מאמר שיטה

RNA קטן שאינו מקודד תורם לאלימות בחלבוני הממברנה החיצונית בסלמונלה אנטריטידיס

DOI:

10.3791/61808

⸱

27 בינואר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, 2Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 3Department of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Agricultural Vocational College

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת רקומבינציה בתיווך λ-Red שימשה ליצירת מוטציית מחיקה של מיקרופון RNA קטן שאינו מקודד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רנ"א קטן שאינו מקודד (sRNA) הוא גורם חדש המווסת ביטוי גנים ברמה שלאחר השעתוק. סוג של sRNA MicC, הידוע ב- Escherichia coli ו- Salmonella Typhimurium, יכול לדכא את הביטוי של חלבוני הממברנה החיצונית. כדי להמשיך לחקור את פונקציית הבקרה של micC בסלמונלה אנטריטידיס, שיבטנו את הגן micC בזן Salmonella Enteritidis 50336, ולאחר מכן בנינו את המוטציה 50336Δ micC על ידי מערכת הרקומבינציה λ Red והמוטנט המשלים 50336Δ micC/p micC הנושא פלסמיד רקומביננטי pBR322 המבטא micC. תוצאות qRT-PCR הראו כי התמלול של ompD ב- 50336Δ micC היה גבוה פי 1.3 מזה שבזן מסוג פראי, בעוד שהתעתוק של ompA ו- ompC ב- 50336Δ micC היה גבוה פי 2.2 ופי 3 מאלה בזן מסוג פראי. אלה הצביעו על כך ש-micC מדחיק את הביטוי של ompA ו-ompC. במחקר הבא, הפתוגני של 50336ΔmicC זוהה הן על ידי הדבקת עכברים בני 6 שבועות Balb/c והן על ידי תרנגולות בנות יום אחד. התוצאות הראו כי LD 50 של זן פראי מסוג 50336, המוטנטים 50336Δ micC ו-50336Δ micC/pmicC עבור עכברי Balb/c בני 6 שבועות היו 12.59 CFU, 5.01 CFU, ו-19.95 CFU, בהתאמה. LD50 של זנים עבור תרנגולות בנות יום אחד היו 1.13 x 109 CFU, 1.55 x 108 CFU, ו 2.54 x 108 CFU, בהתאמה. הוא הצביע על כך שמחיקת micC הגבירה את האלימות של S. Enteritidis בעכברים ותרנגולות על ידי ויסות ביטוי של חלבונים הממברנה החיצונית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA קטן שאינו מקודד (sRNAs) הוא באורך 40-400 נוקלאוטידים, אשר בדרך כלל אינם מקודדים חלבונים אך יכולים להיות משועתקים באופן עצמאי בכרומוזומי חיידקים 1,2,3. רוב ה-sRNAs מקודדים באזורים הבין-גניים (IGRs) בין אזורי קידוד גנים ומקיימים אינטראקציה עם mRNA מטרה באמצעות פעולות זיווג בסיסים, ומווסתים את ביטוי גני המטרה ברמהשלאחר השעתוק 4,5. הם ממלאים תפקידי ויסות חשובים במטבוליזם של חומרים, סינתזת חלבון בקרום החיצוני, חישת מניין וביטוי גנים אלימים5.

MicC הוא תעתיק RNA קטן של 109 נוקלאוטידים הקיים ב- Escherichia coli ו- Salmonella enterica serovar Typhimurium, אשר יכול לווסת ביטוי חלבון ממברנה חיצוני מרובים כגון OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 ו- Omp36 6,7,8,9. MicC מווסת את הביטוי של OmpC על ידי עיכוב קשירת ריבוזום למוביל mRNA ompC במבחנה והוא דורש מלווה RNA Hfq עבור תפקודו ב- Escherichia coli6. בסלמונלה טיפימוריום, MicC משתיק mRNA ompD באמצעות דופלקס RNA של ≤12 bp בתוך רצף הקידוד (קודונים 23-26) ולאחר מכן מערער את היציבות של mRNA אנדונוקלאוליטי7. תהליך ויסות זה נעזר בחלבון מלווה Hfq10. ה-OmpC הוא חלבון מצוי בשפע בקרום החיצוני שנחשב חשוב בסביבות שבהן ריכוזי החומרים המזינים והרעלנים היו גבוהים, כמו במעי6. פורין OmpD הוא חלבון הממברנה החיצונית הנפוץ ביותר בסלמונלה טיפימוריום ומייצג כ -1% מכלל חלבון התא11. OmpD מעורב בהיצמדות למקרופאגים אנושיים ולתאי אפיתל מעיים12. MicC גם מדחיק את הביטוי של נקבוביות OmpC ו- OmpD. הוא חשב כי MicC עשוי לווסת אלימות. כדי לחקור גני מטרה חדשים המווסתים על ידי MicC ולחקור את פונקציית ויסות האלימות של micC, שיבטנו את הגן micC בזן Salmonella Enteritidis (SE) 50336, ולאחר מכן בנינו את המוטציה 50336ΔmicC ואת המוטציה המשלימה 50336ΔmicC/p micC. גני מטרה חדשים נבדקו על ידי qRT-PCR. האלימות של 50336ΔmicC זוהתה על ידי עכברים וזיהומי תרנגולות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים נערכו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המועצה הלאומית למחקר. ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת יאנגג'ואו אישרה את כל הניסויים והנהלים המיושמים על בעלי החיים (SYXK2016-0020).

