מאמר שיטה

ביטוי הטרולוגי וניתוח פונקציונלי של קולטני ריח Aedes aegypti לריחות אנושיים בביציות Xenopus

DOI:

10.3791/61813

⸱

8 ביוני 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, 2Departments of Biochemistry & Biophysics, and Cellular & Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מוצג פרוטוקול המאפיין פונקציונלית ORs של יתושים בתגובה לריחות אנושיים באמצעות מערכת ביטוי ביציות Xenopus יחד עם מהדק מתח של שתי אלקטרודות, המספק טכניקה חדשה רבת עוצמה לחקר התגובות של יתושים ORs לחשיפה לריחות אנושיים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היתוש Aedes aegypti (Linnaeus), וקטור של מחלות אנושיות חשובות רבות כולל קדחת צהובה, קדחת דנגי וקדחת זיקה, מראה העדפה חזקה לפונדקאים אנושיים על פני בעלי חיים אחרים בעלי דם חם לארוחות דם. רמזי ריח ממלאים תפקיד קריטי עבור יתושים כשהם חוקרים את סביבתם ומחפשים מארח אנושי כדי להשיג ארוחות דם, ובכך מעבירים מחלות אנושיות. ידוע כי קולטני ריח (OR) המתבטאים בנוירונים חושי הריח אחראים לאינטראקציה של וקטורים של יתושים עם ריחות אנושיים. כדי לקבל תובנות מעמיקות יותר על פיזיולוגיית הריח של Ae. aegypti ולחקור את האינטראקציות שלהם עם בני אדם ברמה המולקולרית, השתמשנו בפרוטוקול אופטימלי של ביטוי הטרולוגי של ביציות Xenopus כדי לנתח פונקציונלית קולטני ריח Ae. aegypti בתגובה לריחות אנושיים. שלושה ניסויים לדוגמה מוצגים: 1) שיבוט וסינתזה של cRNAs של ORs וקולטן משותף לקולטן ריח (Orco) מ-Ae. aegypti antennae בן ארבעה עד שישה ימים; 2) מיקרו-הזרקה וביטוי של ORs ו-Orco בביציות Xenopus ; ו-3) הקלטת זרם של תא שלם מביציות Xenopus המבטאות יתושים ORs/Orco עם מהדק מתח של שתי אלקטרודות. נהלים אופטימליים אלה מספקים דרך חדשה לחוקרים לחקור קליטת ריח אנושי ביתושי Aedes ולחשוף את המנגנונים הבסיסיים השולטים בפעילות חיפוש הפונדקאי שלהם ברמה המולקולרית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יתוש הקדחת הצהובה Ae. aegypti יכול להעביר מחלות קטלניות רבות כולל קדחת צהובה, קדחת דנגי וקדחת זיקה, ולגרום למצוקה עצומה ואובדן חיים. יתושים משתמשים ברמזים מרובים כגון CO2, ריח עור וחום גוף כדי לאתר את המארחים שלהם1. בהתחשב בכך שגם בני אדם וגם בעלי חיים אחרים בעלי דם חם מייצרים CO2 ויש להם טמפרטורות גוף דומות, נראה סביר שנקבות Ae. aegypti מסתמכות בעיקר על ריח העור להבחנה של המארח2. עם זאת, זה יוצר תמונה מורכבת, כאשר מחקר מוקדם אחד בודד יותר מ-300 תרכובות מפליטות עור אנושי3. בדיקות התנהגותיות נוספות הצביעו על כך שמספר תרכובות אלה מעוררות תגובות התנהגותיות ב-Ae. aegypti 4,5,6,7, אך כיצד בדיוק התרכובות הללו מזוהות על ידי היתוש נותר לא ידוע במידה רבה. מחקר שנערך לאחרונה על ידי קבוצתנו זיהה מספר ריחות אנושיים שעשויים להיות מעורבים בפעילות חיפוש פונדקאי של Ae. aegypti, אם כי תפקידם עדיין לא אושר על ידי מבחנים התנהגותיים נוספים8. כיצד מפוענחים ריחות אנושיים חיוניים אלה במערכת החישה ההיקפית של Ae. aegypti טרם נקבע.

