מודלים שונים של בעלי חיים של שבר דיאפרגמטי מולד וחסימת קנה הנשימה העוברי מציגים יתרונות וחסרונות לגבי סוגיות אתיות, עלות, קושי כירורגי, גודל, שיעורי הישרדות וזמינות של כלים גנטיים. מודל זה מספק כלי חדש כדי ללמוד את ההשפעה של חסימת קנה הנשימה והלחץ המואצני המוגבר על התפתחות הריאות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
חסימת קנה הנשימה העוברית (TO), שיטה לטיפול מבוסס, מקדמת צמיחת ריאות עוברית והישרדות בבקע דיאפרגמטי מולד חמור (CDH). בעקבות TO, שמירה על נוזל האפיתל המופרש מגבירה את הלחץ הזוהר וגורם לצמיחת ריאות. מודלים שונים של בעלי חיים הוגדרו כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של CDH ו TO. לכולם יתרונות וחסרונות משלהם כגון הקושי של הטכניקה, גודל החיה, עלות, שיעורי תמותה גבוהים, ואת הזמינות של כלים גנטיים. להלן, מודל טרנסוטריני חדשני של TO עוברי מורין מתואר. עכברים בהריון היו מורדמים, והרחם נחשף דרך לפרוטומיה בקו האמצע. קנה הנשימה של עוברים נבחרים היה קשור בתפר טרנספורמטריני יחיד שהונח מאחורי קנה הנשימה, עורק עורק ראשי אחד, ווריד עורק אחד. הסכר נסגר והורשה להתאושש. עוברים נאספו ממש לפני ההסתעפות. יחס משקל הריאה לגוף בעוברים TO היה גבוה מזה בעוברים בשליטה. מודל זה מספק לחוקרים כלי חדש כדי לחקור את ההשפעה של שניהם TO ולחץ לומינלי מוגבר על התפתחות הריאות.
מבוא
בקע דיאפרגמטי מולד (CDH) מתרחשת ב 1:2500 הריונות ותוצאות היפופלזיה ריאתי ויתר לחץדםריאתי יילודים 1,2,3,4,5,6. חסימת קנה הנשימה העוברית (TO) הוא טיפול טרום לידתי הוקמה בחולי CDH חמורים מעורבים fetoscopy בשבוע ההיריון 26-30 שבו בלוןממוקם ממש מעל קרינה ולאחר מכן הוסר בשבוע ההיריון32. TO זמני זה גורם לצמיחת ריאות עוברית ומשפר את ההישרדות. תסמונת חסימת High Airway מולדת היא מצב קטלני הקשור להיפרפלזיה של הריאות, אשר נתן השראה למנתחים לבצע חסימה מלאכותית של קנה הנשימה כדי לקדם את השמירה על נוזל האפיתל המופרש. חסימה זו הגבירה את הלחץ הזוהר וצמיחת ריאות המושרה7. עם זאת, החסימה צריכה להיות הפוכה כדי לאפשר התבגרות תא אפיתל.
מודלים שונים של בעלי חיים של CDH ו- TO - ביצית, ארנב, חולדה ועכבר - פותחו כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של CDH ו- TO. לכולם יתרונות וחסרונות משלהם כגון הקושי של הטכניקה, גודל החיה, עלות, שיעורי תמותה גבוהים, ואת הזמינות של כלים גנטיים. למרות הטכניקה הכירורגית המשמשת את מודל הביצית דומה מאוד לזה המשמש בבני אדם יכול להיות הפוך, החסרונות העיקריים של מודל זה הם על חשבון החיה, תקופת ההיריון הארוכה, ואת המספר המוגבל של ניתוחים אפשריים. לדגם הארנב תקופת הריון קצרה יותר והוא זול יותר מדגם הכבשים. עם זאת, מודל הארנב הוא בלתי הפיך8,9. למודל המורין יש את העלות הנמוכה ביותר, את המספר הגבוה ביותר של עוברים להריון, את הגנום המאופיינת ביותר, וכלים זמינים נרחבים לניתוחים תאיים ומולקולריים. עם זאת, חיסרון מרכזי הוא חוסר ההפיכה של TO, מניעת הבנה מלאה של ההשפעה של TO. בזאת מוצגת שיטה המשלבת את כל היתרונות של הדגמים שהוזכרו לעיל ויוצרת מודל TO מכרסמים קל, בעל פוטנציאל הפיך ומינימום פולשני.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים נענו למדריך המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה (NIH Publications מס' 80023, תוקן בשנת 1978). ההליך אושר בפרוטוקול IACUC #2016-0068 על ידי קרן המחקר לילדים של סינסינטי ועדת טיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים.