1. זני חיידקים, פלסמידים ותנאי תרבית

  1. השתמשו בחיידקים ובפלסמידים המפורטים בטבלה 1.
  2. תרבית חיידקים במרק LB או על צלחות אגר LB ב 37 ° C, בנוכחות 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין (Amp) במידת הצורך.
  3. זני תרבית המכילים פלסמידים רגישים לטמפרטורה משמשים למחיקת בנייה מוטנטית ב -30 מעלות צלזיוס.

2. שיבוט גן micC של S. זן אנטריטידיס 50336

  1. מבוסס על רצף במעלה ובמורד הזרם של הגן micC של S. זן Typhimurium SL1344, תכנון פריימרים vmicC-F ו- vmicC-R כדי להגביר מקטע המכיל גן micC על ידי PCR באמצעות SE50336 DNA גנומי כתבנית.
  2. ערבבו 5 μL של 10x מאגר תגובת PCR, 2 μL של תערובת dNTP (2.5 mM), 1 μL של פריימרים vmicC-F ו-vmicC-R, בהתאמה, 5 μL של תבנית, 1 μL של Taq DNA polymerase ו-35 μL של ddH2O יחד עבור PCR.
  3. השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים:קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך 30 שניות, 53°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 25 מחזורים, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות.
  4. רצף את מוצר ה- PCR כדי לקבל את רצף הגן micC .

3. בניית מוטציית מחיקת micC

הערה: המוטציה השלילית micC של זן Salmonella Enteritidis 50336 נבנתה באמצעות רקומבינציה בתיווך λ-Red כפי שתואר קודם13,14. הפריימרים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 2.