חרקים מזהים ריחות דרך הרגישות הכימו-חושית על נספחי הריח שלהם. בתוך כל אחת מהסנסילות, קולטני ריח שונים, כולל קולטני ריח (ORs), קולטנים יונוטרופיים (IRs) וקולטני טעם (GRs), באים לידי ביטוי על הממברנה של נוירונים חושי ריח9. חדרי ניתוח אלה אחראים לחישת ריחות רבים בהם נתקלים חרקים, במיוחד הריחות הקשורים למזון, פונדקאים ושותפים להזדווגות 10,11,12,13. מחקר קודם שהתמקד בביטול התפקוד של ORs באנופלס גמביה באמצעות מערכת הביטוי Xenopus יחד עם מהדק מתח של שתי אלקטרודות מצא כי Anopheles ORs מכוונים במיוחד לארומטיות שהן המרכיבים העיקריים בפליטות אנושיות14. מחקר גנום שנערך לאחרונה זיהה עד 117 גנים של OR ב-Ae. aegypti15. כתוצאה מכך, דרך לטפל באופן שיטתי בתפקודים של חדרי הניתוח הללו בתגובה לריחות חשובים מבחינה ביולוגית או אקולוגית כגון ריחות אנושיים או גירויים של ביוץ תספק מידע שימושי למי שמבקש להבין עוד יותר את האקולוגיה הכימית או הנוירואתולוגיה של Ae. aegypti.

טכניקת מהדק מתח שתי אלקטרודות (TEVC) פותחה במקור כדי לבחון את תפקודן של תעלות יונים ממברנות באמצע שנות ה-9016,17. מאז, נעשה שימוש ב-TEVC כדי לחקור ORs ממספר מיני חרקים שונים 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. בדיקה פונקציונלית זו של ORs תרמה באופן משמעותי למענה על שאלות אקולוגיות חשובות בחרקים, כולל: 1) כיצד חרקים מאתרים מקורות מזון? 2) כיצד הם נמשכים על ידי פרומוני המין הנדיפים שמשחררים בני זוגם להזדווגות? 3) כיצד הם מוצאים אתר הטלה מושלם לצאצאיהם? ו-4) האם יש תרכובות כלשהן, שמקורן בצמחים או סינתטיות, שיכולות להגן ביעילות על בני אדם מפני חרקים נושכים? תשובות לשאלות אלה חיוניות לשליטה בגורמי מחלות חשובים כמו יתושים.

מספר גישות אחרות, כולל אלה המבוססות על קו תאי הכליה העובריים האנושיים 293 (HEK293), מערכת הנוירונים הריקים של דרוזופילה, נוקלאז אצבע אבץ, נוקלאז אפקטור דמוי מפעיל שעתוק ומערכת עריכת הגנים CRISPR/Cas9, שימשו גם במחקרים פונקציונליים של OR 12,20,35,36,37. עם זאת, כל הטכניקות הללו דורשות מיומנויות של ביולוג מולקולרי מנוסה וכוללות מספר גורמים שעלולים לבלבל. ביטוי TEVC/ביציות מסוגל למדוד ישירות זרמי קולטנים מעוררי ריח ומוליכות יונים ויש לו יתרון נוסף של זמן ההתקנה המהיר הנדרש לביטוי קולטנים מ-cRNA. לכן במחקר זה, השתמשנו ב-TEVC כדי לבחון את התגובות של Ae. aegypti OR55 (AaegOR55) כנגד מספר ריחות בעלי רלוונטיות ביולוגית פוטנציאלית, וחשפנו כי ביציות המתבטאות ב-AaegOR55•AaegOrco הראו תגובה תלוית מינון לריח האנושי בנזלדהיד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול להליך זה, הטיפול והשימוש בחיות מעבדה, מאושר ומפוקח (הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אובורן: פרוטוקול מאושר # 2016-2987).

הערה: סינתזת גנים מותאמת אישית היא אלטרנטיבה בת קיימא לשיבוט עבור גנים של יתושים OR.

1. אוסף נספחי יתושים וריח (אנטנות).

