Method Article

ציטומטריית זרימה בממדיות גבוהה לניתוח תפקוד מערכת החיסון של רקמות שתל מנותחות

DOI:

10.3791/61767

⸱

September 15th, 2021

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד תאים משתלים מנותחים ואפיונם לפי ציטומטריית זרימה יכולים לתרום משמעותית להבנת דפוס התגובה החיסונית נגד שתלים. מאמר זה מתאר שיטה מדויקת לבידוד תאים משתלים מנותחים וצביעתם לצורך אנליזה ציטומטרית של זרימה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההצלחה של השתלת רקמה שגודלה במעבדה או מכשיר רפואי באדם כפופה לתגובה החיסונית של המארח המקבל. בהתחשב בשתל כגוף זר, תגובה חיסונית עוינת ולא מווסתת עלולה לגרום לדחיית השתל, בעוד תגובה מווסתת והחזרת הומאוסטזיס יכולה להוביל לקבלתו. ניתוח המיקרו-סביבות של שתלים המנותחים תחת הגדרות in vivo או ex vivo יכול לסייע בהבנת דפוס התגובה החיסונית, אשר בסופו של דבר יכול לסייע בפיתוח דורות חדשים של ביו-חומרים. ציטומטריית זרימה היא טכניקה ידועה לאפיון תאי מערכת החיסון ותת-קבוצותיהם בהתבסס על סמני פני התא שלהם. סקירה זו מתארת פרוטוקול המבוסס על חיתוך ידני, עיכול אנזימטי וסינון באמצעות מסננת תאים לבידוד מתרחיפים אחידים של תאים מרקמת השתל המנותחת. יתר על כן, הוסבר פרוטוקול צביעת ציטומטריה של זרימה מרובת צבעים, יחד עם שלבים להגדרות ציטומטר ראשוניות כדי לאפיין ולכמת תאים מבודדים אלה על ידי ציטומטריית זרימה.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות בתחום הרפואה הובילה לשימוש תכוף בחומרים מושתלים לתמיכה בתפקוד או צמיחה מחדש של רקמות פגועות 1,2. אלה כוללים מכשירים כגון קוצבי לב, שתלים קוסמטיים משחזרים, ולוחות אורתופדיים המשמשים לקיבוע שבר עצם 3,4. עם זאת, החומרים המשמשים לייצור שתלים אלה והמיקומים שבהם הם מושתלים ממלאים תפקיד חשוב בקביעת ההצלחה של שתלים אלה 5,6,7. כגופים זרים, שתלים אלה יכולים ליצור תגובה חיסונית מהמארח שיכולה להוביל לדחייה או לסבילות8. גורם זה הניע את המחק....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: איור 1 נותן סקירה כללית של פרוטוקול ציטומטריית הזרימה.

1) הכנת ריאגנטים

  1. הכינו מדיה לדילול אנזימים ולתרבית רקמות.
    1. הוסף 5 מ"ל של תמיסת חיץ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) ל-500 מ"ל של סל"ד בינוני ונער היטב. יש לאחסן את המדיום בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
  2. חשב את נפח תמיסת האנזים.
    הערה: נפח תמיסת האנזים הוא נפח התווך המכיל את האנזימים (collagenase ו- DNase I) הדרושים לעיכול רקמות חתוכות לקוביות בצלחות 6 בארות; זה תלוי במספר הדגימות.
    1. השתמש במשוואה הבאה כדי לחשב את אמצעי האחסון הנדרש:
      (מספר הדגימות לעיכול) × 5 מ"ל של סל"ד ללא סרו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליך הפיתוח של לוחות ציטומטריית זרימה לניתוח חיסוני מסתמך לעתים קרובות על השוואת התוצאות לנתונים הקיימים ולספרות בתחום. הידע על האופן שבו אוכלוסיות עשויות להופיע בציטומטריית זרימה הוא קריטי לפרשנות נכונה של נתונים. בכל מקרה, אוכלוסיות וסוגי תאים יכולים להופיע באופן שונה ברקמות שונות, כך שיש לצפות לשונות מסוימת. בהקשר של רקמות בקרה מוגדרות היטב, אופטימיזציה כזו של צביעה יכולה להיות מוערכת מול רקמות ידועות שיש להן סוגי תאים שנחקרו היטב. איור 3 מציג את התוצאות .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקירה זו מתארת מתודולוגיה מפורטת לבידוד תאים משתלים ביו-חומריים להשגת תרחיף תאים אחיד. בנוסף, סופק פרוטוקול מפורט לצביעת תרחיף התא עבור ציטומטריית זרימה צבעונית, יחד עם השלבים להגדרת ציטומטר זרימה לקבלת תוצאות אופטימליות. שיטות בידוד תאים יכולות לכלול שלבים מרובים, לעתים קרובות באמצעות דיסקציה ידנית של רקמות ואחריה עיכול אנזימטי עם אנזימים מפרקי חלבון כדי לנתק את המטריצה החוץ תאית ברקמה ולשבש את הצטלבויות התא כדי לשחרר תאים בודדים מהרקמה. לאחר העיכול, יש צורך בעיבוד נוסף, כגון מאמץ תאים, כדי להסיר את הפסולת שנותרה ולהבטי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית המחקר האינטרמורלי של ה-NIH, כולל המכון הלאומי לדימות ביו-רפואי וביו-הנדסה. כתב ויתור: ה-NIH, נושאי המשרה שלו ועובדיו אינם ממליצים או תומכים בשום חברה, מוצר או שירות.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 מ"ל צינורות חרוטייםפישר סיינטיפיק14-432-22
6 באר צלחתפישר סיינטיפיק07-000-646
BD מאגר כתמים מבריק פלוסBD Biosciences566385
BD CytofixBD Biosciences554655לקיבוע תאים בלבד
אלבומין סרום בקרMillipore SigmaA7906להכנת FACS מאגר מכתים
CD11b AF700Biolegend101222שיבוט: M1/70
CD11c PerCP/Cy5.5Biolegend117325שיבוט: N418
CD197 PE/Dazzle594Biolegend120121שיבוט: 4B12
CD200R3 APCBiolegend142207שיבוט: Ba13
CD206PE Biolegend141705שיבוט: C068C2
CD45 BUV737BD Biosciences612778שיבוט: 104/A20
CD86 BUV395BD Biosciences564199שיבוט: GL1
CD8a BV421Biolegend100737שיבוט: 53-6.7
Comp Bead anti-mouseBD Biosciences552843 לבקרת פיצוי
DNase IMillipore Sigma11284932001בקר לבלב דאוקסיריבונוקלאז I (DNase I)
F4/80 PE/Cy7Biolegend123113שיבוט: BM8
Fc BlockBiolegend101301שיבוט: 93
קיבוע/חדירות פתרון ערכת BDBiosciences554714לקיבוע וחדירות של תאים.
מאגר HEPESThermo Fisher15630080Buffer להשלמת מדיה תאית
LiberaseMillipore Sigma5401127001 תערובת של קולגנאז מטוהר I וקולגנאז II
חי/מת ערכת כתמי תאים מתים כחולים לתיקון ThermoFisherL23105צבע כדאיות
Ly6c AF488Biolegend128015שיבוט: HK1.4
Ly6g BV510Biolegendשיבוט 127633: 1A8
MHCII BV786BD Biosciences742894שיבוט: M5 / 114.15.2
מאגר פוספט מלחתרמו פישרD8537
RPMIתרמו פישר11875176 מדיה לתרבית תאים
Siglec F BV605BD Biosciences740388שיבוט: E50-2440
צלחתV-bottom 96 בארות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
  2. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryImmune Function AnalysisImplant Tissue DissectionCell Isolation ProtocolEnzymatic DigestionMulticolor StainingCell Surface MarkersImmune Cell CharacterizationBiomaterial Immune ResponseSpectral Unmixing

Related Articles