  1. להגביר קלטת chloramphenicol המכילה קטעי הומולוגיה של הגן micC .
    1. תכננו פריימרים micC-F ו-micC-R כדי להגביר את קלטת הכלוראמפניקול (Cm) מפלסמיד pKD3, כולל הרחבות הומולוגיה של 50 bp מה-5' וה-3' של הגן micC .
    2. חלץ את פלסמיד pKD3 כתבנית PCR.
    3. ערבבו 5 μL של 10x מאגר תגובת PCR, 2 μL של תערובת dNTP (2.5 mM), 1 μL של פריימרים micC-F ו-micC-R, בהתאמה, 5 μL של תבנית, 1 μL של Taq DNA פולימראז ו-35 μL של ddH2O יחד כתערובת תגובת PCR
    4. הגבירו את קלטת ה-Cm עם תנאי תגובת ה-PCR הבאים: קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך דקה אחת, 52°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 10 מחזורים; 94°C למשך דקה אחת, 63°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 25°, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות.
    5. לזהות את הגודל של מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose. לטהר ולשחזר מוצר PCR עם ערכת התאוששות ג'ל DNA, ולקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטר.
      אזהרה: PCR חייב להתבצע פעמיים. מוצר ה-PCR הראשון דולל ביחס של 1:200 ושימש כתבנית ל-PCR המשני, כדי למנוע את ההפרעה של רקומבינציה נוספת על ידי פלסמיד pKD3.
  2. בניית זן רקומביננטי1 רחוב 50336ΔmicC::cat
    1. יש לערבב 100 μL של תאים מתאימים SE50336 עם 5 μL של פלסמיד pKD46 באופן אחיד ולדגור על קרח למשך 30 דקות. חממו בחום את התערובת הנ"ל ב-42°C למשך 90 שניות, והעבירו במהירות את התערובת לקרח למשך 2 דקות כדי להפוך את פלסמיד pKD46 ל-SE50336. מסך מושבות חיוביות על ידי תרבית לילה ב 30 ° C על צלחת עמידה אמפר (50 מיקרוגרם / מ"ל).
    2. הוסף 30 mM L-arabinose לתרבית נוזלית SE50336/pKD46, וגרם לביטוי רקומבינאז על ידי תרבית ניעור של 30 ° C למשך שעה אחת. לאחר מכן הכינו תאים מתאימים.
    3. יש לערבב 100 ננוגרם של מוצר PCR מטוהר (שלב 3.1) ו-40 מיקרוליטר של תאים מתאימים SE50336/pKD46 לתוך הלם חשמלי (לדוגמה, Bio-Rad). לבצע טרנספורמציה הלם חשמלי עם הפרמטרים של מתח 1.8 kV, דופק 25 μF והתנגדות 200 Ω.
    4. לאחר אלקטרוטרנספורמציה, להעביר את התערובת 1 מ"ל של מדיום SOC תרבית רועד ב 150 סל"ד ו 30 ° C במשך 1 שעה. לאחר מכן מרחו את התערובת על צלחת LB עמידה ס"מ (34 מיקרוגרם/מ"ל) ותרבית בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה כדי לסנן מושבה חיובית.
    5. תרבית את המושבה החיובית לעיל ב 42 ° C במשך 2 שעות. סנן את המושבה הרגישה ל- Amp (50 מיקרוגרם / מ"ל) אך עמידה לס"מ (34 מיקרוגרם / מ"ל) ב 37 ° C למשך הלילה כדי לקבל את הזן הרקומביננטי הראשון ללא pKD46.
  3. זהה את הזן הרקומביננטי הראשון 50336ΔmicC::Cat.
    1. חלץ 50336ΔmicC::DNA גנומי של חתול כתבנית PCR. השתמש באותם רכיבי תגובת PCR כמו בשלב 2.1. בצע את תגובת ה- PCR באותם תנאים כמו בשלב 2.1.
    2. לזהות את הגודל של מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה ג'ל agarose ולרצף את מוצר PCR.
  4. בניית מוטנט מחיקה 50336ΔmicC.
    1. אלקטרופורטאט 100 ng של פלסמיד pCP20 לתוך 40 μL של 50336ΔmicC:: תאים מוכשרים Cat עם הפרמטרים של מתח 1.8 kV, פולס 25 μF והתנגדות 200 Ω, שנאים חיוביים המסך על צלחת עמידה Amp (50 מיקרוגרם / מ"ל) ו ס"מ (34 מיקרוגרם / מ"ל) צלחת עמידה ב 30 ° C.
    2. מעבירים מעל טרנספורמטורים חיוביים ל-LB לא עמיד ומגדלים אותם למשך הלילה ב-42°C, ולאחר מכן מבודדים מושבות בודדות על צלחת LB ב-37°C. בחר את המושבה הרגישה הן ל- Amp והן ל- Cm. מוטציה זו היא מוטציית מחיקת micC SE50336Δ micC.
    3. אמת 50336ΔmicC באמצעות PCR.
      1. חלץ 50336ΔmicC DNA גנומי כתבנית PCR. ערבבו 5 μLof 10x PCR reaction buffer, 2 μL של dNTP Blend (2.5 mM), 1 μL של primer vmicC-F, 1 μL של primer vmicC-R, 5 μL של תבנית, 1 μL של Taq DNA polymerase ו-35 μL של ddH2O יחד עבור PCR.
      2. השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים:קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך 30 שניות, 53°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 25 מחזורים, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות.

4. בניית זן משלים של micC

  1. עיצוב פריימרים pBR-micC-F ו-pBR-micC-R עם אתרי הגבלה NheI ו-SalI.
    1. הגבירו גן micC באורך מלא עם רצפי אגפים באמצעות תערובת תגובת PCR המכילה 5 μL של DNA גנומי SE50336 כתבנית, פריימרים 1 μL של pBR-micC-F ו-1 μL של pBR-micC-R כפריימרים, 5 μLof 10x מאגר תגובת PCR, 2 μL של תערובת dNTP (2.5 mM), 2 μL של תערובת dNTP (2.5 mM) ו-35 μL של ddH2O.
    2. השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים: קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך 30 שניות, 52°C למשך 50 שניות, 72°C למשך דקה אחת למשך 25 מחזורים, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות. לטהר ולשחזר מוצר PCR.
  2. יש לעכל מוצר PCR ופלסמיד pBR322 בהתאמה באמצעות אנזים הגבלה NheI ו-SalI, ולקשור אותם באמצעות ליגאז T4 ב-16°C למשך הלילה כדי לקבל את הפלסמיד pBR322-micC.
  3. הפוך את pBR322-micC לתאים המוסמכים SE50336ΔmicC, וסנן טרנספורמנט חיובי כדי לקבל את הזן המשלים SE50336ΔmicC/pmicC. לחלץ פלסמיד pBR322-micC מזן משלים ולאמת אותו על ידי הגבלת עיכול אנזים וריצוף.

