הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל

4.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61791

⸱

2 בנובמבר 2020

 , 
1Department of Biology, Drexel University, 2Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

במאמר זה

סיכום

המטרה של פרוטוקול זה היא ישירות bioprint תאי אפיתל השד כמו כדוריות רב תאיות על רשתות אנדותל שנוצרו מראש כדי ליצור במהירות מודלים 3D השד אנדותל שיתוף תרבות אשר ניתן להשתמש בהם עבור מחקרים הקרנת סמים.

תקציר

Bioprinting מתגלה ככלי מבטיח לפברק מודלים של סרטן אנושי 3D כי טוב יותר לסכם סימני ההיכר הקריטיים של ארכיטקטורת רקמת vivo. בהדפסה ביולוגית של שחול שכבה אחר שכבה, תאים בודדים מובלטים בביו-ינק יחד עם רמזים מרחביים וטמפורליים מורכבים לקידום הרכבה עצמית של רקמות היררכיות. עם זאת, טכניקה זו biofabrication מסתמך על אינטראקציות מורכבות בין תאים, bioinks ורמזים ביוכימיים וביופיזיים. לכן, הרכבה עצמית עשויה להימשך ימים או אפילו שבועות, עשויה לדרוש bioinks ספציפי, ולא תמיד יכול להתרחש כאשר יש יותר מסוג תא אחד מעורב. לכן פיתחנו טכניקה להדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידים אפיתל שד תלת-ממדיים שנוצרו מראש במגוון ביו-לינקים. ספירואידים אפיתל שד 3D מעוצבים מראש קיימו את הכדאיות שלהם ואת הארכיטקטורה המקוטבת לאחר ההדפסה. בנוסף הדפסנו את הכדורואידים בתלת-ממד על רשתות תאי אנדותל של כלי הדם כדי ליצור מודל של תרבות משותפת. לכן, טכניקת ההדפסה הביולוגית החדשה יוצרת במהירות מודל שד אנושי תלת מימדי רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בעלות נמוכה יותר ועם גמישות גבוהה יותר מאשר טכניקות הדפסה ביולוגית מסורתיות. טכניקת ביו-הדפסה רב-תכליתית זו ניתנת להדפסה כדי ליצור מודלים תלת-ממדיים של רקמות אחרות בביו-ינקים נוספים.

מבוא

מודלים של גידולים במבחנה במבחנה הם כלים חיוניים למחקר מכני של צמיחת סרטן וגרורות. עבור סרטן השד בפרט, תאי אפיתל השד בתרבית Matrigel לארגן לתוך ספרואידים מקוטבים הדומים יותר לארכיטקטורה acinus ממארי in vivo1,2,3,4,5,6,7,8. 3D תרבית תאי אפיתל השד משפיע גם על תפקוד התא, עם תרביות 3D מראה הבדלים אפנון קולטן אפידרמיס (EGF)8,9; פונקציית אונקוגן, כולל ErbB210; צמיחה ואפופטוזיס איתות11,12; והתנגדותכימותרפית 13,14. תאי אנדותל כלי דם מגיבים באופן דומה באופן שונה לגירויים סביבתיים בתלת מימד לעומת תרבות דו מימדית מסורתית15,16,17,18. עם זאת, רוב ההבנה של אינטראקציות אנדותל ושד כלי הדם אפיתל מגיע תרבות 2D באמצעות בינוני מותנה או Transwell מוסיף, או מודלים 3D שבו שני סוגי התאים מופרדים פיזית19,20,21,22,23. מודלים אלה של תרבות משותפת מספקים תובנה פיזיולוגית מוגבלת, שכן הן תרבות 3D והן מגע תאים הם קריטיים אנדותל כלי הדם – אינטראקציות תא אפיתל השד24,25,26.

מודלים סרטן 3D כבר מפוברק באמצעות מגוון רחב של טכניקות, כולל היווצרות ספירואיד טיפה תלויה, bioprinting, הרכבה מגנטית, ותרבות בתוך הידרוג'לים או על פיגומים מהונדסים5,27,28,29. לאחרונה, מודלים גידול 3D נוצרו עם סוגי תאים מרובים מסודרים במבנים 3D בהתאמה שלהם. בדוגמה אחת של פלטפורמת גידול על שבב, סרטן, אנדותל, תאים סטרומה היו מעורבבים לתוך מטריצה ולאחר מכן מוזרק לתוך שלושת תאי הרקמה המרכזיים במכשיר polydimethylsiloxane (PDMS). תאי הרקמה היו גובלים בשני ערוצים חוץים שייצגו עורק ונוזל. לאחר 5-7 ימים של תרבות, תאי אנדותל יצרו רשת microvascular ותאי סרטן התפשטו כדי ליצור גידולים קטנים ליד כלי הדם. פלטפורמה זו שימשה אז כדי לסנן סמים ושילובי סמים30. פלטפורמות נוספות לגידול על שבב נוצרו כדי לחקור גרורות וסוגי סרטן עם גירויים מכניים ספציפיים (למשל, זן מכני בריאה)31,32. עם זאת, פלטפורמות אלה בדרך כלל אינן כוללות הן כלי דם וסרטן במבנים 3D בהתאמה שלהם.

