מאמר שיטה

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

DOI:

10.3791/61780

⸱

24 בפברואר 2021

 ,  , 
1Nuclear Magnetic Resonance Group, National Institute of Environmental Health Sciences

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר את הסרת השומנים האנדוגניים מאלרגנים, ואת החלפתם בליגדות שצוינו על-ידי המשתמש באמצעות HPLC הפוך בשילוב עם חישול תרמי. 31 P-NMR ו dichroism מעגלי לאפשר אישור מהיר של הסרת ליגנד / טעינה, ואת ההתאוששות של מבנה אלרגנים מקורי.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלרגנים מרכזיים רבים נקשרים למולקולות הידרופוביות דמויי שומנים, כולל Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 ו- Fel d 1. ליגנדים אלה נשמרים בחוזקה ויש להם פוטנציאל להשפיע על תהליך הרגישות או באמצעות גירוי ישיר של המערכת החיסונית או שינוי התכונות הביופיזיות של החלבון האלרגני. על מנת לשלוט על משתנים אלה, טכניקות נדרשות להסרת ליגנדים מאוגדים אנדוגני, ואם יש צורך, החלפה עם שומנים של הרכב ידוע. אלרגן המקק Bla g 1 מוקף חלל הידרופובי גדול אשר קושר תערובת הטרוגנית של שומנים אנדוגני כאשר מטוהרים באמצעות טכניקות מסורתיות. כאן, אנו מתארים שיטה שדרכה שומנים אלה מוסרים באמצעות HPLC פאזה הפוכה ואחריו חישול תרמי להניב Bla g 1 בצורת Apo שלה או נטען מחדש עם תערובת מוגדרת על ידי המשתמש של חומצות שומן או מטענים פוספוליפידים. צימוד פרוטוקול זה עם מבחנים ביוכימיים מגלה כי מטעני חומצות שומן משנים באופן משמעותי את התרמו היציבות וההתנגדות הפרוטאוליטית של Bla g 1, עם השלכות במורד הזרם על קצב ייצור האפיטופים של תאי T ואלרגניות. תוצאות אלה מדגישות את החשיבות של הסרת השומנים / טעינה מחדש פרוטוקולים כגון זה המתואר בזאת בעת לימוד אלרגנים ממקורות רקומביננטיים וטבעיים כאחד. הפרוטוקול ניתן להכללה למשפחות אלרגנים אחרות כולל ליפוקלינים (Mus m 1), PR-10 (בית v 1), MD-2 (Der p 2) ו Uteroglobin (פל ד 1), מתן כלי רב ערך כדי ללמוד את התפקיד של שומנים בתגובה אלרגית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סקר של מסד הנתונים אלרגנים מגלה כי אלרגנים נמצאים רק 2% של כל משפחות החלבון הידוע, מציע תכונות תפקודיות וביופיזיות נפוצות לתרום אלרגניות1. מבין מאפיינים אלה, נראה כי היכולת לקשור מטעני שומנים מיוצגת יתר על המיד בקרב אלרגנים, דבר המצביע על כך שמטענים אלה עשויים להשפיע על תהליך הרגישות1. אכן, הוכח כי ברזיל אגוז אלרגן Ber e 1 דורש שיתוף ממשל עם השומנים אנדוגני שלה כדי לממש את מלוא פוטנציאל הרגישות שלה2. שומנים אלה עלולים לעורר את המערכת החיסונית ישירות כפי שמודגם על ידי אלרגנים קרדית Der p 2 ו Der p 7, שניהם חולקים הומולוגיה מבנית חזקה עם חלבונים מחייבי LPS3,4,5. בהתבסס על תצפית זו הוצע כי Derp 2 ו Der p 7 יכול לקשור שומנים חיידקיים ישירות לעורר את המערכת החיסונית המארחת באמצעות איתות TLR4 בתיווך, להקל על תהליך הרגישות5,6. זה גם אפשרי כי שומנים מאוגדים אנדוגני יכול לשנות את המאפיינים הביופיזיים של חלבונים אלרגניים עצמם. לדוגמה, היכולת של חטא 2 (חרדל) ו Ara h 1 (בוטנים) לקיים אינטראקציה עם פוספוליפידים vesicles שיפרה באופן משמעותי את עמידותם השפלה קיבה אנדוסומלית7, בעוד קשירה ליגנד אלרגן אבקה ליבנה הגדול ב ' v 1 שינה הן את קצב העיבוד האנדוזומלי ואת המגוון של פפטידים וכתוצאה מכך8. זה רלוונטי במיוחד לאלרגניות בהתחשב במתאם שנצפה בין יציבות, דור האפיטופים של תאי T ואלרגניות לחלבונים כמו Bet v 1 ו- Bla g 1; האחרון שבהם יהיה הנושא של עבודה זו9,10.

Bla g 1 מייצג את החבר הטיפוסי של משפחת החלבון מייג'ור אלרגן (MA), ובעל מבנה ייחודי המורכב מ -12 הליקי אלפא אמפיפתיים המקיפים חלל הידרופובי גדול באופן חריג9,11. מבנה גביש רנטגן זמין של Bla g 1 מראה צפיפות אלקטרונים בתוך חלל זה עולה בקנה אחד עם פוספוליפיד קשור או חומצת שומן ליגנדים; השערה שאושרה על ידי 31P-NMR וספקטרומטריית מסה. מטענים אלה היו הטרוגניים בטבע והרכבם היה תלוי במידה רבה במקור האלרגן, עם פרופילי שומנים שונים שנצפו עבור Bla g 1 רקומביננטי לידי ביטוי E. coli ו P. pastoris. באופן מוזר, Bla g 1 מטוהר ממקור האלרגן הטבעי שלו (frass ג'וק) הכיל בעיקר חומצות שומן בתוך אתר הכריכה שלה, עם תערובת של palmitate, oleate, ו stearate להיות מזוהה כמו ליגנדים "טבעי" שלה9,11. היכולת של Bla g 1 לשמור שומנים וחומצות שומן בעקבות צעדי טיהור מרובים מעכבת את המאמצים לחקור את החלבון בבידוד. לעומת זאת, הוצע כי פלמיאט טבעי, stearate, ו oleate ליגנדים של Bla g 1 (מעתה ואילך המכונה nMix) לשחק תפקיד מפתח הן אלרגניות שלה פונקציה ביולוגית מקורית9. עם זאת, ליגנדים אלה אינם נוכחים Bla g 1 המתקבל ממקורות רקומביננטיים, מה שמקשה להעריך השערה זו. בעיות דומות נצפו עבור אלרגנים מחייבים שומנים אחרים כגון בית v 112,13. כדי להקל על המחקר השיטתי של אינטראקציות השומנים-אלרגן פיתחנו פרוטוקול שבאמצעותו אלרגנים יכולים להיות מופשטים כמותית של השומנים שלהם מאוגדים אנדוגנית ו reconstituted או אפו טופס או טעון עם ליגנדים ספציפיים.

אלרגנים מטוהרים בדרך כלל ממקורותיהם הטבעיים או הרקומביננטיים באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה ו/או כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל. כאן, אנו מציגים שלב טיהור נוסף בצורה של כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) המעסיקה עמודת C18 הפוכה שממנה האלרגן משופע לממס אורגני בדומה לפרוטוקולים שפותחו עבור חלבונים מחייבים חומצות שומן14. החלבון המתקבל נתון לאחר מכן לשלב חישול תרמי בהיעדר או נוכחות של חומצות שומן ו/או פוספוליפידים. בנוסף לשחזור Bla g הילידי 1 לקפל, הטמפרטורות גבוהות להגדיל את המסיסות והנגישות של מטעני השומנים, מניב Bla g 1 בצורה Apo או טעון באופן אחיד עם ligand הידרופובי הרצוי. 31 ספקטרום P-NMR של Bla g 1 מטוהר באופן זה אישר את ההסרה המלאה של ליגנדים מאוגדים אנדוגני והחלפה אחידה עם התרכובות הרצויות, בעוד dichroism מעגלי אישר את ההתאוששות המוצלחת של Bla g 1 לקפל. התועלת של שיטה זו מודגשת בעבודה האחרונה שבה נמצאה כריכת מטען כדי לשפר את התרמו היציבות Bla g 1 והתנגדות פרוטאוליטית, שינוי הקינטיקה של דור האפיטופים של תאי T עם השלכות פוטנציאליות על רגישות ואלרגניות9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בלה g 1 שיבוט

  1. השג גן עבור אלרגן ג'וק בלה g 1.0101 (שאריות 34-216), המייצג חזרה אחת של תחום MA. למען הפשטות, Bla g 1 ישמש לאורך כל העבודה כדי לייצג את החזרה הבודדת הזו, ולא את כל תעתיק Bla g 1.0101.
  2. תת-קלף את הגן Bla g 1 לווקטור הרצוי. במחקר זה, הגן המכיל תג גלוטתיון S-transferase N-מסוף (GST) יחד עם וירוס טבק תחריט (TEV) אתר מחשוף פרוטאז הוכנס לתוך וקטור pGEX לביטוי כמתואר קודםלכן 11.
  3. הפוך את וקטור Bla g 1 pGEX לתאי BL21 DE3 E. coli.
    1. הכינו מלאי של 10 ng/μL של הווקטור הרצוי.
    2. שלב 1 μL של 10 ng / μL מלאי DNA עם 50 μL של תאי BL21 DE3 כפי שסופק על ידי היצרן.
    3. דגירה BL21 DE3-DNA תערובת במשך 30 דקות על קרח. מעבירים לאמבט מים של 42 מעלות צלזיוס למשך דקה, ואז מעבירים מיד בחזרה על הקרח לדקה נוספת.
    4. הוסף 200 μL של מדיה LB לתאים דגירה עבור 1 שעה נוספת ב 37 °C (69 °F).
    5. צלחת התאים שעברו המרה על לוחות LB-אגר המכילים 100 מ"ג / ליטר אמפצילין ולגדול ב 37 מעלות צלזיוס לילה.

2. ביטוי ראשוני וטיהור

  1. לחסן 1 L של מדיה LB המכיל 100 מ"ג / L אמפצילין עם מושבה אחת של תאי DE3 BL21 השתנה עם וקטור Bla g 1 כמתואר ב 1.3. לגדול ב 37 °C (60 °F) לילה.
  2. ביום המחרת, תאי הקציר (OD600 ~ 1.5) באמצעות צנטריפוגה ב 6,000 x g במשך 10 דקות ו resuspend ב 2 L של 2x YT מדיה המכילה 100 מ"ג / L אמפצילין. אפשר לתאים לגדול במשך שעה נוספת ב- 37 °C (70 °F) ל- OD600 > 0.6.
  3. לגרום לביטוי חלבון באמצעות תוספת של 0.5 מ"מ IPTG. מעבירים תאים ל-18 מעלות צלזיוס ומדגירה בן לילה.
  4. למחרת, תאי הקציר כמתואר ב 2.2. גלולת התא וכתוצאה מכך ניתן להקפיא ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
  5. גלולה resuspend המתקבל 1 L של תרבות ב 50 מ"ל של מאגר תמוגה (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM NaCl) המכיל 1 לוח מעכב פרוטאז (או שווה ערך) ו 1 μL של גרעין בנזונז.
  6. תאי Lyse המשתמשים בסוניטור בדיקה (500 W, 20 kHz) מוגדרים לעוצמה של 30%-50% למשך 4 דקות עם מחזור עבודה של 50%. שמור את lysate באמבט קרח במהלך sonication
  7. צנטריפוגה lysate ב 45,000 x g במשך 20 דקות. השלך שבר בלתי מסיס (גלולה).
    1. הסר 28 μL של חלבון מסיס. שלב עם 7 μL של מאגר 5x SDS-PAGE ואחסן לניתוח SDS-PAGE. חזור על שלב זה עבור שברי הזרימה, הכביסה וההתעלות של עמודת GST לפני ואחרי הדגירה עם TEV.
  8. החל חלבונים מסיסים (supernatant) על עמודת שף גלוטתיון (~ 10 מ"ל נפח המיטה הכולל) שווה ב PBS pH 7.4.
  9. יש לשטוף חלבונים לא מאוגדים באמצעות 50 מ"ל של PBS.
  10. Elute GST-Bla g 1 באמצעות 50 מ"ל של PBS המכיל גלוטתיון מופחת 10 מ"מ.
  11. דגירה חלבון eluted עם 0.2 kU TEV פרוטאז לילה ב 4 מעלות צלזיוס, או טמפרטורת החדר במשך 6 שעות כדי להסיר תג GST.

