להסתובב למטה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
7. לשאוף את supernatant ו resuspend ב 200 μL של חיץ צביעה (1x PBS + 1% BSA); צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).
8. לשאוף את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים פיצוי, FMO, בארות לא מוכתמים עם 50 μL של 1x PBS. הוסף 50 μL של קוקטייל הנוגדנים לבארות הדגימה ולבארות FMO המתאימות. הוסף את הנוגדנים המתאימים לבארות הפיצוי השונות.
9. לדגור על הצלחת במשך 45 דקות בחושך ב 4 ° C. לאחר הדגירה, להוסיף 150 μL של חיץ מכתים בכל באר, ולצנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
10. שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש את התאים עם 200 מיקרוליטר של חיץ צביעה, וצנטריפוגו את תרחיף התא ב 300 × גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
11. אם מנתחים דגימות ללא קיבוע, יש להשעות אותן מחדש ב-200 מיקרוליטר של חיץ צביעה, ולהמשיך לסעיף 6 על הגדרת ציטומטר וניתוח דגימות. אם מקבעים את התאים, יש לשאוף את הסופרנאטנט לאחר השטיפה, ולהוסיף 100 μL של חומר קיבוע כגון 4% פרפורמלדהיד. אם יש צביעה לסמנים תוך-תאיים, יש לעבור לסעיף 5 בנושא צביעה תוך-תאית, ולתקן ולחדור לתאים (ראו טבלת חומרים). לדגור על תאים במשך 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
    הערה: מכיוון שקיבוע יכול להשפיע על עוצמת הפלואורסצנטיות של פלואורופורים מסוימים, הערך כל פאנל עם ובלי קיבוע.
12. לאחר הדגירה, להוסיף 100 μL של 1x PBS, ואחריו צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו את הסופרנטנט, השהו מחדש ב-1x PBS וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-4°C.
13. יש להשהות מחדש את התאים ב-200 μL של חיץ הצביעה, ולאחסן ב-4°C לפני ניתוח ציטומטרי של זרימה.

5) צביעה תוך תאית

1. המשך משלב 4.11 עבור קיבוע וחדירה עבור סמנים תאיים, להוסיף 100 μL של המאגר המתאים. צנטריפוגה את התאים ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לשאוף את supernatant, ולתלות מחדש את הכדורים ב 200 μL של תמיסת סוכן מחלחל; צנטריפוגה את התאים ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. שאפו את הסופרנטנט, והשעו מחדש את הכדוריות עם נוגדנים תוך תאיים מדוללים בחיץ המתאים.
   הערה: סוגי נוגדנים ודילול יהיו תלויים בתאי היעד. לדוגמה, סמן תוך-תאי נפוץ אחד הוא תיבת ראש מזלג P3 עבור תאי T רגולטוריים, אשר משמש לעתים קרובות בדילול של 1:100.
2. לדגור על תרחיף התא בחושך במשך 45 דקות ב 4 ° C. לאחר הדגירה, להוסיף 150 μL של המאגר המתאים, וצנטריפוגה את המתלה ב 350 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
3. שאפו את הסופרנטנט, והשהו מחדש את התאים ב 200 מיקרוליטר של חיץ צביעה ואחריו צנטריפוגה ב 300 × גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. שאפו והשעו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של חיץ מכתים לצורך ניתוח ציטומטרי של זרימה.

6) ציטומטר והגדרת פיצוי

1. מיד לפני הרצת הדגימות, הכינו חרוזי פיצוי (ראו טבלת חומרים) אם משתמשים בפיצוי מבוסס חרוזים לעומת פיצוי מבוסס תאים.
   1. תייגו צינורות מיקרו-צנטריפוגות נפרדים עבור כל נוגדן מצומד פלואורוכרום, והוסיפו 100 μL של 1x PBS ואחריו טיפה אחת מלאה של חרוזי פיצוי בקרה שלילית נגד עכברים וטיפה אחת של חרוזי פיצוי בקרה חיובית לכל צינור. הוסף 1 μL של הנוגדן המתאים לכל צינור נפרד. מערבלים ודגרים במשך 5 דקות לפני הרכישה.
      הערה: מכיוון שלא ניתן לקשור צבעים מסוימים, כגון BUV737, לחרוזים, השתמש בפקד מבוסס תאים.
2. כייל את ציטומטר הזרימה לפני כל ניסוי על ידי הפעלת מערך הציטומטר עם חרוזי המעקב, ושמור על הגדרות ציטומטר הזרימה עבור כל ניסוי.
3. לפני ניתוח הדגימה, התאימו את ציטומטר הזרימה על ידי הפעלת דגימה לא מוכתמת כדי להתאים את אוכלוסיית התא בתרשים פיזור צדדי (SSC) לעומת פיזור קדימה (FSC) כך שאוכלוסיית התא תיפול במרכז העלילה ולא תהיה מחוץ לקנה המידה.
4. הפעל את הדגימה המוכתמת לזמן קצר כדי להתאים את המתחים עבור FSC ו- SSC ועבור כל ערוץ כדי לוודא שאף אירוע אינו חורג מהסולם הלוגריתמי של כל ערוץ. שיא של 5,000 אירועים עבור כל בקרת פיצוי, ואחריה גידור של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. חשב את מטריצת הפיצוי ולאחר מכן הפעל את הדגימות, איסוף לפחות 1,000 אירועים עבור האוכלוסיות המעניינות.
   הערה: יש לוודא פיצוי על לוחות צבעוניים גדולים יותר, מכיוון שפיצוי אוטומטי עלול להיות מועד לפיצוי יתר או חסר. כל פרמטר צריך להיות גרף מול כל פרמטר אחר כדי לעקוב אחר סימנים של פיצוי יתר או חסר, וכל פקד בצבע יחיד צריך להיות מוערך. פיצוי מורכב של ניסויים בצבע גדול יותר צריך להתבצע בסיוע של משתף פעולה או מתקן ליבה עם ניסיון ציטומטריה זרימה נרחב. סוגים חדשים יותר של ציטומטרים של זרימה כגון ציטומטרים ספקטרליים מנצלים את הספקטרום המלא של פלואורופור בתהליך המכונה אי-ערבוב ספקטרלי, אשר יכול להניב הבחנה נקייה יותר של חפיפה פלואורסצנטית בהשוואה לפיצוי סטנדרטי בלבד²².