5. בידוד RNA ו-PCR כמותי בזמן אמת

  1. תרבית SE50336, 50336ΔmicC ו-50336ΔmicC/pmicC ב-LB בינוני לילה ב-24°C עם טיפוח טלטול של 180 סל"ד ל-OD600 של 2.0. איסוף תרבית חיידקים באמצעות צנטריפוגה במהירות 13000 סל"ד למשך 2 דקות.
  2. חלץ RNA כולל באמצעות מגיב TRIzol. לדגור 50 μL של RNA מבודד עם 2 μL של DNaseI ו 6 μL של חיץ 10x ב 37 ° C במשך 30 דקות כדי להסיר DNA. קביעת כמות RNA על ידי פיפטציה של 1 μL של דגימת RNA למיקרו-ספקטרופוטומטר.
  3. סינתזה של cDNA
    1. השתמש ב-1 מיקרוגרם של סך כל הרנ"א לסינתזה של cDNA ב-20 מיקרוליטר של מערכת תגובת שעתוק לאחור (4 μL של 5x buffer, 1 μL של תערובת אנזימי RT, 1 μL של תערובת פריימר RT, 10 μL של RNA כולל ו-4 μL של ddH2O). יש לדגור מעל מערכת התגובה ב-37°C למשך 15 דקות ולאחר מכן ב-85°C למשך 5 שניות.
  4. תכנון פריימרים המבוססים על רצף גני המטרה ompA, ompC ו-ompD. בצע שעתוק לאחור-PCR באמצעות ערכת מגיב RT. רכיבי תגובת ה-PCR מכילים 2.5 μLof 10x PCR reaction buffer, 1 μL של תערובת dNTP (2.5 mM), 1 μL של פריימרים של גן מטרה (ompA, ompC או ompD), 2.5 μL של תבנית, 0.5 μL של Taq DNA polymerase ו-17.5 μL של ddH2O.
    1. השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים:קדם-דנטורציה ב-94°C למשך 4 דקות; 94°C למשך 30 שניות, 60°C למשך דקה אחת, 72°C למשך דקה אחת למשך 25 מחזורים, והארכה ב-72°C למשך 10 דקות.
  5. בצע PCR בזמן אמת באמצעות ערכת RT-PCR ירוקה של SYBR במכשיר RT-PCT בטריפליקטים.
    1. השתמש ברכיבי תגובת ה-PCR הבאים: 10 μL של 2x SYBR buffer, 0.4 μLof פריימר קדמי ופריימר הפוך בהתאמה, 0.4 μL של RoxDye II, 2 μLof cDNA ו-6.8 μL של RNase free H2O.
    2. השתמש בתנאי תגובת ה-PCR הבאים:קדם-דנטורציה ב-95°C למשך דקה אחת למשך מחזור אחד; 95°C למשך 5 שניות, 60°C למשך 34 שניות למשך 40 מחזורים.
    3. לנרמל את כל הנתונים לגן הייחוס האנדוגני gyrA. השתמש בשיטת 2-Δ ΔCT לכימות נתונים15.

6. מבחני אלימות

  1. תרבית SE50336, 50336ΔmicC ו- 50336ΔmicC/pmicC בשלב נייח בינוני עד מוקדם של LB (OD600 של 2-3) ב- 24 ° C, קציר באמצעות צנטריפוגה, ומדולל ל- CFU mL-1 מתאים ב- PBS סטרילי.
  2. עבור זיהומים בעכברים, יש לדלל את הזנים בתרבית ל-10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL ו-103 CFU/200 μL מתלים הדרגתיים. קבוצות הדבקה של חמישה עכברי Balb/c בני 6-8 שבועות לכל זן בזריקה תת עורית. הזריקו לקבוצת הביקורת 200 מיקרוליטר של מי מלח פיזיולוגיים.
  3. עבור זיהומי עוף, יש לדלל מעל שלושה זנים ל-107 CFU/200 μL, 108 CFU/200 μL ו-109 CFU/200 μL reuspensions הדרגתיים. קבוצות הדבקה של עשרים תרנגולות בנות יום לכל זן בזריקה תת עורית.
  4. עקוב אחר סימני מחלה ומוות של חיות ניסוי מדי יום. חשב את LD50 (מינון קטלני חציוני) 14 d לאחר ההדבקה כפי שתואר קודם16. עבד את הנתונים באמצעות תוכנה לניתוח נתונים.
  5. בקבוצות זיהום, אספו את הלב, הכבד, הטחול, הריאות והכליות של אפרוחים שזה עתה מתו. שוקלים 0.5 גרם מהרקמות הנ"ל בנפרד וטוחנים אותם בפעולה סטרילית. לדלל דגימות טחינה בהדרגה, להפיץ אותם על צלחת LB תרבית במשך 8-10 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. רשום את כמות זני הסלמונלה המאוכלסים ברקמות האפרוחים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניית המוטציה 50336Δ micC וזן משלים 50336Δ micC /p micC
תוצאת שיבוט הגן micC הצביעה על כך שגן זה מורכב מ- 109 bp המראים 100% זהות עם זו של S. טיפימוריום. בהתבסס על נתוני הרצף, מוטנט המחיקה 50336ΔmicC והמוטנט המשלים 50336ΔmicC/pmicC נבנו בהצלחה. בפירוט, תוצאות הריצוף הראו כי קסטת התנגדות של 1.1 קילובייט ס"מ הוגברה ושימשה לבניית רקו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ס. Enteritidis הוא פתוגן תוך-תאי חשוב שיכול להדביק תרנגולות צעירות ומייצר תסמינים מדלקת מעיים ועד זיהום מערכתי ומוות17,18. בנוסף, S. Enteritidis גורם לזיהומים סמויים בתרנגולות בוגרות ונשאים כרוניים מזהמים מוצרי עופות, וכתוצאה מכך זיהומים המועברים במזון בבני אדם19. המנגנון הפתוגני של S. Enteritidis נשאר לחקור עוד יותר. עד כה, כמה sRNA כגון IsrJ, SroA ו- IsrM נמצאו כמשפיעים על אלימות סלמונלה

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית הסינית למדע (מס '31972651 ו -31101826), קרן המדע להשכלה גבוהה ג'יאנגסו (No.14KJB230002), מעבדת מפתח המדינה לביוטכנולוגיה וטרינרית (No.SKLVBF201509), מענק קרן מדעי הטבע של יאנגז'ו (No.YZ2014019), פרויקט הממומן על ידי פיתוח התוכנית האקדמית המועדפת של מוסדות להשכלה גבוהה בג'יאנגסו (PAPD).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
דקסטרוזסנגון ביוטקA610219להכנת מרק
ערכת טיהור DNATIANGENDP214לטיהור DNA
Ex TaqTaKaRaRR01APCR
KH2PO4Sinopharm מגיב כימי10017608להכנת מרק
K2HPO4Sinopharm מגיב כימי20032116להכנת מרק
L-ArabinoseSangon BiotechA610071λ-רקומבינציה
אדומה ערכת מיני פלסמידTIANGENDP106מיצוי פלסמיד
NaClSinopharm מגיב כימי10019308להכנת מרק
(NH4)2SO4Sinopharm10002917להכנת מרק
PrimeScriptRRT ערכת ריאגנטים עם מחק gDNA TaKaRaRR047qRT-PCR
SYBRR Premix Ex Taq IITaKaRaRR820qRT-PCR
T4 DNA LigaseNEBM0202קשירה
TRIzol בידוד RNA15596018 Invitrogen
TryptoneOxoidLP0042להכנת מרק
תמצית שמריםOxoidLP0021להכנת מרק
צנטריפוגהEppendorf5418צנטריפוגה
מכשיר אלקטרופורזהBio-Rad164-5050Electrophoresis
  מערכת אלקטרופורציהBio-Rad165-2100לטרנספורמציה חיידקית
ספקטרופוטומטרBioTekEpochזיהוי ספיגה
מערכת PCR בזמן אמתApplied Biosystems7500 מערכתqRT-PCR

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504(2020).
  2. Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
  3. Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
  4. Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
  5. Waters, L. S., Storz, G. Regulatory RNAs in bacteria. Cell. 136 (4), 615-628 (2009).
  6. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
  7. Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
  8. Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33(2017).
  9. Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
  10. Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
  11. Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
  12. Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
  13. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  14. Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
  15. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  16. Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
  17. Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736(1999).
  18. Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
  19. De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
  20. Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
  21. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477(2009).
  22. Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120(2011).
  23. Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
  24. Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
  25. Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
  26. Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
  27. Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
  28. Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
  29. Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
  30. Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
  31. Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
  32. Papenfort, K., Vogel, J. Regulatory RNA in bacterial pathogens. Cell Host & Microbe. 8 (1), 116-127 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MicC RNAGene DeletionLambda Red RecombinationqRT PCR AnalysisLD50 AssayChloramphenicol CassetteElectroporation TransformationVirulence Enhancement

מאמרים קשורים