  1. שמור על יתושי Ae. aegypti (שהושג מד"ר ג'יימס בקנל, USDA, ARS, היחידה לחקר יתושים וזבובים) בטמפרטורה של 25 ± 2 מעלות צלזיוס ותקופת צילום של 12: 12 (L:D) שעה (אורות דולקים 8 בבוקר).
  2. הרדמה ~800 יתושים נקבות בנות 4-6 ימים ללא הזנת דם באמצעות CO2. חותכים את אנטנות היתושים (רקמות הריח) במיקרוסקופ (40x) בעזרת מספריים ואוספים בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל השמור על קרח יבש.
    הערה: ניתן לאחסן את האנטנות שנאספו במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או להשתמש בהן באופן מיידי.

2. OR שיבוט מאנטנות של Ae. aegypti

  1. חלץ את סך ה-RNA מהאנטנות באמצעות ערכת RNA כוללת זמינה מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. עכל את סך ה-RNA באמצעות הערכה המסחרית נטולת ה-DNA על מנת להסיר DNase ויונים אחרים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  3. לסנתז cDNA מ-1.5 מיקרוגרם של RNA נטול DNA באמצעות מערכת סינתזה ראשונה של Oligo d(T)20-primed SuperScript IV13,30.
  4. תכנון פריימרים PCR לגני ה-OR בהתאם לרצפים הזמינים ב-VectorBase (https://www.vectorbase.org/) ולדרישות המיוחדות של אתר חיתוך האנזים. הוסף רצף קוזאק (GCCACC), אשר יוזם תרגום ברוב האורגניזמים האיקריוטיים, בין אתר החיתוך לקודון ההתחלה בכל פריימר קדימה30.
  5. שיבוט הרצפים המקודדים של הגנים OR על ידי PCR באמצעות פריימרים ספציפיים לגן המכילים אתרי אנדונוקלאז הגבלה ורצף Kozak בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  6. זיהוי מוצרי PCR באמצעות ג'ל אגרוז 1% וטהר באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרית בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  7. בצע בניית פלסמיד רקומביננטי באמצעות שיבוט של מוצרי PCR לווקטור pT7Ts לאחר העיכול על ידי אנזימי הגבלה בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  8. אמת את הפלסמידים הרקומביננטיים על ידי ריצוף Sanger ואשר באמצעות מסד הנתונים VectorBase.

3. סינתזת cRNA

  1. ליניאריזציה של הפלסמידים הבנויים עם אנזימי הגבלה ספציפיים.
    הערה: DNA פלסמיד חייב להיות ליניארי עם אנזים הגבלה במורד הזרם של הגן שיש לתמלל.
  2. השתמש בפלסמידים הליניאריים כדי לסנתז cRNAs עם ערכת T7 מסחרית בעקבות תיאור קודם13,30.
  3. מערבבים מראש cRNA של OR ו-Orco (1:1) בצינור צנטריפוגה ומכניסים את ה-cRNA המעורב לנפח של 2 מיקרוליטר (250 ננוגרם/מיקרוליטר לכל אחד) עבור כל צינור PCR. אחסן את ה-cRNA המצוטט ב-80 מעלות צלזיוס לפני השימוש.

4. אוסף ביציות קסנופוס

הערה: הנוהל עוקב אחר ההוראות של שניידר ואחרים.38.