1. הכנה
- כדי להזדווג עם עכברים מסוג פראי (WT) C57BL/6 תואמי גיל, הנח אותם באותו כלוב בשעה 18:00 .m והפרידו ביניהם בשעה 9:00 בבוקר.m למחרת.
- כדי לקבוע את היום העוברי 0 (E0), להסתכל על תקע הנרתיק, אשר יש אזור חיצוני הומוגני מחובר לקיר הנרתיק ואזור פנימי כי הוא סיבי וכולל כמה זרעונים היוצרים גושים סבוכים מעורבב עם הסיבים של חומר התקע.
- רשום את משקל העכברים בזמן ההזדווגות.
- לשקול מחדש את העכברים על E10 כדי להבטיח הריון מתמשך.
- בצע את הניתוח על E16.5 (שלב תעלות מוקדם).
- לעקר את המכשירים כי הם הולכים לשמש במהלך הניתוח: מספריים, מחזיק מחט, מלקחיים, מלחציים, סכינים כירורגיות וידיות.
- מחממים מראש את פלטפורמת הניתוח ל 24 מעלות צלזיוס ומכינים מלוחים חמים (24 מעלות צלזיוס) לפני הניתוח.
- ליצור סביבה חמה להתאוששות, ולהשאיר מזון רטוב בתוך הכלוב להאכלה מוקדמת.
- הישארו עם החיות המופעלות עד שיוכלו להאכיל את עצמם.
- שמור את העכברים המופעלים לבד בכלובים האישיים שלהם לאחר הניתוח.
2. הרדמה
- החל תת עורית 0.1 מ"ג/ק"ג של buprenorphine על סכרים בהריון 1 שעות לפני ההליך.
- השתמש בשאיפה של 5 מ"ל/שעה של isoflurane עבור אינדוקציה ו 2 מ"ל / שעה ברציפות במהלך ההליך להרדמה.
- לפקח על התנועות של הסנטרים של העכברים ההרים.
3. לפרוטומיה
- נקה את משטח הבטן עם אלכוהול ו povidone-יוד. שמור על תנאים סטריליים לאורך כל המבצע.
- בצע חתך אנכי לפרוטומיה של סכרים בהריון. חותכים את כל השכבות בנפרד.
- זהה קרני רחם מכל צד.
- קבע את העוברים המועמדים לניתוח.
הערה: אין לנתח את העוברים הקרובים ביותר לנרתיק. - לנתח על שני עוברים בכל קרן הרחם אם יש מספר זוגי של עוברים בכל צד (4 רוב הזמן), ועל 1 עובר בכל קרן הרחם אם יש מספר אי זוגי של הרחם(3 רוב הזמן).
4. חסימת קנה הנשימה
- השתמש במשקפי הגדלה 2.5x להדמיה.
- מקם את קרן הרחם בצורה רוחבית.
- קח את הגורים, פונה כלפי מעלה, בין שתי אצבעות באמצעות העיניים של הגורים והזנב כמדריך למקם את העובר.
- החל לחץ עדין על ראשו של הגור כדי לאפשר הארכה של הראש ולכן, הדמיה של הצוואר.
- השתמש בתפר פוליפרופילן 6.0 עם מחט אטראומטית כדי לבצע TO (איור 1). שמור את השליה בצד ורחוק מנקודות הכניסה והיציאה של המחט.
- הכנס את המחט רוחבית דרך הצד של הרחם הרחק השליה דרך החלק1/3 הצדדי של הצוואר.
- להזיז את המחט בעדינות עד קו האמצע של הצוואר ולכוון אותו לחלק השני, ואז לצאת את הצוואר בין קנה הנשימה ומול נדן הראש והרחם.
- קשר את התפר, דואג לשמור על שלמות הממברנות ודפן הרחם, ולשמור על חבל הטבור בטוח במהלך הקשר.