Results

תהליך הפיתוח של לוחות ציטומטריית זרימה לניתוח חיסוני מסתמך לעתים קרובות על השוואת התוצאות לנתונים הקיימים ולספרות בתחום. הידע על האופן שבו אוכלוסיות עשויות להופיע בציטומטריית זרימה הוא קריטי לפרשנות נכונה של נתונים. בכל מקרה, אוכלוסיות וסוגי תאים יכולים להופיע באופן שונה ברקמות שונות, כך שיש לצפות לשונות מסוימת. בהקשר של רקמות בקרה מוגדרות היטב, אופטימיזציה כזו של צביעה יכולה להיות מוערכת מול רקמות ידועות שיש להן סוגי תאים שנחקרו היטב. איור 3 מציג את התוצאות ...

Discussion

סקירה זו מתארת מתודולוגיה מפורטת לבידוד תאים משתלים ביו-חומריים להשגת תרחיף תאים אחיד. בנוסף, סופק פרוטוקול מפורט לצביעת תרחיף התא עבור ציטומטריית זרימה צבעונית, יחד עם השלבים להגדרת ציטומטר זרימה לקבלת תוצאות אופטימליות. שיטות בידוד תאים יכולות לכלול שלבים מרובים, לעתים קרובות באמצעות דיסקציה ידנית של רקמות ואחריה עיכול אנזימטי עם אנזימים מפרקי חלבון כדי לנתק את המטריצה החוץ תאית ברקמה ולשבש את הצטלבויות התא כדי לשחרר תאים בודדים מהרקמה. לאחר העיכול, יש צורך בעיבוד נוסף, כגון מאמץ תאים, כדי להסיר את הפסולת שנותרה ולהבטי...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 מ"ל צינורות חרוטיים	פישר סיינטיפיק	14-432-22
6 באר צלחת	פישר סיינטיפיק	07-000-646
BD מאגר כתמים מבריק פלוס	BD Biosciences	566385
BD Cytofix	BD Biosciences	554655	לקיבוע תאים בלבד
אלבומין סרום בקר	Millipore Sigma	A7906	להכנת FACS מאגר מכתים
CD11b AF700	Biolegend	101222	שיבוט: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5	Biolegend	117325	שיבוט: N418
CD197 PE/Dazzle594	Biolegend	120121	שיבוט: 4B12
CD200R3 APC	Biolegend	142207	שיבוט: Ba13
CD206	PE Biolegend	141705	שיבוט: C068C2
CD45 BUV737	BD Biosciences	612778	שיבוט: 104/A20
CD86 BUV395	BD Biosciences	564199	שיבוט: GL1
CD8a BV421	Biolegend	100737	שיבוט: 53-6.7
Comp Bead anti-mouse	BD Biosciences		552843 לבקרת פיצוי
DNase I	Millipore Sigma	11284932001	בקר לבלב דאוקסיריבונוקלאז I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7	Biolegend	123113	שיבוט: BM8
Fc Block	Biolegend	101301	שיבוט: 93
קיבוע/חדירות פתרון ערכת BD	Biosciences	554714	לקיבוע וחדירות של תאים.
מאגר HEPES	Thermo Fisher	15630080	Buffer להשלמת מדיה תאית
Liberase	Millipore Sigma		5401127001 תערובת של קולגנאז מטוהר I וקולגנאז II
חי/מת ערכת כתמי תאים מתים כחולים לתיקון Thermo	Fisher	L23105	צבע כדאיות
Ly6c AF488	Biolegend	128015	שיבוט: HK1.4
Ly6g BV510	Biolegend	שיבוט 127633	: 1A8
MHCII BV786	BD Biosciences	742894	שיבוט: M5 / 114.15.2
מאגר פוספט מלח	תרמו פישר	D8537
RPMI	תרמו פישר		11875176 מדיה לתרבית תאים
Siglec F BV605	BD Biosciences	740388	שיבוט: E50-2440
צלחת			V-bottom 96 בארות