  1. להרדים Xenopus laevis למשך 20-30 דקות ב-1 ליטר של מים מטוהרים במיוחד עם 1 גרם של מלח אתיל m-aminobenzoate methanesulfonate (איור 1A). צבט את אחת מאצבעות הצפרדע בעזרת האצבעות; אם אין תגובה, הצפרדע מורדמת מספיק ומוכנה לניתוח. העבירו את הצפרדע המורדמת על מצע הקרח.
  2. הניתוח
    1. שפשפו את אזור הגחון של הצפרדע בתמיסת פובידון-יוד של 10% ונגבו את התמיסה בכדורי צמר גפן נקיים. חזור על שלב זה פעמיים.
    2. בצע חתך קטן בבטן (10-15 מ"מ, איור 1B) עם אזמל חד פעמי. חודר לעור, לשכבת שריר הפאשיה בנפרד. החתך נמצא בחלק התחתון של הבטן, לרוחב קו האמצע.
      הערה: אין לפגוע באיברים פנימיים.
    3. אחוז בחלקים של אונות השחלות בעזרת מלקחיים ומשוך החוצה בעדינות. הרם את השחלה וחתך אותה בגובה דופן הגוף בעזרת מספריים. חזור על הפעולה מספר פעמים עד לקבלת מספיק חומרים שחלתיים (~200 ביציות, איור 1C). העבירו את החומרים השחלתיים למאגר כביסה (96 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl2•6H2O, 5 מ"מ מלח נתרן HEPES, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, pH 7.6).
    4. סגור את פצעי הניתוח (הן השרירים והן העור) עם תפרים נספגים שבדרך כלל מתפרקים ונושרים באופן טבעי תוך 10-14 ימים.
    5. לאחר כל ניתוח, הניחו את הצפרדע ב-1 ליטר של תמיסת התאוששות (המכילה 3.4 גרם מלח שימורים וכבישה ו-2 גרם מלח ים מיידי מהאוקיינוס) עד שהיא מתעוררת ואז החזירו אותה למתקן הצפרדעים.
      הערה: ניתן לבצע עד 4 ניתוחים בכל צפרדע. מרווח הפעולה של כל צפרדע צריך להיות יותר מחודשיים.
  3. עיכול אנזימטי ותרבית ביציות
    1. הפרד את הביציות (~200 ביצים, איור 1C) לחתיכות קטנות.
    2. העבירו את כל הביציות לתמיסת עיכול, כולל 10 מ"ל של מאגר כביסה (סעיף 4.2.3) ו-2 מ"ג/מ"ל קולגנאז B למשך 40-60 דקות בטמפרטורת הסביבה על מנת להסיר שכבות תאים זקיקים. לבחון את הדגימות במיקרוסקופ כדי לקבוע אם 80% מהביציות נפטרו במלואן; אם לא, בדוק כל 10 דקות עד שרוב הביציות מוכנות.
    3. שטפו את הביציות עם תמיסת רינגר 1x (96 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl2·6H2O, 5 מ"מ מלח נתרן HEPES, pH 7.6), מאגר כביסה (סעיף 4.2.3), תמיסת מלח בארת 'שונה (78 מ"מ NaCl, 1 מ"מ KCl, 0.33 מ"מ Ca(NO3)2·4H2O, 0.41 מ"מ CaCl2·2H2O, 0.82 מ"מ MgSO4·7H2O, 2.4 מ"מ NaHCO3, 10 מ"מ מלח נתרן HEPES, 1.8 מ"מ נתרן פירובט, 10 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין, 10 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין, pH 7.6) ברצף (5 פעמים לכל מאגר, תוך שימוש ב-10 מ"ל בכל פעם). שטיפת הביציות באופן נרחב עם חוצצים להסרת ביציות לא בשלות ובאיכות ירודה.
    4. קציר ביציות בשלב V-VI לפי הסיווג של דומונט. העבירו ביציות בריאות / באיכות טובה בשלב V-VI עם חלוקה ברורה של לבן/כהה וללא נזק ברור מבחינה ויזואלית (איור 1D) לתוך צלחת פטרי בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ המכילה מי מלח של בארת' מותאמים (סעיף 4.3.3). השליכו את הביציות באיכות גרועה (איור 1E). שמור על ביציות מעוכלות בתאי גידול חרקים בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס למשך כ-24 שעות לפני הזרקת מיקרו.