איור 1: חסימת קנה הנשימה. (A) התפר הטרנס-רחמי העובר בצוואר. (B)ייצוג סכמטי של המבנים לאחר שהתפר עובר דרך ולפני הקשר. קיצורים: C = עורק ראשי; J = וריד הצוואר; T = קנה הנשימה; E = ושט; V = חוליה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
5. סגירת קיר בטן
- החלף את קרן הרחם בבטן.
- להזריק 2 מ"ל של מלוחים סטריליים חמים לתוך חלל הצפק לפני הסגירה.
- שים תפר פוליגלקטין פועל 5/0 כדי לסגור את דופן הבטן, ולסגור את העור עם תפר משי שאינו פועל.
- יש למרוח 0.1 מ"ג/ק"ג של בופרנורפין תוך-פיוריטון על משככי כאבים, ולאפשר את התאוששות הסכר באינקובטור חם.
6. הקציר
- יש למרוח הרדמה על הסכר ההריוני, ולקצור את כל העוברים ב-E18.5 בניתוח קיסרי.
- בדוק את הכדאיות של העוברים על ידי צפייה בתנועות העוברים.
- השתמש לפחות שתי טכניקות שונות עבור המתת חסד: אי ספיקת פחמן דו חמצני ונקע בצוואר הרחם.
- הסר את הגופות בהתאם להסדרת המעבדה הווטרינרית.
- לשקול את כל העוברים.
- בצע חתך אנכי על בית החזה עבור בית החזה כדי להסיר את הריאות.
- לנתח את הריאות של עוברים, ולשקול אותם כדי לחשב את יחס משקל הריאה הכולל לגוף (LBWR = (משקל ריאה שמאל + משקל ריאות ימין)/ משקל גוף x100).
7. היסטולוגיה
- להקפיא את הרקמות בחנקן נוזלי, תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית, וקרח יבש.
- חותכים את הדגימות ב 10 μm סעיפים באמצעות cryostat, ולהרכיב אותם על שקופיות מצופה פולי ליסטין.
- אופים את השקופיות ב 60 מעלות צלזיוס לילה, ולהכתים את השקופיות האפויות עם המטוקסילין ואאוסין לפני הרכבה אותם לרכישת תמונה ב 10-20x הגדלה באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב.
8. עיבוד רקמות לניתוחי חלבונים ודנ"א
- להקפיא את הריאות העובריות מנותח, הומוגניזציה אותם ב 300 μL של חיץ מבחני radioimmunoprecipitation. צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות ב 18,000 × גרם.
- לחלץ ולכמת חלבון, DNA, ו RNA10,12.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר זה נבדקו 37 עוברים: 20 (54.1%) כ-TO לעומת 17 (45.9%) כשליטה. מכיוון שלא ניתן היה לחסן את קנה הנשימה ב-4 עוברים בקבוצת TO, הם לא נכללו במחקר. בשתי הקבוצות לא היה הבדל משמעותי בתמותה: 4 עוברים (25%) בקבוצת TO ו-2 עוברים (12%) בקבוצת הביקורת (p= 0.334, יחס יחסי זכייה (OR) 2.5, 95% רווח בר-סמך (CI) 0.39-16.05). משקל הגוף הממוצע, משקל הריאה ויחס משקל הריאה לגוף (LBWR) היו גבוהים יותר בקבוצה TO מאשר בקבוצת הביקורת (טבלה 1). היה הבדל משמעותי ב- LBWR (p = 0.006) בין קבוצות ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שיטה זו מתארת הליך כירורגי של חסימת קנה הנשימה העובר בעכברים והשפעתו על התפתחות הריאות. ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול שיש לבצע בקפידה עבור TO מוצלח. החום של הפלטפורמה שבה הניתוח מתרחש ואת מלוחים הציג לתוך חלל הצפק הוא חיוני להתקדמות של ההריון. בנוסף, לחץ קל צריך להיות מיושם על ראש הגורים כדי להבטיח חשיפה של הצוואר.
תפר פוליפרופילן 6.0 הוא התפר היחיד שניתן להשתמש בו לטכניקה זו. מחטי התפרים הגדולות מ-6.0 עבות יותר והורסות את המבנים סביב קנה הנשימה בצוואר, וכתוצאה מכך אובדן העובר. המחטים של ה...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
מחקר זה לא קיבל מענק ספציפי מגופי מימון במגזר הציבורי, המסחרי או השלישי. כל המחברים תרמו תרומה משמעותית לתפיסה ולעיצוב של המחקר, הרכישה, הניתוח והפרשנות של הנתונים, ניסוח המאמר ותיקוןו לתוכן אינטלקטואלי חשוב ואישור סופי של הגרסה שתוגש. המחברים מודים לקאן סבונקואולו על מאמציו האדיבים בהפקת יצירות האמנות של הטכניקה הכירורגית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| בופרנורפין | Par Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | להרדמה אזורית |
| Isoflurane | Halocarbon Life Sciences | NDC 66794-017-25 | להרדמה כללית |
| משקפי הגדלה | ארה"ב רפואי-כירורגי | SLR-250LBLK | לפחות 2.5x |
| מיקרוסקופ ניקון 90i | ניקון | 3417 | נוקלאוספין פלואורסצנטי ממונעת |
| מצ'רי-נייגל, Dü ren, גרמניה | 740952.5 | בידוד DNA | |
| Pierce BCA ערכת בדיקת חלבון | תרמו פישר, IL, ארה"ב | 23225 | כימות חלבון |
| תפר פוליגלקטין | Ethicon | VCP451H | 4-0, 24 מ"מ, חיתוך |
| שקופיות פוליליזין | VWR | 48382-117 | שקופיות הידבקות מיקרוסקופ |
| תפר פוליפרופילן | Ethicon | Y432H | 6-0, 13 מ"מ 1/2c מאגר RIPA מתחדד |
| סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב | R0278-50 מ"ל | בידוד חלבון | |
| תפר משי | Ethicon | VCP682G | 4-0, 24 מ"מ, חיתוך |
| טריזול | Invitrogen | 15596026 | בידוד RNA |
מקורות
- Wright, N. J. Global PaedSurg Research Collaboration. Management and outcomes of gastrointestinal congenital anomalies in low, middle and high income countries: protocol for a multicentre, international, prospective cohort study. BMJ Open. 9, 030452(2019).
- Aydin, E. Current approach for prenatally diagnosed congenital anomalies that requires surgery. Turkish Clinics Journal of Gynecology and Obstetrics. 27, 193-199 (2016).
- Nolan, H., et al. Hemorrhage after on-ECMO repair of CDH is equivalent for muscle flap and prosthetic patch. Journal of Pediatric Surgery. 54 (10), 2044-2047 (2019).
- Aydin, E., et al. Congenital diaphragmatic hernia: the good, the bad, and the tough. Pediatric Surgery International. 35 (3), 303-313 (2019).
- Aydın, E., Özler, O., Burns, P., Lim, F. Y., Peiró, J. L. Left congenital diaphragmatic hernia-associated musculoskeletal deformities. Pediatric Surgery International. 35 (11), 1265-1270 (2019).
- Aydın, E., et al. When primary repair is not enough: a comparison of synthetic patch and muscle flap closure in congenital diaphragmatic hernia. Pediatric Surgery International. 36 (4), 485-491 (2020).
- Wilson, M., Difiore, J. W., Peters, C. A. Experimental fetal tracheal ligation prevents the pulmonary hypoplasia associated with fetal nephrectomy: Possible application for congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 28 (11), 1433-1440 (1993).
- Mudri, M., et al. The effects of tracheal occlusion on Wnt signaling in a rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Journal of Pediatric Surgery. 54 (5), 937-944 (2019).
- Khan, P. A., Cloutier, M., Piedboeuf, B. Tracheal occlusion: a review of obstructing fetal lungs to make them grow and mature. American Journal of Medical Genetics. Part C, Seminars in Medical Genetics. 145 (2), 125-138 (2007).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA and proteins from cell and tissue samples. Biotechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Beurskens, N., Klaassens, M., Rottier, R., De Klein, A., Tibboel, D. Linking animal models to human congenital diaphragmatic hernia. Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 79 (8), 565-572 (2007).
- Varisco, B. M., et al. Excessive reversal of epidermal growth factor receptor and ephrin signaling following tracheal occlusion in rabbit model of congenital diaphragmatic hernia. Molecular Medicine. 22, 398-411 (2016).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