3. הסרת שומנים אנדוגניים באמצעות HPLC פאזה הפוכה

  1. לאסוף את Bla g 1 בקע ולרכז אותו ~ 2 מ"ל באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלי עם <10 kDa משקל מולקולרי מנותק.
    1. הוסף דגימת <12 מ"ל לחלק העליון של רכז ולהסתובב ב 5,000 x g במשך 10-15 דקות רוטור דלי נדנדה.
      הערה: נפח לדוגמה ומהירות הסיבוב ישתנו בהתאם למסנן הספציפי ולסוג הרוטור המועסקים. עיין בתיעוד היצרן לפני השימוש.
  2. טען את התרכיז למערכת HPLC בגודל 250 x 10 מ"מ המצוידת בעמודת כרומטוגרפיה הפוכה C18 המשוווית עם 97% חיץ A (מים, 0.1% חומצה טריפלואורואציטית) ו- 3% חיץ B (אצטוניטריל, 0.1% חומצה טריפלואורואצטית).
    הערה: ניתן להשתמש בעמודות קטנות יותר, אך ייתכן שיהיה צריכה לטעון חלבון ולהעלים אותו באמצעות מחזורים מרובים כדי להתאים לקיבולת האיגוד המופחתת. בעת בחירת עמודה להבטיח כי חרוזי שף יש גודל חלקיקים של < 5 מיקרומטר וגודל נקבוביות של >200 Å כדי לאפשר הפרדה יעילה של מולקולות בגודל חלבון
    התראה: חומצה Trifluoroacetic הוא מאכל מאוד ויש לחלק בתוך מכסה המנוע אדים באמצעות PPE המתאים (כלומר, כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשתפי מגן). Acetonitrile הוא גם רעיל בינוני, נדיף, דליק מאוד, יש להשתמש ולחלק בתוך מכסה המנוע אדים באמצעות PPE המתאים (כלומר, כפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשקוף).
  3. Elute Bla g 1 באמצעות הפרוטוקול המוצג בטבלה 1 בקצב זרימה של 1.5-4.0 מ"ל/דקה. לפקח על תהליך elution באמצעות ספיגת פלואורסצנטיות ב 280 ננומטר.
    1. לאסוף בריכה Bla g 1 שברים. Bla g 1 בדרך כלל elutes ב >74% מאגר B, או ~ 34-40 דקות.
      הערה: זמן Elution ישתנה מעט בהתאם לקצב הזרימה או לגודל העמודה. אסוף שברים בהתבסס על A280 לקבלת התוצאות הטובות ביותר.
זמן (מינימום)מאגר A (%)מאגר ב' (%)
0973
10973
253565
55595
65595
70973

טבלה 1: פרוטוקול Elution עבור בלה g 1. טבלה הממחישה את מעבר הצבע של elution המועסקים בבידוד של Bla g 1 באמצעות עמודת HPLC C18.

  1. יש לארוז את הדגימה במבחנות זכוכית, ולא למלא מבחנה יותר ממחצית הדרך (כ-4 מ"ל). מכסים צינורות עם סרט פרפין ומחוררים את הכיסוי בשני חורים כדי לאפשר אוורור.
    1. הכן aliquot נפרד 1 מ"ל (מבחן aliquot). זה ישמש כדי לקבוע את התשואה הצפויה.
  2. להקפיא את הדגימות ולבדוק aliquot על ידי הצבת אותם במקפיא -80 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה, או טבילה בחנקן נוזלי. במקרה של מאוחר יותר, יש לסובב את הצינור ברציפות כדי למנוע שבירה במבחנה עקב הרחבת השלב הנוזלי עם ההקפאה.
  3. יבש את דגימות החלבון המופרדות וכתוצאה מכך באמצעות ליופילייזר. חלבון מיובש עשוי להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים במיכל אטום.