5. מיקרו-הזרקת cRNA וביטוי של קולטני ריח (ORs) וקולטני OR (Orco) בביציות Xenopus

  1. הכניסו מטריצת מתכת לצלחת פטרי בגודל 100 מ"מ על 15 מ"מ, והוסיפו את מי המלח של בארת' (סעיף 4.3.3) עד שהמטריצה שקועה. העבירו ביציות על המטריצה, והשליכו את הביציות שאינן עומדות בגודל. סדרו את הביציות עם הקטבים הצמחיים בצד העליון (איור 1F).
  2. משוך נימי זכוכית טריים (1.0 מ"מ OD x 0.5 מ"מ ID, אורך = 100 מ"מ) עבור כל דגימה באמצעות מושך מיקרו-צינור (חום = 525, משיכה = 50, מהירות = 50, זמן = 250) והשחיז עם שיפוע מיקרופיפטה בזווית של 25°. התקן את צינור הנימים על מזרק הננו-ליטר.
  3. לפני ההזרקה, הוציאו צינור אחד של cRNAs מעורבבים מראש של OR ו-Orco (סעיף 3.3) מהמקפיא והניחו אותו על קרח עד להמסה מלאה. מלאו את צינור הנימים בתערובת OR/Orco על ידי לחיצה על כפתור המילוי של מזרק ננו-ליטר.
  4. הזרקו 10 ננוגרם (5ng OR + 5ng Orco; ~20 nL) של ה-cRNA המעורבב מראש עבור כל ביצית עם מזרק ננו-ליטר בתחנה נטולת RNAse. (איור 1F).
    הערה: לפני ההזרקה, אנו לוחצים על כפתור EMPTY כדי לפרוק מעט תערובת כדי להבטיח שצינור הנימים אינו חסום. המתנה של כ-5 שניות כדי לאפשר ל-cRNAs להיכנס לביצית לחלוטין.
  5. לאחר ההזרקה, יש לאחסן את הביציות על צלחת תרבית תאים סטרילית עם 24 בארות עם מי מלח מותאמים של בארת' בטמפרטורה של 18 מעלות צלזיוס למשך 3-7 ימים לפני רישום התא השלם.

6. הקלטת זרם של תא שלם באמצעות מערכת מהדק מתח עם שתי אלקטרודות (איור 2)