Biofabrication מראה הבטחה גדולה בקידום 3D במודלים גידולים במבחנה כלי דם, שכן הוא מאפשר שליטה מרחבית הדוקה על מיקום התא. למרות הצמיחה של bioprinting בעשור האחרון, מחקרים מעטים להתמקד במיוחד על גידולים33,34. בדוגמה אחת, הדפסה תלת מימדית של תאי HeLa בהידרוגל ג'לטין/אלגינט/פיברינוגן שימשה ליצירת מודל סרטן צוואר הרחם במבחנה. תאים סרטניים הודפסו ביולוגית כתאים בודדים ולאחר מכן הורשו ליצור ספרואידים, אשר הראו קצב התפשטות גבוה יותר, ביטוי מטאלופרוטאינאז מטריצה מוגברת, ו chemoresistance גבוה יותר מאשר תאים בתרבות 2D35. במחקרים אלה, כמו רבים אחרים36,37, השעיות תאים מנותקים הודפסו ביולוגית, ולאחר מכן תרביות התא סופקו עם רמזים מכניים וביוכימיים הנדרשים כדי לאפשר לתאים ליצור מבנה 3D. עם זאת, הרכבה עצמית תאית עשויה להימשך ימים או שבועות, עשויה לדרוש רמזים סביבתיים מרחביים וטמפורליים מורכבים, או לא להתרחש כאשר שני סוגי תאים הם תרבית משותפת. לדוגמה, תאי אפיתל השד גרמו למוות תאי בתאי אנדותל בתרבית דו-ממדית, ותאי אפיתל שד מנותקים לא נוצרו כדוריות תלת-ממדיות כאשר הודפסו ביולוגית באלגינאט/ג'לטין הידרוג'ל38. אפיתל שד מנותק או תאים סרטניים יצרו ספרואידים בביוינקים מבוססי אלגינט רק כאשר נלכדו בתבניות PDMS עגולות. במקרים אחרים, spheroids נוצרו באמצעות טיפות מושעה בלוחות באר עגולים מצורף אולטרה נמוך ולאחר מכן מעורבב לתוך bioinks מבוסס אלגינט39,40.

כעת אנו מתארים שיטה חלופית 3D רקמה biomanufacturing בפרוטוקול זה. במקום לזרוע תאים מנותקים ולחכות שתאים אלה ייצרו את המבנים תלת-ממדיים, אנו מתארים כיצד ליצור ולהדפיס ביולוגית ספרואידים של גידולים תלת-ממדיים ברשת צינור כלי דם כדי ליצור מודל תרבות-שיתוף גידולים שניתן להשתמש בו כמעט מיד. ניתן לגדל ספרואידים של גידולים במבחנה או להפיקם מרקמות אנושיות (אורגנואידים). באופן דומה, צינורות כלי דם ניתן לגדל או יכול להיגזר שברים microvascular רקמת שומן. Bioinks יכול לנוע בין אלגינט פעיל ביולוגית כדי Matrigel פעיל מאוד ביולוגית41. מאז מודל זה 3D גידול שיתוף תרבות יכול להיווצר עם מגוון רחב של מבני תאים bioinks, זה יכול לשלב סוגי תאים מרובים, מטריצות חוץ תאיות, ומדרגי כימוקין15,42. בעוד בניסוח הנוכחי שלה, רשתות אנדותל לא ניתן לחדור, איטרציות עתידיות יכול לשלב שיטה זו עם microfluids או על שבב מערכות. הדפסה ביולוגית של ספירואידים אפיתל שד תלת מימדי על רשתות אנדותל מאפשרת ביופבריציה מהירה של מודלים של השד האנושי לבדיקות סמים ורפואה מדויקת מותאמת אישית27.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. צמיחת תאי אפיתל השד ומדיה Assay