4. שחזור של אפו- ומטען טעון בלה g 1

  1. קבע את התשואה הצפויה של Bla g 1.
    1. resuspend lyophilized, מאולץ (לאחר HPLC) aliquot מבחן ב 5 מ"ל של מאגר refolding, (50 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
    2. מחממים את התערובת באמבט מים (כוס 500 מ"ל עם 250 מ"ל מים ומערבבים בר מעל צלחת חמה) עד 95 מעלות צלזיוס. פתרונות וורטקס לסירוגין ולהדגיר ב 95 °C (69 °F) עבור 0.5-1 שעות.
    3. הסר חום ולאט לאט תן לאמבט המים להתייצב לטמפרטורת החדר (~ 1 שעות). חלבון Annealed ניתן לאחסן בצורה זו לילה ב 4 מעלות צלזיוס במידת הצורך.
    4. להעביר annealed Bla g 1-שומנים תערובת דרך מסנן מזרק 0.22 μM כדי להסיר חומר חלקיקי.
    5. חוצץ להחליף את החלבון מסונן 3x לתוך PBS pH 7.4 באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם 10 kDa ניתוק כפי שנדון ב 3.1 כדי להסיר שאריות חומצות שומן חינם ממס אורגני.
    6. להעריך את ריכוז החלבון באמצעות BCA assay או שיטה מועדפת אחרת כגון ספיגת UV. השתמש באפשרות זו כדי לקבוע את התשואה הצפויה עבור aliquots Bla g 1 הנותרים.
  2. לשקם אפו- או מטען טעון Bla g 1
    1. Resuspend Bla g 1 aliquots במאגר refolding כמתואר ב 4.1.1.
    2. כדי לייצר Apo-Bla g 1, חזור על שלבים 4.1.2–4.1.6 כדי להשיג את התשואה הרצויה.
    3. כדי לטעון Bla g 1 עם חומצות שומן, להכין 20 mM מלאי פתרונות של מטען חומצת שומן הרצוי מתנול או DMSO.  לאחר מכן, דלג לשלב 4.2.5.
    4. כדי לטעון Bla g 1 עם פוספוליפידים, להכין מלאי 10 מ"ג / מ"ל של המטען הרצוי בכלורופורם בתוך מבחנה זכוכית.
      1. לאדות את הכלורופורם כדי להפיק סרט שומנים. הוסף PBS למבחנה כדי לייצר ריכוז פוספוליפיד סופי של 20 מ"מ.
        התראה: כלורופורם מזיק אם הוא בשאיפה או בלע. יש להשתמש במכסה המנוע הכימי או להשתמש במכונת הנשמה אם יש אוורור לקוי. יש להשתמש בכפפות ניטריל, חלוק מעבדה ומשתפי מגן בעת הטיפול. יש להיוועץ ב- MSDS לפני השימוש.
      2. מחזרים את סרט השומנים על ידי חימום מעל טמפרטורת המעבר הפאזה של מטען השומנים ומערבולת עד שהפתרון הופך מעונן. שים לב כי sonication עשוי להידרש כדי resuspend מלא rehydrate כמה מטענים.
      3. אם sonication נדרש, למקם את המבחנה sonicator אמבטיה (100 W, 42 kHz) ו sonicate בעוצמה מקסימלית עד המטען הוא resuspended. לחלופין, סוניקטור בדיקה (המתואר ב 2.6) ניתן להשתמש 10-20% כוח עם מחזור חובה 50%.
        התראה: Sonication משתמשת בגלי קול בתדר גבוה שעלולים לפגוע בשמיעה. השתמש PPE מדכא רעש (אטמי אוזניים או עמימות). במידת האפשר, הנח sonicator בתוך ארון או תא עמעום קול.
    5. הוסף את חומצת השומן הרצויה או מטען פוספוליפיד לייצר עודף טוחן 20x של ליגנדים יחסית Bla g 1 מבוסס על התשואה הצפויה שנקבעה 4.1. הנפח הכולל של ממס אורגני הוסיף בשלב זה לא יעלה על 2%. וורטקס לערבב.
      הערה: 1 L של Bl 21 DE3 תאים בדרך כלל מניב ~ 0.25–0.4 חלבון nmol, המתאים ~ 400 μM ליגנד לכל צינור.
    6. אנאל החלבון כמתואר ב 4.1.

5. אישור הסרת/טעינה של מטען פוספוליפידי באמצעות 31P-NMR

  1. לרכז דגימות של Apo- או מטען טעון Bla g 1 עד > 100 μM באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלי כמתואר ב 3.1.
  2. Rehydrate הפניה פוספוליפיד במאגר PBS לריכוזים הסופיים של 2, 1.5, 1, 0.5, ו 0.25 mM.
  3. לדלל דגימות 1:1 עם מאגר cholate (100 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10% w / v cholate) לנפח כולל של ~ 600 μL.
    הערה: Cholate מועסק בשלב זה כדי לחלץ באופן מלא solubilize שומנים מן החלל ההידרופובי Bla g 1. הדבר מבטיח שהסביבה הכימית המקיפה את קבוצות הראש הפוספוליפידיות עקבית בין דגימות שונות, ומאפשרת הערכה כמותית באמצעות P-NMR 31. השימוש cholate ניתן להחליף כלורופורם / מתנול כמתואר בעבר15.
  4. לרכוש ספקטרום 1D 31P-NMR של דגימות Bla g 1 cholate-solubilized וייחוס סטנדרטים פוספוליפידים באמצעות בדיקה בפס רחב.
    הערה: ספקטרום P-NMR 31שהוצג בעבודה זו הושגו באמצעות ספקטרומטר 600 מגה-הרץ. עם זאת, מחקרים קודמים המשתמשים בטכניקות דומות מצביעים על כך שניתן להשיג רגישות מקובלת בשדות חוזק נמוך כמו 150-200 MHz15.
  5. לעבד את הנתונים המתקבלים באמצעות תוכנהמתאימה 16.
  6. השג עוצמות שיא באמצעות תוכנת צפייה מועדפת של NMR17.
  7. השווה את ספקטרום Bla g 1 31P-NMR לאלה שהושגו עבור דגימות התייחסות פוספוליפיד כדי לאשר הסרת ליגנדים מאוגדים אנדוגני ו / או כריכה של ליגנדים הרצויים בהתבסס על השינויים הכימיים של הפסגות הנראות לעין (או היעדרם).
    1. אשר stoichiometry מחייב מלא על ידי השוואת עוצמת השיא של ספקטרום Bla g 1 לזה של תקני התייחסות פוספוליפיד.

6. אישור Bla g 1 קיפול

  1. הכן 0.5 דגימות μM של Bla g 1 במאגר תקליטורים (100 mM KH2PO4, pH חיץ 7.5). טען 2 מ"ל של המדגם לתוך Cuvette תקליטור 10 מ"מ עם מוט ערבוב מגנטי.
  2. למדוד ספקטרום תקליטורים של Bla g 1 כדי לאשר שחזור של מבנה משני. ודא שמתח Photomultiplier (PMT) אינו חורג מהמלצות היצרן (בדרך כלל 1 kV).
    1. מדוד אות תקליטור מ- 260-200 ננומטר ב- 25 °C (60 °F) עם גובה נתונים של 0.2 ננומטר וקצב סריקה של 20 ננומטר לשעה עם זמן שילוב נתונים של 1 s.
  3. הגדל את הטמפרטורה בתא התקליטור מ- 25 °C (79 °F) °C (70 °F) בקצב של 0 °C (70 °F) / דקה. הפעל מוט ערבוב מגנטי כדי להבטיח שהטמפרטורה אחידה על פני המדגם.
  4. נטר תקליטור במהירות של 222 ננומטר, תוך לקיחת קריאות כל 2 °C (60 °F).
  5. התאם את הנתונים המתקבלים לעקומת בולצמן דו-מצבית כדי לקבוע את טמפרטורת ההיתוך. בשל היציבות הגבוהה של Bla g 1, טמפרטורת ההיתוך (MT25) הוגדרה כטמפרטורה שבה החלבון איבד 25% מהתקליטור הראשוני שלו ב 222 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה, GST-Bla g 1 רקומביננטי היה מבודד בקלות לרמה גבוהה של טוהר (איור 1A),לייצר תשואה של ~ 2-4 מ"ג / ליטר של תרבות התא. דגירה לילה עם פרוטאז TEV ב 4 מעלות צלזיוס מספיק כדי להסיר את תג GST, מניב את המוצר הסופי ב ~ 24 kDa. שים לב כי במקרה זה יש כמות משמעותית של GST-Bla g 1 בשברים זרימה דרך לשטוף, מה שמרמז על קיבולת מחייבת גלוטתיון. השימוש יותר שף או מחזורים מרובים של טעינה מדגם elution יכול לספק תרופה לבעיה זו.

החלת Bla g 1 על עמודת C18 הפוכה מניבה פרופיל ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר בעבודה זו יושם בהצלחה כדי לחקור באופן שיטתי את תכונות איגוד השומנים של Bla g 1. זה חשף מתאם בין מחייב מטען, תרמו יציבות, ועיבוד אנדוזומלי, האחרון שבהם היה בקורלציה עם ירידה בדור של אפיטופ T-cell ידוע עם השלכות פוטנציאליות על אימונוגניות9,18. בנוסף Bla g 1, אלרגנים אחרים כגון Pru p 3 ו Bet v 1 הוכחו לשמור על מטענים אנדוגני שלהם מאוגד כאשר מטוהרים באמצעות זיקה סטנדרטית שיטות כרומטוגרפיה הדרה גודל13,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לד"ר טום קירבי, סקוט גבל וד"ר רוברט לונדון על עזרתם וסיועם לאורך כל העבודה, יחד עם ד"ר בוב פטרוביץ' ולורי אדוארדס על השימוש במכשור שלהם ועל עזרתם ביצירת מבני Bla g 1 המועסקים במחקר זה. אנו מודים לאנדריאה אדמס על הסיוע בספקטרומטריית ההמונים, וד"ר יוג'ין דה-רוז על הסיוע במכשור NMR. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר התוך-רחמי של NIH, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה, Z01-ES102906 (GAM). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיו הרשמיות של המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Bla g 1 גן GenescriptN/aשירות סינתזת גנים מותאם אישית. GenBank הצטרפות ללא שאריות AF072219 34-216
זיקה מטוהרת טבעית Bla g 1 (nBla g 1)ביוטכנולוגיות מקורהN / aהזמנה מותאמת אישית
Agilent 1100 סדרת HPLC מערכתAgilentG1315B, G1311A, G1322Aגלאי UV, משאבה ומסיר גזים
Agilent DD2 600 MHz ספקטרומטרAgilent N/ A
Amicon Ultra-15 יחידת מסנן צנטריפוגליAmiconUFC-1008
AmpicillinFisher ScientificBP1760-5
BenzonaseSigma-AldrichE1014-5KU
פס רחב 5 מ"מ Z-gradient בדיקהVarianN/a
ChemStation for LC (תוכנה)AgilentN/a
cOmplete מיני מעכב פרוטאז קוקטיילRoche11836153001
דיסטארויל פוספטידילכולין (18:0 יח')שומנים קוטביים אוונטי850365C
E. Coli BL21 DE3 תאיםניו אינגלנד BiolabsC2530H
Freezone 4.5 מערכת יבשה בהקפאהLabconco7750000
שרף גלוטתיוןGenescriptL00206
גלוטתיון, מופחתפישר מדעיBP25211
איזופרופיל-&בטא;-D-תיוגלקטופירנוזיד (IPTG)פישר סיינטיפיק34060
ג'סקו  ספקטרופולארימטר CDJascoJ-815
Millex יחידת מסנן מזרקEMD MilliporeSLGS033SS
NMRPipe (תוכנה)Delaglio et al. N/ADelaglio, F. et al. Nmrpipe - מערכת עיבוד ספקטרלית רב-ממדית המבוססת על צינורות יוניקס. ג'יי ביומול. תמ"ג 6, 277– 293 (1995).
NMRViewJ (תוכנה)ג'ונסון ואחרים לא ישיםג'ונסון, ב.א. & Blevins, R. A. NMR View: תוכנת מחשב להדמיה וניתוח של נתוני NMR. ג'יי ביומול. תמ"ג 4, 603– 614 (1994).
חומצה אולאיתSigma-AldrichO1008
Pierce BCA בדיקת חלבוןSigma-AldrichBCA1-1KT
Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC ColumnAgilentמק"ט: A2000250X100
SD-200 משאבת ואקוםVarianVP-195
נתרן כולאט הידראטסיגמא-אולדריץ'C6445
נתרן פלמיטטSigma-AldrichP9767
נתרן סטארטSigma-AldrichS3381
VnmrJ (תוכנה)VarianN/A

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
  2. Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
  3. Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
  4. Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
  5. Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556(2019).
  6. Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
  7. Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
  8. Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
  9. Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294(2019).
  10. Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
  11. Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
  12. Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
  13. Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
  14. Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
  15. Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
  16. Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  17. Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
  18. Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
  19. Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
  20. Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
  21. Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279(2016).
  22. Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
  23. Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
  24. Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
  25. Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
  26. Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
  27. Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
  28. Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
  29. Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
  30. Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
  31. Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
  32. Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
  33. de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027(2020).
  34. Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
  35. Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
  36. Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

HPLCApo Bla g 1NMR 31

מאמרים קשורים