  1. לפני הקלטת מהדק מתח עם שתי אלקטרודות, ממיסים את תרכובות הריח הבודדות בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי לקבל סדרה של תמיסות מלאי (100 מיקרוגרם/מיקרוליטר). יש לדלל את תמיסות המלאי הללו עם מאגר ND96 1x (91 מ"מ NaCl, 2 מ"מ KCl, 1.8 מ"מ CaCl2·2H2O, 2 מ"מ MgCl2·6H2O, 5 מ"מ מלח נתרן HEPES, pH 7.6) פי 1000 כדי לקבל סט של פתרונות עבודה (0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר).
  2. ודא שכל מה שנמצא על שולחן בידוד הרטט TMC, כולל מגן המתכת, המיקרוסקופ, מקור האור ומשאבת הפסולת, מקורקע בקפידה כדי להפחית את השפעת הרעש החשמלי החיצוני על הקלטת האותות של כל התא.
  3. הכן מיקרו-אלקטרודות על ידי משיכת נימי זכוכית (1.20 מ"מ OD x 0.94 מ"מ ID, אורך = 750 מ"מ) באמצעות מושך מיקרו-צינור (חום = 525, משיכה = 50, מהירות = 50, זמן = 250). מלאו את הנימים ב-3 M KCl. כלרו את חוטי Ag/AgCl למשך 2-5 דקות באקונומיקה כלור של 10% עד שהם הופכים לצבע אפור כהה (יש לכלור חוטי Ag/AgCl אפורים חיוורים).
  4. הפעל את המכונה על ידי הפעלת ה-Oocyte Clamp ו-Digidata Digitizer (איור 3A). פתח את התוכנה (למשל, Clampex 10.3) ולחץ על כפתור ההקלטה . הפעל את המתג עבור מאגר 1x ND96 (סעיף 6.1) ואת המשאבה עבור מאגר הפסולת.
  5. ערכו בדיקה מקדימה על ידי הכנסת מיקרואלקטרודות למאגר הזורם ולאחר מכן לחיצה על כפתור בדיקת האלקטרודות Vm ועל כפתור בדיקת האלקטרודות Ve כדי לבדוק את ההתנגדות של המיקרואלקטרודות. Vm צריך להיות < 40 mV ו- Ve צריך להיות < 40 μA. כבה את זרימת המאגר 1x ND96 (סעיף 6.1) ואת משאבת הפסולת לאחר הבדיקה המוקדמת.
  6. הניחו כל ביצית בתא הזלוף (איור 2) מלא במאגר ND96 1x (סעיף 6.1) ומקמו בעדינות את הביציות כשהקטבים הצמחיים פונים כלפי מעלה על ידי זחל הזכוכית. הכניסו את האלקטרודות לאט לתוך הביצית (איור 3B). התאם את הפרמטר Vm ל-0 ולאחר מכן את הפרמטר Ve ל-0. שנה את ה-Clamp כפתור מ-OFF ל-FAST. כוונן את לחצן הרווח ל-~ -80 mV.
  7. בדוק את הערך של Ve, שאמור להיות קבוע. אם לא, יש דליפה לפחות באחת משתי המיקרואלקטרודות. אם זה קורה, החלף את כל הרכיבים הפגומים בנימים חדשים.
  8. רשום זרמים של תא שלם מהביציות המוזרקות עם מהדק ביצית בפוטנציאל החזקה של ~-80 mV (איור 2).
  9. בצע איסוף וניתוח נתונים.
    1. המשך את הזרימה של מאגר 1x ND96 (סעיף 6.1) והפעל את משאבת הפסולת.
    2. יישום תמיסת ריח באמצעות מערכת הזילוף: כבה את מאגר ה-1x ND96 (סעיף 6.1) והזרם את תמיסת הריח למשך 10 שניות. לאחר מכן רשום את ערך השיא. כדי לקבל את תגובת ה-OR לריח הבדיקה, הפחיתו את ערך הבסיס מערך השיא.
    3. עצור את זרימת תמיסת הריח ועבור למאגר 1x ND96 (סעיף 6.1). שטפו את הביצית באמצעות המאגר עד שהעקבות הנוכחיים יתאוששו מגירוי הריח הקודם. לאחר מכן הביצית מוכנה לגירוי על ידי תמיסת ריח אחרת. באופן כללי, ניתן להשתמש בביצית אחת כדי לזהות 20-30 גירויים כימיים.
      הערה: בעת בדיקת התגובה התלויה בריכוז, תמיד יש ליישם תחילה את הריכוז הנמוך ביותר לפני המעבר לריכוזים הגבוהים יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות טכניקת הקלטת סנסילום יחיד (SSR), איתרנו לאחרונה ריחות אנושיים הנחשבים חשובים להתנהגות חיפוש מארח של Ae. aegypti 8. עם זאת, המנגנון המולקולרי המניע את תהליך חישת הריחות האנושיים במערכת החישה ההיקפית של Ae. aegypti נותר לא ידוע. ORs ממלאים תפקיד חשוב בזיהוי ליגנד ריח ברוב החרקים 10,11,12. כדי לבצע את תפקידם, כל חדר ניתוח צריך להתבטא במשותף עם Orco כדי ליצור תעלות יונים מגודרות ליגנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TEVC היא טכניקה קלאסית שנמצאת בשימוש נרחב לבחינת תפקודם של קולטני ממברנה. למרות שכבר פורסם פרוטוקול מפורט43 שחולק דמיון ניכר עם הנוהל המוצג כאן, השיטה המוצעת כאן מציגה כמה שינויים חשובים. לדוגמה, כאן, ה-cRNA של OR ו-Orco מעורבב מראש ומכוסה בדגימות בנפח קטן מיד לאחר הסינתזה ומאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש במקום לערבב אותם בנפרד על הפרפילם מיד לפני ההזרקה43. יתר על כן, לאחר קצירת הביציות, אנו בוחרים להשתמש בתפרים נספגים כדי לסגור את הפצע ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרויקט זה נתמך על ידי פרס ממענקי Multistate/Hatch של תחנת הניסויים החקלאיים של אלבמה (AAES) ALA08-045, ALA015-1-10026 ו-ALA015-1-16009 ל-N.L.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחת תרבית תאים 24 בארותCytoOneCC7682-7524משמשת לתרבית ביציות
צפרדע טפרים אפריקאיתNascoLM00535משמשת לקצירת ביציות Xenopus
אלקטרודת תיל Ag / AgClWarner Instruments64-1282משמשת למיקרואלקטרודות
Clampex 10.3AxonNAמשמש להקלטת אותות