  1. MCF10A תאי אפיתל השד
    הערה: קו תאי אפיתל השד המונצח שאינו גידולי נגזר מחולה עם מחלה פיברוציסטית43. תאים אינם מבטאים קולטן אסטרוגן.
    1. כדי להכין 20 מיקרוגרם / מ"ל גורם גדילה אפידרמיס (EGF), להמיס 100 מיקרוגרם של EGF lyophilized ב 500 μL של dH סטרילי2O לעשות 200 מיקרוגרם / מ"ל EGF. הוסף 500 μL של 200 מיקרוגרם / מ"ל EGF לתוך 4.5 מ"ל של סטרילי 0.1% BSA ב dH2O לעשות פתרון EGF 20 מיקרוגרם / מ"ל. חנות מוכנה 20 מיקרוגרם / מ"ל EGF aliquots ב -20 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים.
    2. כדי להכין 500 מיקרוגרם / מ"ל הידרוקורטיזון, לדלל 1 מ"ג של הידרוקורטיזון ב 1 מ"ל של אתנול מוחלט (200 הוכחה). הוסף 1 מ"ל של DMEM F:12 סטרילי לתערובת זו כדי להפוך פתרון 500 מיקרוגרם / מ"ל הידרוקורטיזון מלאי. חנות הידרוקורטיזון מניות aliquots ב -80 °C (60 °F) עד 12 חודשים.
    3. כדי להכין 10 מיקרוגרם / מ"ל רעלן כולרה, להמיס 1 מ"ג של אבקת כולרה רעלן lyophilized ב 1 מ"ל של dH סטרילי2O כדי להפוך 1 מ"ג / מ"ל כולרה רעלן פתרון מלאי. חנות כולרה רעלן aliquots מלאי ב -80 מעלות צלזיוס עד 12 חודשים.
    4. כדי להכין את מדיום הצמיחה, להוסיף 500 μL של EGF (20 מיקרוגרם / מ"ל), 500 μL של הידרוקורטיזון (500 מיקרוגרם / מ"ל), 5 μL של רעלן כולרה (1 מ"ג / מ"ל), 500 μL של אינסולין שור (10 מ"ג / מ"ל), 10 מ"ל של פניצילין ואסטרטומיצין, ו 25 מ"ל של סרום סוס ל 500 מ"ל של DMEM F:12 עבור ריכוז סופי של 20 ng / mL EGF, 500 ng/mL הידרוקורטיזון, 10 ng/mL רעלן כולרה, 10 ng/mL אינסולין שור, 2% v / v פניצילין סטרפטומיצין, ו 5% v / v סרום סוס. ריכוז אנטיביוטי הוגדל ל 2% כדי להסביר את הסטריליות ירד בתהליך ההדפסה הביולוגית; עם זאת, ריכוז אנטיביוטי ניתן להוריד ל 1%.
    5. כדי להכין Assay בינוני, להוסיף 500 μL של הידרוקורטיזון (500 מיקרוגרם / מ"ל), 5 μL של רעלן כולרה (1 מ"ג / מ"ל), 500 μL של אינסולין שור (10 מ"ג / מ"ל), 10 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין, ו 25 מ"ל של סרום סוס ל 500 מ"ל של DMEM F:12 עבור ריכוז סופי של 500 ng / mL הידרוקורטיזון, 10 ng / mL רעלן כולרה, 10 ng / mL אינסולין שור, 2% v / v פניצילין ו סטרפטומיצין, ו 5% v / v סרום סוס.
  2. מד"א-מגה-231
    הערה: משולש שלילי (חסר קולטן אסטרוגן, קולטן פרוגסטרון, קולטן גורם גדילה אפידרמיס 2) קו תא אפיתל סרטן השד נוצר תפליט pleural של חולה נקבה עם אדנוקרצינומה mammary גרורתי44. התאים מייצגים סרטן שד אגרסיבי, פולשני ומובחן בצורה גרועה.
    1. כדי להכין את הצמיחה ואת Assay בינוני, להוסיף 50 מ"ל של סרום שור עוברי, 10 מ"ל של פניצילין וסטרפטומיצין, ו 25 מ"ל של סרום סוס ל 500 מ"ל של DMEM לריכוז סופי 10% v / v סרום שור עוברי, 2% v / v פניצילין ו סטרפטומיצין, ו 5% v / v סרום סוס.

2. תרבות תאי אפיתל השד

  1. זרע 500,000 MCF10A או MDA-MB-231 תאים בצלחת 10 ס"מ (P100) תרבית רקמה עם 10 מ"ל של MCF10A או MDA-MB-231 מדיה צמיחה. תאי MCF10A ומד"א-MB-231 מגיעים ל-90% מפגשים ב-48 שעות.
  2. כדי לעבור תאים אפיתל השד, הראשון לשטוף תאים עם 10 מ"ל של PBS חם.
  3. נתק תאי אפיתל השד על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA למנה. מניחים את המנה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 אינקובטור במשך 20-25 דקות.
  4. הוסף 5 מ"ל של MCF10A או MDA-MB-231 בינוני צמיחה לתאים טריפסיניזציה כדי לנטרל את הנסיון. פיפטה תערובת מדיה סלולרית למעלה ולמטה כדי resuspend תאים לשבור אשכולות תאים.
  5. מוסיפים את השעיית התא לצינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 1,200 x גרם במשך 3 דקות. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 5 מ"ל של MCF10A או MDA-MB-231 צמיחה בינוני.
  6. צלחת 1 מ"ל של השעיית תאים ב 5 חדש 10 ס"מ רקמות תרבית מנות יחד עם MCF10A או MDA-MB-231 צמיחה בינוני. מניחים את הכלים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. התאים יהיו מוכנים למעבר שוב בעוד 2-3 ימים. ניתן לשמור על תאי MCF10A למעבר מספר 35, ולאחר מכן הם מראים שינויים מורפולוגיים. תאי מד"א-MB-231 יכולים להישמר למעבר מספר 24, ולאחר מכן הם מראים שינויים מורפולוגיים.

3. היווצרות ספירואיד אפיתל השד

  1. להקפיא 200 טיפים פיפטה μL במשך 30 דקות לפני תחילת ההסתעפות. שמור על תמיסת מטריצה מופחתת גורמי גדילה (למשל, Matrigel) (10 מ"ג/מ"ל) על הקרח לאורך כל התהליך.
  2. לאט פיפטה 30 μL של פתרון מטריצה קרה כקרח באמצעות קר כקרח 200 טיפים פיפטה μL לתוך כל באר של שקופית 8 באר. התחל מהצדדים וגרור את קצה פיפטה לאורך הפינות, הוספת טיפה סופית למרכז הבאר כדי להבטיח אפילו ציפוי של כל באר. הימנע בועות אוויר במהלך שלב זה כדי להבטיח שכבת פתרון מטריצה אחידה. השתמש טיפים פיפטה חדשה עבור כל באר.
  3. שקופיות תא דגירה ב 37 °C (70 °F), 5% CO2 אינקובטור במשך 15-20 דקות כדי polymerize פתרון המטריצה.
  4. Resuspend תאי MCF10A טריפסין ב MCF10A Assay בינוני ב 200,000 תאים / מ"ל או resuspend תאי מד"א-MB-231 במדיום צמיחה MDA-MB-231 ב 200,000 תאים / מ"ל.
  5. אם אתם משתמשים בתאי MCF10A, הכינו מדיום צמיחה ספירואידי חדש MCF10A על ידי הוספת 5 μL של EGF (20 מיקרוגרם/מ"ל) ו-100 מיקרו-ל' של פתרון מטריצה ל-5 מ"ל של Assay Medium לריכוז סופי של 2% פתרון מטריצה.
  6. הסר את שקופית התא מראש עם תמיסת מטריצה מהחממה. הוסף 50 μL של MCF10A או MDA-MB-231 התא השעיה (10,000 תאים) לכל באר. אם אתם משתמשים בתאי MCF10A, הוסיפו 450 מיקרו-ל' של מדיום צמיחה כדורי MCF10A. אם אתם משתמשים בתאי MDA-MB-231, הוסיפו 450 מיקרו-ל' של MDA-MB-231 Growth Medium עם 2% פתרון מטריצה (9 μL). מקם באופן מיידי את שקופית התא באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
  7. החלף את המדיום כל 44 ימים. בזהירות פיפטה 200 μL של מדיה ישנה החוצה מפינה אחת של כל באר באמצעות קצה פיפטה 200 μL. במהלך תהליך זה, הטה את שקופית התא ב- 45° כדי להבטיח שהספרואידים לא יפריעו. הוסף 200 μL של בינוני צמיחה כדורית MCF10A שהוכן טרי או MDA-MB-231 צמיחה בינוני מעורבב בעבר עם 2% פתרון מטריצה לכל באר בפינה בטיפות כדי להבטיח כי spheroids להישאר מחובר לשכבת המטריצה. רק ~ 50% מהמדיה מוחלפת כך שכל הציטוקינים המיוצרים על ידי הכדורואידים אינם מרוקנים לחלוטין.
    הערה: ספירואידים אפיתל השד MCF10A לקחת עד 8 ימים כדי קיטוב וליצור מרכזים חלולים. ספירואידים אפיתל שד MDA-MB-231 לקחת עד 5 ימים כדי ליצור ואין מרכזים חלולים.

4. היווצרות רשת תאי אנדותל

  1. תרבות תא אנדותל של וריד טבור אנושי (HUVEC)
    1. הוסף את התוכן של ערכת גדילה אנדותל אחת בינונית-2 המכילה פקטורי גדילה של אינסולין, גורם גדילה fibroblast, גורם הגדילה אנדותל כלי הדם, חומצה אסקורבית, גורם גדילה אפידרמיס, הפרין וגנטמיצין-אמפוטריצין B, יחד עם 50 מ"ל של סרום שור עוברי, 5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ו-5 מ"ל של 200 מ"מ גלוטמין עד 500 מ"ל של בזל אנדותל בינוני-2 (EBM-2) ליצירת מדיום צמיחה אנדותל מלא (EGM-2).
    2. זרע 500,000 תאי אנדותל בצלחת תרבית רקמות 10 ס"מ ב 10 מ"ל של EGM-2. מניחים תאים באינקובטור 37 °C (67 °F), 5% CO2 עד שהם מגיעים >80% מפגש (סביב 48 שעות).
    3. לתאי מעבר, לשטוף תאי אנדותל עם 10 מ"ל של PBS חם. נתק HUVEC על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. נטר מקרוב את התאים לפי מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה. התאים מוכנים כאשר הם כדור למעלה אבל להישאר מחוברים לצלחת.
    4. בזהירות לשאוף את טריפסין מתוך המנה. מוסיפים 8 מ"ל של EGM-2 למנה. לשטוף תאים את המנה על ידי pipeting EGM-2 למעלה ולמטה על פני כל משטח המנה.
    5. לחלופין, להוסיף 5 מ"ל של EGM-2 לתאים טריפסיניזציה כדי לנטרל את טריפסין. פיפטה תערובת מדיה סלולרית למעלה ולמטה כדי resuspend תאים לשבור אשכולות תאים. מוסיפים את השעיית התא לצינור חרוט 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 1,200 x גרם במשך 3 דקות. בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend גלולת התא ב 10 מ"ל של EGM-2.
    6. הוסף 1 מ"ל של השעיית תאים ל 9 מ"ל של EGM-2 בצלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. מניחים את הכלים באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. החלף 2/3 של המדיום עם EGM-2 טרי כל יומיים. התאים יהיו מוכנים למעבר בעוד 3-5 ימים. HUVEC יכול להישמר עד קטע 8 שלאחרו הם נכשלים ליצור רשתות.
  2. היווצרות רשת של תאי אנדותל (HUVEC)
  3. להקפיא 200 טיפים פיפטה μL במשך 30 דקות לפני תחילת ההסתעפות. שמור על תמיסת מטריצה מופחתת גורמי גדילה (10 מ"ג/מ"ל) על הקרח לאורך כל התהליך.
  4. לאט פיפטה 30 μL של פתרון מטריצה קרה כקרח באמצעות קר כקרח 200 טיפים פיפטה μL לתוך כל באר של שקופית 8 באר. התחל מהצדדים וגרור את קצה פיפטה לאורך הפינות, הוספת טיפה סופית למרכז הבאר כדי להבטיח אפילו ציפוי של כל באר. הימנע בועות אוויר במהלך שלב זה כדי להבטיח שכבת פתרון מטריצה אחידה. השתמש טיפים פיפטה חדשה עבור כל באר.
  5. שקופיות תא דגירה באינקובטור 37 °C (77 °F), 5% CO2 חממה במשך 15-20 דקות כדי polymerize Matrigel.
    1. טרום כתם צלחת 10 ס"מ של HUVEC עם 10 μL של גשש תא אדום (1:1000) במשך 30 דקות ב 37 °C (70 °F), 5% CO2 חממה.
    2. לשטוף תאי אנדותל עם 10 מ"ל של PBS חם. נתק HUVEC על ידי הוספת 2 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA לצלחת תרבית רקמות 10 ס"מ. מניחים את המנה באינקובטור 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 במשך 5 דקות כדי לנתק את התאים באופן מלא.
    3. מוסיפים 5 מ"ל של EGM-2 למנה כדי לנטרל את טריפסין. העבר את השעיית התא לצינור חרוט 25 מ"ל. צנטריפוגה HUVEC ב 1,200 x g במשך 5 דקות. לשאוף את supernatant ולהשתוב מחדש את גלולת התא ב 5 מ"ל של EBM-2 ללא סרום.
    4. ספירת תאים באמצעות כחול Trypan כדי לקבוע תאים קיימא. צור פתרון של 1 x10 6 תאים/מ"ל.
    5. הוסף 100,000 HUVEC לכל באר עם 200 μL של סרום חינם EBM-2. אם יתווספו תאים נוספים, הם ייצרו מונולייר משטח ולא רשת שפופרת.
    6. דגירה HUVEC ב 37 °C (69 °F), 5% CO2 חממה. לאחר 6 שעות, תמונות HUVEC רשתות על ידי מיקרוסקופיית ניגוד פאזה. הרשתות מוכנות כעת לשיתוף פעולה עם ספירואידים בשד.

5. הדפסה ביולוגית של ספירואידים אפיתל השד על רשתות HUVEC הוקמה מראש

הערה: יש להשתמש במערכת תצהיר ביולוגית עם חרירים כפולים לתהליך ההבריה הביולוגית. במקרה זה, למערכת היו שלוש זרועות תנועה כדי לאפשר שליטה מרחבית בקנה מידה מיקרון של תצהיר חומר, כמו גם שני מנועים מונעי בורג להפקיד bioink מ 10 מזרקים מ"ל. המערכת צריכה להיות פונקציונלית עם מערכת סינון אוויר חלקיקי יעילות גבוהה, כמו גם יכולות עיקור UV כדי לשמור על סביבה סטרילית במהלך ההדפסה הביולוגית. הביופרינט הוא UV מעוקר במשך שעה לפני תהליך ההדפסה.

  1. צור ספירואידים אפיתל השד ורשתות HUVEC כפי שתואר קודם לכן. להעריך את מספר ספירואידים אפיתל השד בכל באר על ידי ספירת ספרואידים בתמונות מיקרוסקופיות ניגוד שלב ייצוגי.
  2. חותכים 0.5 ס"מ מקצה קצה פיפטה 1000 μL. השתמש קצה פיפטה לחתוך בזהירות פיפטה כל spheroids מתוך שקופית תא 8 באר לתוך צינור 50 מ"ל. ספירואידים לקצבה בביוינק שנבחר ב 100 ספרואידים / 100 μL.
    הערה: ריכוזי ספרואידים גבוהים יותר עלולים לגרום לקיבוץ ספרואידים ולמנוע הדמיה של אינטראקציות בין הספרואידים לרשתות האנדותל.
  3. מעבירים את תערובת הספרואידים דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר כדי להסיר כל ספרואידים גדולים או מקובצים באשכולות.
  4. לטעון את spheroids בריכה לתוך מזרק סטרילי 10 מ"ל לכסות אותו עם מחט סטרילית 25-מד. חבר את המזרק למערכת התצהיר הביולוגי.
  5. שאפו את המדיום מרשתות HUVEC בשקופית התאית בעלת 8 הבארות.
  6. Extrude 100 μL של ספירואידים אפיתל השד על 6 בארות של רשתות HUVEC בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה. לשמור על 2 בארות של רשתות HUVEC כפקדים.
  7. הוסף 400 μL של בינוני צמיחה כדורית MCF10A אם באמצעות כדורי MCF10A מודפס על רשתות HUVEC או להוסיף 400 μL MDA-MB-231 צמיחה בינוני מעורבב בעבר עם פתרון מטריצה 2% אם באמצעות MDA-MB-231 כדורי מודפס על רשתות HUVEC. יש להשתמש במדיום הצמיחה הספרואידי המתאים בבארות בקרה של HUVEC.
  8. דגירה תרבויות שותף ב 37 °C (77 °F), 5% CO2 חממה במשך 24 - 96 שעות ללא שינוי מדיה. תרבויות משותפות יישארו בנות קיימא במדיום המקורי עד ארבעה ימים.

6. מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. אימונופלואורסצנטיות והכנת מאגר שטיפת PBS-גליצין
    1. הכן Immunofluorescence (IF) מאגר 10x פתרון מלאי על ידי הוספת 2.5 גרם של נתרן אזיד, 5 גרם של אלבומין סרום שור, 10 מ"ל של טריטון X-100, ו 2.05 מ"ל של Tween-20 ב 500 מ"ל של 10x PBS. כוונן את ה-pH ל-7.4. אחסן את פתרון המלאי עד שנה ב- 4 °C (60 °F) כדי למנוע משקעים.
    2. צור מאגר IF פועל על-ידי דילול 50 מ"ל של מאגר IF 10x ב- 450 מ"ל של מים שעברו דה-יון סטריליים. אחסן את פתרון העבודה בטמפרטורת החדר עד שבוע.
    3. הכן פתרון מלאי מאגר PBS-גליצין 10x על-ידי הוספת 37.5 גרם גליצין ל- 500 מ"ל של 10x PBS. כוונן את ה-pH ל-7.4. אחסן את פתרון המלאי עד 6 חודשים ב- 4 °C (6 °F) כדי למנוע משקעים.
    4. צור פתרון PBS-גליצין עובד על ידי דילול 50 מ"ל של 10x PBS-גליצין מאגר ב 450 מ"ל של מים שעברו דה-יון סטרילי. אחסן את פתרון העבודה ב- 4 °C (60 °F) למשך שבוע.
  2. תווית דגימות מודפסות ביולוגית ותמונה לפי מיקרוסקופיה קונפוקלית
    1. שאפו מדיום מתרבויות תלת-ממדיות בעלות הדפסה ביולוגית ושטוף 3 פעמים עם PBS חם. תקן תרביות תלת-ממדיות מודפסות ביולוגית עם 4% paraformaldehyde למשך שעה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף דגימות 3 פעמים למשך 20 דקות עם 1x PBS-גליצין.
    2. חסום דגימות עם מאגר IF מעורבב עם סרום עזים 10% במשך 90 דקות (בלוק ראשי), ואחריו 40 דקות עם מאגר IF בתוספת 10% סרום עיזים ושבר Fab Affinipure (1:100, בלוק משני).
    3. אם משתמשים בספרואידים MCF10A, יש לסמן דגימות עם נוגדן ראשוני לאונטגרין α6 (1:100) במאגר חסימה משני בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס, ואחריו נוגדן משני Alexa Fluor 488 (1:200) והושט 33342 (1:1000) לשעה אחת בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. קווי התאים MCF10A מבטאים רמות גבוהות של אונטגרין α6, החיוני להצגת קיטוב ספירואידי ומורפולוגיה.
    4. אם משתמשים במד"א-MB-231 spheroids, המבטאים רמות נמוכות של integrin α6, יש לסמן דגימות עם Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) והושט 33342 (1:1000) במאגר חסימה משני למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. פאלודין מאפשר הדמיה של חוטי אקטין כך שניתן להעריך מורפולוגיה אמורפית ופולשנית כדורית.
    5. לשטוף דגימות עם 1X PBS-גליצין 3 פעמים במשך 20 דקות.
    6. הכן דוגמאות להרכבה על-ידי הסרת שקופית התא באמצעות כלי היצרן. הוסף טיפה קטנה של פתרון נגד פשתן לכל באר. מניחים כיסוי 22 מ"מ x 60 מ"מ על כל שקופית תא ולאטום בזהירות את הקצוות עם לק ברור.
    7. דגימות תמונה באמצעות מיקרוסקופ confocal כמו ערימות Z של ~ 10 פרוסות ב 5 צעדים מיקרומטר. אם תרצה, דחוס מישורי Z למישור יחיד באמצעות הפקודה Extended Focus בתוכנת דימות תאים.
    8. כימות הידבקות כדורית לרשתות אנדותל באמצעות Image J. מספר spheroids דבק ניתן לכמת באמצעות תוסף לנתח עם גודל החלקיקים המתאים מעגליות. נרמלו את מספר הספרואידים המצורפים לאזור התמונה.
    9. כדי להבטיח יכולת לשחזור, כימת את מספר הכדורים הדבקים ב- 4 x 4 תמונות אריחים של תרבויות משותפות. אם מספר הכדורים נמוך סטטיסטית מניסויים אחרים, יש לחזור על הניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

תאי אפיתל השד צריך להתארגן עצמית לתוך 3D spheroids לאחר 5-8 ימים של תרבות על פתרון מטריצה במדיום תרבות עם 2% פתרון מטריצה. כדורי אפיתל שאינם גידוליים של שד MCF10A צריכים להופיע עגולים ויש להם מרכז חלול, עם אינגרין α6 מקוטב לקצה החיצוני של הספרואיד(איור 1,inset מראה מרכזים חלולים). תאי אפיתל סרטן השד פולשניים מאוד MDA-MB-231 יוצרים ספרואידים לא סדירים. Spheroids יש להשתמש כאשר הם סביב 100 – 300 מיקרומטר קוטר. כאשר ספרואידים הופכים גדולים מדי להגיע בסמיכות, spheroids יתאחדו יחד כדי ליצור מגהספ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה הוא הראשון מסוגו להדפסה ביולוגית של ספרואידים בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם לתרבות משותפת עם תאי אנדותל גם בארכיטקטורת תלת-ממד שלהם. צעדי פרוטוקול קריטיים כוללים היווצרות ראשונית של ספירואידים אפיתל השד ורשתות HUVEC. יש לנקוט משנה זהירות בהאכלת ספירואידים אפיתל, שכן הם מופרעים בקלות מתמיסת המטריצה. באופן דומה, ספירואידים אפיתל השד חייב להיות מטופלים בזהירות כאשר הם pipetted את הפתרון מטריצה מעורבב לתוך הרשתות. רשתות HUVEC לא צריך להיות מצופה גבוה מדי של צפיפות או עזב במשך יותר מ 16 שעות, כפי שהם יהוו monolayer או ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

מחקר זה מומן על ידי NIH 1R01HL140239-01 ל- AMC. ברצוננו להודות למרכז להדמיית תאים באוניברסיטת דרקסל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
37° חממת C, 5% CO2 ו-95% לחותSanyoMCO-20AICדגירה של תאים
מדפסת ביו תלת מימדיתבהתאמה אישיתללאמשמש להדפסה ביולוגית
של שקופיות תא 8 בארותVWR, Radnor, PA53106-306לזריעת ספרואידים
מחט 25 מדסיגמה, סנט לואיס, MOZ192406-100EAמחט מזרק הדפסה ביולוגית
אתנול מוחלט (200 הוכחה)סיגמאסנט לואיס, MOE7023-500MLקונסטרוקציה מחדש של רכיבי מדיה
Affinipure F(ab′),2 שברי עז נגד עכבר IgGJackson ImmunoResearch, ווסט גרוב, פנסילבניה115006020בלוק משני - אימונופלואורסצנציה
Alexa Fluor 488 (1:200)Thermo Fisher, Waltham, MAA-11006Seconday נוגדנים-אינסולין בקר אימונופלואורסצנטי
סיגמא, סנט לואיס, מיזוריI-035-0.5MLMCF10A תוסף מדיה
אלבומין סרום בקר (BSA)סיגמה, סנט לואיס, MOA2153-500Gחומר חוסם -אימונופלואורסצנציה
פלקון 70 ומיקרו; m מסננת תאיםקורנינג, קורנינג, ניו יורק352350הסר ספרואידים גדולים או מקובצים
CellTracker™ צבע אדום CMTPXתרמו פישר, וולת'אם, MAC34552צביעה מוקדמת לצינורות HUVEC
צנטריפוגה קומפקטיתהרמל- Labnet, אדיסון, NJZ206Aלצנטריפוגות תאים
כולרה טוקסיןסיגמה, סנט לואיס, MOC8052-.5MGMCF10A תוסף מדיה
צינורות חרוטיים 15 מ"לVWR, Radnor, PA62406-200איסוף והשעיה מחדש של תאים
הרוזנת II-FL מונה תאיםתרמו פישר, וולת'אם, MAAMQAF1000תאי ספירת
פיפטות זכוכית (10 מ"ל)VWR, Radnor, PA76184-746השעיית תאים
DMEM F:12תרמו פישר, וולת'אם, MA11320033MCF10A מדיה בסיסית
DMEM 1XVWR, Radnor, PA10-014-CVMDA-MB-231 מדיה בזאלית
אנדותל בזאלי בינוני-2 (EBM-2)לונזה, דורהאם, NCCC-3156HUVEC מדיה בזאלית
מדיום צמיחה אנדותל-2 (EGM-2)Lonza, Durham, NCCC-3162מלווה בערכת כדורים (המכילה גורמי גדילה)
Alexa Fluor™ 488 PhalloidinThermo Fisher, Waltham, MAתיוג MDA-MB-231 ספרואידים
סרום בקר עובריCytiva, Logan, UTSH30071.03תוסף מדיה HUVEC/MDA-MB-231
סרום עיזיםתרמו פישר, וולת'אם, MA16210064רכיב תיוג אימונופלואורסצנטי
גליציןסיגמה, סנט לואיס, MOG8898-500Gרכיב חיץ אימונופלואורסצנטי
Hoescht 33342Thermo Fisher, Waltham, MA62249כתמי גרעין אימונופלואורסצנטי
סרום סוסיםתרמו פישר, וולת'אם, MA16050130MCF10A תוסף מדיה
הידרוקורטיזוןסיגמא, סנט לואיס, MOH0888-5GMCF10A תוסף מדיה
תאי אנדותל וריד טבורי אנושי (HUVECs)יישומי תאים, סן דייגו, קליפורניה200-05fקווי תאי אנדותל
אינטגרין ואלפא; 6Millipore, Billerica, MAMAB1378רכיב תיוג ספרואיד אימונופלואורסצנטי מבחן
מת חיThermo Fisher, Waltham, MAL3224בדיקת כתם תאים חיים ומתים לכדאיות התא
LSM 700 מיקרוסקופ קונפוקליZeiss, Thornwood, NYמשמש להדמיית תאים
מטריג'ל - גורם גדילה מופחת 10 מ"ג/מ"לVWR, Radnor, PA354230ספרואיד היווצרות
תאי MCF10AATCCCRL-10317קו תאי שד
תאי MDA-MB-231 תאיATCCHTB-26קו תאי שד
ParaformaldehydeSigma, סנט לואיס, MO158127-500Gקיבוע תאים
פניצילין וסטרפטומיציןתרמו פישר, וולת'אם, MA15140122MCF10A / MDA-MB-231 / HUVEC תוסף מדיה
פוספט חוצץ מלח 1X (PBS)תרמו פישר, וולת'אם, MA7001106מאגר שטיפה לתאים לפני טריפסיניזציה
מאגר פוספט מלח 10Xתרמו פישר, וולת'אם, MAAM9625רכיב חיץ אימונופלואורסצנטי
להאריך זהב אנטי-דהייהתרמו פישר, וולת'אם, MAP36934מדיום אימונופלואורסצנטי רכובנט
גורם גדילה אפידרמלי אנושי רקומביננטי, EGFפפרוטק, רוקי היל, ניו ג'רזיAF-100-15MCF10A / רכיב מדיית בדיקה
נתרן אזידסיגמה, סנט לואיס, MOS2002-25Gרכיב חיץ אימונופלואורסצנטי
מזרק סטרילי (10 מ"ל)VWR, Radnor, PA75846-757תהליך הדפסה ביולוגית
צלחת תרבית רקמות (10 ס"מ)VWR, Radnor, PA25382-166תרבית תאים חד שכבתית
Triton X-100Sigma, סנט לואיס, מיזוריT8787-250MLרכיב חיץ אימונופלואורסצנטי
טריפן כחול 0.4%תרמו פישר, וולת'אם, MAתוסף נגד תאים
15250061 טריפסין-EDTA 0.05%תרמו פישר, וולת'אם, MAניתוק תאים 25300054
טווין -20תרמו פישר, וולת'אם, MA85113רכיב חיץ אימונופלואורסצנטי
גורם גדילה אנדותל כלי דם (VEGF165)Peprotech, Rocky Hill, NJ100-20תוסף צינור HUVEC
Volocity 6.3 תוכנת הדמיית תאיםPerkinElmer, Hopkinton, MAZ מדחס מחסנית

מקורות

  1. Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
  2. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  3. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  4. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  5. Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19(2016).
  6. Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
  7. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  8. Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
  9. Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
  10. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
  11. Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
  14. Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
  15. Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
  16. Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
  17. Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
  18. Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
  19. Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
  20. Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
  21. Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66(2011).
  22. Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
  23. Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
  24. Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671(2015).
  25. Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
  26. Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
  27. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
  28. Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66(2018).
  29. Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
  30. Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589(2016).
  31. Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
  32. Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
  33. Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
  34. Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
  35. Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001(2014).
  36. Zhang, Y. S., et al. Bioprinting the Cancer Microenvironment. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1710-1721 (2016).
  37. Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101(2015).
  38. Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
  39. Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
  40. Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
  41. Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003(2019).
  42. Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
  43. Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285(2015).
  44. Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
  45. Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
  46. Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145(2018).
  47. Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HUVEC
הדפסה ביולוגית ישירה של ספירואידי שד רב-תאיים תלת-תאיים ברשתות אנדותל
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.