Clampfit 10.3Axon Instruments Inc.נ.א.משמש לניתוח נתונים
קולגנאז BSigma11088815001משמש לעיכול ביציות
Digidata DigitizerAxon CNSDigidata 1440Aמשמש לרכישת נתונים
E.Z.N.A. ערכת מיני DNA פלסמידאומגהD6942-01משמש להכנת פלסמיד
Ethyl-M-aminobenzoate methanesulfonate מלחSigma886-86-2משמש להרדמת צפרדעים
זכוכית נימיFHC30-30-1משמש למיקרו-הזרקת
זכוכית נימיWarner Instruments64-0801משמש להכנת מיקרואלקטרודות
GyroMini Nutating MixerLabnetS0500משמש לעיכול ביציות
תאי גידול חרקיםCaron Productsדגם 6025משמש לדגירה של ביציות
Leica מיקרוסקופ LeicaS6 Dמשמש לחיתוך אנטנות יתושים
מקור אורSchottA20500מתן מקורות אור לתצפית
מעמד מגנטיNarishigeGJ-1משמש להחזקת אלקטרודת
הייחוס MicromanipulatorLeica115378משמש לתנועה קלה של
חולץ מיקרו-צינורסאטרדגם P-97משמש למשיכת נימים
Micropipette bevelerSutterדגם BV-10משמש לחידוד נימים
mMESSAGE mMACHINE ערכת T7InvitrogenAM1344משמש לסינתזה של cRNA
Nanoject II מזרק ננוליטר אוטומטיDrummond3-000-204משמש למיקרו-הזרקה
Oligo d(T) 20-primed SuperScript IV מערכת סינתזה של גדיל ראשוןInvitrogen18091050 משמש עבור סינתזה cDNA
מיקרוסקופ אולימפוסאולימפוסSZ61משמש להזרקת מיקרו
זריקה אחת TOP10 תאי E. coli מוכשרים כימיתInvitrogenC404003משמש לטרנספורמציה
מגבר מהדק ביציתWarner Instrumentsדגם OC-725Cמשמש להקלטת TEVC
ערכת מיצוי ג'ל מהירה QIAquickQiagen28704משמש לג'ל
טיהור טבלת בידוד רטטTMC TMC63-500משמש לבידוד הרטט מהציוד
ערכת TURBO ללא DNAInvitrogenAM1907משמש להסרת DNase ויונים אחרים ב-RNA
אלקטרודה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cardé, R. T. Multi-cue integration: how female mosquitoes locate a human host. Current Biology. 25 (18), 793-795 (2015).
  2. McBride, C. S., et al. Evolution of mosquito preference for humans linked to an odorant receptor. Nature. 515 (7526), 222-227 (2014).
  3. Bernier, U. R., Kline, D. L., Barnard, D. R., Schreck, C. E., Yost, R. A. Analysis of human skin emanations by gas chromatography/mass spectrometry. 2. Identification of volatile compounds that are candidate attractants for the yellow fever mosquito (Aedes aegypti). Analytical Chemistry. 72 (4), 747-756 (2000).
  4. Bernier, U. R., Kline, D. L., Schreck, C. E., Yost, R. A., Barnard, D. R. Chemical analysis of human skin emanations: comparison of volatiles from humans that differ in attraction of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 18 (3), 186-195 (2002).
  5. Bernier, U. R., et al. Synergistic attraction of Aedes aegypti (L.) to binary blends of L-lactic acid and acetone, dichloromethane, or dimethyl disulfide. Journal of Medical Entomology. 40 (5), 653-656 (2003).
  6. Bernier, U. R., Kline, D. L., Allan, S. A., Barnard, D. R. Laboratory studies of Aedes aegypti attraction to ketones, sulfides, and primary chloroalkanes tested alone and in combination with L-lactic acid. Journal of the American Mosquito Control Association. 31 (1), 63-70 (2015).
  7. Okumu, F. O., et al. Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans. PloS one. 5 (1), 8951(2010).
  8. Chen, Z., Liu, F., Liu, N. Human odour coding in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 9 (1), 1-12 (2019).
  9. Hansson, B. S., Stensmyr, M. C. Evolution of insect olfaction. Neuron. 72 (5), 698-711 (2011).
  10. Nakagawa, T., Sakurai, T., Nishioka, T., Touhara, K. Insect sex-pheromone signals mediated by specific combinations of olfactory receptors. Science. 307 (5715), 1638-1642 (2005).
  11. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  12. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7285), 66-71 (2010).
  13. Liu, F., Xiong, C., Liu, N. Chemoreception to aggregation pheromones in the common bed bug, Cimex lectularius. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 82, 62-73 (2017).
  14. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  15. Matthews, B. J., et al. Improved reference genome of Aedes aegypti informs arbovirus vector control. Nature. 563 (7732), 501-507 (2018).
  16. Costa, A. C., Patrick, J. W., Dani, J. A. Improved technique for studying ion channels expressed in Xenopus oocytes, including fast superfusion. Biophysical Journal. 67 (1), 395-401 (1994).
  17. Schreibmayer, W., Lester, H. A., Dascal, N. Voltage clamping of Xenopus laevis oocytes utilizing agarose-cushion electrodes. Pflügers Archiv. 426 (5), 453-458 (1994).
  18. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  19. Ditzen, M., Pellegrino, M., Vosshall, L. B. Insect odorant receptors are molecular targets of the insect repellent DEET. Science. 319 (5871), 1838-1842 (2008).
  20. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  21. Xia, Y., et al. The molecular and cellular basis of olfactory-driven behavior in Anopheles gambiae larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (17), 6433-6438 (2008).
  22. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Characterization of an enantioselective odorant receptor in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS One. 4 (9), 7032(2009).
  23. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Insect repellents: modulators of mosquito odorant receptor activity. PLoS One. 5 (8), 12138(2010).
  24. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Odorant receptor modulation: ternary paradigm for mode of action of insect repellents. Neuropharmacology. 62 (5-6), 2086-2095 (2012).
  25. Hughes, D. T., Pelletier, J., Luetje, C. W., Leal, W. S. Odorant receptor from the southern house mosquito narrowly tuned to the oviposition attractant skatole. Journal of Chemical Ecology. 36 (8), 797-800 (2010).
  26. Pelletier, J., Hughes, D. T., Luetje, C. W., Leal, W. S. An odorant receptor from the southern house mosquito Culex pipiens quinquefasciatus sensitive to oviposition attractants. PloS one. 5 (4), 10090(2010).
  27. Bohbot, J. D., et al. Multiple activities of insect repellents on odorant receptors in mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 25 (4), 436-444 (2011).
  28. Bohbot, J. D., et al. Conservation of indole responsive odorant receptors in mosquitoes reveals an ancient olfactory trait. Chemical Senses. 36 (2), 149-160 (2011).
  29. Leal, W. S., Choo, Y. M., Xu, P., da Silva, C. S., Ueira-Vieira, C. Differential expression of olfactory genes in the southern house mosquito and insights into unique odorant receptor gene isoforms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (46), 18704-18709 (2013).
  30. Liu, F., Chen, Z., Liu, N. Molecular basis of olfactory chemoreception in the common bed bug, Cimex lectularius. Scientific Reports. 7, 45531(2017).
  31. Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
  32. Ruel, D. M., Yakir, E., Bohbot, J. D. Supersensitive odorant receptor underscores pleiotropic roles of indoles in mosquito ecology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 533(2019).
  33. Xu, P., Choo, Y. M., De La Rosa, A., Leal, W. S. Mosquito odorant receptor for DEET and methyl jasmonate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16592-16597 (2014).
  34. Xu, P., et al. Odorant inhibition in mosquito olfaction. iScience. 19, 25-38 (2019).
  35. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  36. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  37. Koutroumpa, F. A., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6, 29620(2016).
  38. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method. Journal of Visualized Experiments. (45), e1864(2010).
  39. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  40. Jones, P. L., Pask, G. M., Rinker, D. C., Zwiebel, L. J. Functional agonism of insect odorant receptor ion channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (21), 8821-8825 (2011).
  41. Butterwick, J. A., et al. Cryo-EM structure of the insect olfactory receptor Orco. Nature. 560 (7719), 447-452 (2018).
  42. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  43. Nakagawa, T., Touhara, K. Functional assays for insect olfactory receptors in Xenopus oocytes. Pheromone signaling. , Humana Press. Totowa, NJ. 107-119 (2013).
  44. Dobritsa, A. A., Van Naters, W., Warr, C. G., Steinbrecht, R. A., Carlson, J. R. Integrating the molecular and cellular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 37 (5), 827-841 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XenopuscRNAOrco
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים