Method Article

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

DOI:

10.3791/61821

⸱

December 23rd, 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מציגים שיטת ניקוי רקמות הידרופובית המאפשרת צפייה במולקולות יעד כחלק ממבני מוח שלמים. טכניקה זו אומתה כעת לשליטה F344/N ו- HIV-1 חולדות מהונדסות משני המינים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות ניקוי רקמות הידרופוביות ניתנות להתאמה בקלות, מהירות ובעלות נמוכה המאפשרות לחקור מולקולה של עניין בדגימות רקמות ללא לשינוי. הליכי אימונולאבלילינג מסורתיים דורשים חיתוך המדגם לחלקים דקים, מה שמגביל את היכולת לתייג ולבחון מבנים שלמים. עם זאת, אם רקמת המוח יכולה להישאר שלמה במהלך העיבוד, מבנים ומעגלים יכולים להישאר שלמים לניתוח. שיטות הסליקה שנקבעו בעבר לוקחות זמן משמעותי לנקות את הרקמה לחלוטין, והכימיקלים הקשים יכולים לעתים קרובות לפגוע בנוגדנים רגישים. שיטת iDISCO מנקה רקמות במהירות ובצורה מלאה, תואמת לנוגדנים רבים, ואינו דורש ציוד מעבדה מיוחד. טכניקה זו אומתה בתחילה לשימוש ברקמת עכברים, אך הפרוטוקול הנוכחי מתאים שיטה זו לחצי הכדורים של שליטה ומוחות חולדה מהונדסים. בנוסף לכך, הפרוטוקול הנוכחי מבצע גם מספר התאמות לפרוטוקול הקיים כדי לספק תמונות ברורות יותר עם פחות כתמי רקע. נוגדנים עבור איבה-1 ו טירוצין הידרוקסילאז אומתו בחולדה מהונדסת HIV-1 ובחולדות בקרה F344/N בשיטת ניקוי הרקמות ההידרופובית הנוכחית. המוח הוא רשת שזורה, שבה מבנים פועלים יחד לעתים קרובות יותר מאשר בנפרד זה מזה. ניתוח המוח כמערכת שלמה בניגוד לשילוב של חלקים בודדים הוא היתרון הגדול ביותר של כל שיטת ניקוי המוח הזו.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר טכניקות לניקוי רקמות אומתו לשימוש במוח: הידרוג'ל, הידרופילי והידרופובי. טכניקות אלה שואפות להפוך רקמה לשקופה באמצעות התלזות, דה-צבע ופירוק באמצעות ניהול ממסים. לאחר אינדקס שבירה של דגימת הרקמה תואם את האינדקס שבירה של מדיום ההדמיה שנבחר, ניתן להשיג תמונה ברורה של המדגם. טכניקות מבוססות הידרוג'ל, כגון CLARITY, ביומולקולים מאובטחים ברקמה על ידי קישורם הידרוג'לים מבוססי אקריל, המונע נזק מבני ואובדן חלבונים1. עם זאת, טכניקות הידרוג'ל להשתמש כימיקלים קשים מאשר יש פוטנציאל לפגוע רקמות שבירות יותר, ודגימות רקמות צפופות יותר לא יכול להיות תואם פרוטוקול הידרוג'ל. טכניקות הידרוג'ל מסוימות עשויות לדרוש ציוד יקר או להוביל להרחבת רקמות. טכניקות הידרופיליות, כמו CUBIC, לשמר מבנה 3D באמצעות היווצרות של קשרי מימן בתוך הרקמה2. הרחבת רקמות יכולה להתרחש גם בפרוטוקול הידרופילי מסוים. יכולת הסליקה של טכניקות הידרופיליות לעתים קרובות אינה תואמת את היכולת שיש לטכניקות הידרופוביות, החשובה לרקמות צפופות ועבות יותר3.

טכניקות הידרופוביות הן בדרך כלל מהירות, אינן דורשות ציוד מיוחד, ומייצרות מדגם שקל לטפל בו ולאחסן. iDISCO היא טכניקה הידרופובית שמבטלת את ההתכווצות שיכולה להתרחש בפרוטוקול הידרופובי אחר. במקור, טכניקת ניקוי הרקמות iDISCO תוארה על ידי Renier et al.4 עבור העוברים ואיברים צפופים, מבוגרים של עכברים. טכניקה זו מסירה מים מהרקמה בשלב ההתייבשות הראשוני, ובכך מפחיתה את פיזור האור. הרקמה מחלחלת במהלך טיפול מקדים כדי לאפשר חדירת נוגדנים עמוקה. אלכסה פלור צבעים בספקטרום האדום הרחוק משמשים אימונולאבלינג כדי למנוע autofluorescence של הרקמה באורכי גל נמוכיםיותר 5. רקמה שעברה פרוטוקולי סליקה הידרופוביים ניתן לטפל בקלות וניתן לדמיין מספר פעמים בשל אריכות הימים של צבעי Alexa Fluor. אם מאוחסן כראוי, רקמות יכול לספק תמונות במשך חודשים עד שנה לאחר העיבוד הראשוני.

בפרוטוקול הנוכחי, נוגדן טירוסין הידרוקסילאז (TH), נוגדן Iba1, ו Cholera רעלן Subunit B (CTB) שימשו הן על שליטה זכרית ונקבה והן HIV-1 מהונדס (Tg) מוחות חולדה. חולדת HIV-1 Tg מחזיקה בשבעה מתוך תשעת הגנים המרכיבים את הגנום הנגיפי HIV-1, מה שמוביל למודל לא זיהומי של חשיפה ארוכת טווח לחלבון HIV-16,7,8. שינויים דופאמין הוכחו בעבר בחולדה HIV-1 Tg, ו- HIV-1 עצמו היא מחלה דלקתית, ולכן בחירת הנוגדנים הייתה רלוונטית לעיצוב הניסיוני9,10,11,12. CTB הוא נותב המתחבר לנוירונים באמצעות כריכת גנגליוסיד וניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תחזיות חיוביות במוח. CTB שימש בעבר כדי ללמוד תחזיות מגרעין האקומבנס לאזור הסובסטנציה ניגרה, שני אזורים במוח המעורבים בכבדות עם מסלולים דופאמין13,14,15.

בפרוטוקול זה, TH ישמש סמן לייצור דופמין, ו Iba1 יסמן מיקרוגליה פעילה. נוגדן TH המשמש באופן סלקטיבי תוויות רצועה אחת בכ 62 kDa התואם טירוצין הידרוקסילאז. הנוגדן Iba1 מתאים לרצף מסוף קרבוקסי Iba1. שני הנוגדנים גדלו בארנב והיו פוליקלונליים. CTB ישמש למעקב מדרדר של נוירונים מאזור גרעין האקומבנס לאזור הסובסטנציה ניגרה. הפרוטוקול הנוכחי מציע גם קו מנחה להתאמת פרוטוקול iDISCO המקורי בשתי דרכים נפרדות: 1) הפחתה כוללת של כתמי הרקע על ידי שינוי ריאגנטים בסרום בשלבי החסימה, ו -2) שינוי קנה המידה של זמן הדגירה כך שיתאימו לדגימות רקמות גדולות יותר. בסך הכל, הפרוטוקול הנוכחי מספק ראיות מתמשכות לכך שטכניקות סליקה הידרופוביות אפשריות ברקמות המוח של החולדה, אין להן אינטראקציות מזיקות ניכרות עם חלבונים ויראליים HIV-1, והן תואמות לנוגדן TH, נוגדן Iba1 ו- CTB.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה.

1. הכנת פתרון מלאי

  1. פתרון 1 (1 ליטר): ל 900 מ"ל של H2O deionized להוסיף 100 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט 10x (PBS) ו 2 מ"ל של טריטון X-100.
  2. פתרון 2 (1 ליטר): ל 900 מ"ל של H2O deionized, להוסיף 100 מ"ל של 10x PBS, 2mL של Tween-20 ו 1 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל פתרון מלאי הפרין.
  3. פתרון 3 (500 מ"ל): ל-400 מ"ל של פתרון 1, הוסף 11.5 גרם של גליצין ו-100 מ"ל של דימתילסולפוקס (DMSO).
  4. פתרון 4 (50 מ"ל): ל 42 מ"ל של פתרון 1, להוסיף 3 מ"ל של סרום מתאים ו 5 מ"ל של DMSO.
  5. פתרון נוגדנים ראשי (50 מ"ל): ל 46 מ"ל של פתרון 2, להוסיף 2.5 מ"ל של DMSO ו 1.5 מ"ל של סרום מתאים.
  6. פתרון נוגדנים משני (50 מ"ל): ל 48.5 מ"ל של פתרון 2, להוסיף 1.5 מ"ל של סרום מתאים.
    הערה: עבור פתרון 4, פתרון ראשוני, פתרון משני, להשתמש בסרום המתאים עם הנוגדן המשני (למשל, עז, סוס, שור).

2. הכנת מדגם

הערה: בצע שלבים 2.1 עד 2.7 במכסה המנוע של אדים עקב הגבלת החשיפה ל- PFA.

  1. עכברוש צעיר מאוד (3-6 שבועות) באמצעות סבופלורן; המשך ל 2.2 כאשר חולדה אינה מגיבה ואינה מגיבה לצביטת בוהן וזנב.
  2. מניחים את החולדה בתנוחה על-חניכית וגורמים חתכים דרך דופן הבטן באמצעות זוג מספריים של איריס.
  3. חותכים דרך החלק התחתון של כלוב הצלעות לעצם הבריח משני צידי כלוב הצלעות באמצעות מספריים מאיו.
  4. מדביק את החזה והצלעות הרחק מהלב והריאות עם hemostat.
  5. לנקב את החדר השמאלי עם מחט 23 G מחובר משאבת זלוף לחתוך את האטריום הימני עם מספריים איריס.
  6. בצע זלוף עירוי עם כ 75 מ"ל של 100 mM (1x) PBS.
  7. המשך זלוף עירוי קרדית עם כ 100 מ"ל של 4% paraformaldehyde (PFA) חוצץ ב 1x PBS.
  8. הסר את המוח מהגולגולת באמצעות מלקחיים.
  9. מניחים את המוח במצב קשת ופורסים ל-4 חלקים שווים (ברוחב של כ-3 מ"מ) באמצעות סכין גילוח ומטריצת מוח חולדה.
  10. תקן כל סעיף ב- 4% PFA ב- 1x PBS בצינור פלסטיק אטום, 5 מ"ל למשך הלילה ב 4 °C (70 °F) על שייקר.
  11. המשך לתקן ב 4% PFA ב 1x PBS בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר עבור 1 שעה.
  12. לשטוף כל סעיף עם 1x PBS ב RT במשך 30 דקות, 3 פעמים.

3. התייבשות ודפיגמנטציה

  1. לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.
  2. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.
  3. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.
  4. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.
  5. לדגור על המדגם ב 100% מתנול במשך 1 שעה ב RT. חזור עם יותר 100% מתנול, דגירה במשך 1 שעה ב RT.
  6. מצננים את המדגם ב 100% מתנול ב 4° C במשך כ 10 דקות.
  7. הכן פתרון מתנול 66%./33%.
  8. לדגור את המדגם לילה בתמיסת DCM / מתנול ב RT, עם רועד.
  9. לשטוף עם מתנול ב RT במשך 30 דקות, 2 פעמים.
  10. מצננים את המדגם ב 100% מתנול ב 4° C במשך כ 10 דקות.
  11. אקונומיקה במצנן, מוכן טרי 5% מי חמצן במתנול לילה ב 4° C.
  12. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.
  13. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.
  14. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.
  15. לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.
  16. לדגור על המדגם ב 1x PBS עבור 1 שעה ב RT.
  17. יש לשטוף בפתרון 1 למשך שעה אחת ב-RT, פעמיים.

4. כולרה רעלן Subunit B תיוג

  1. הכנס קצה מחט של מזרק 1 מ"ל לתוך אתר גרעין accumbens.
  2. להזריק לאט 2.5 μL של 1% ביוטין-CTB מעל 20 s.
  3. השאירו את קצה המחט במקום במשך 1 דקות ולהסיר לאט מעל 10 s כדי למנוע דליפה.

5. יישום נוגדנים

  1. לדגור על המדגם בפתרון 3 במשך יומיים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.
  2. לדגור על המדגם בפתרון 4 במשך יומיים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.
  3. דגירה עם נוגדן ראשוני במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.
  4. יש לשטוף בתמיסה 2 למשך 5 פעמים, תוך כדי הדגירה של שעה אחת לכביסה. יש לאחסן בפתרון 2 ב-RT למשך הלילה.
  5. דגירה עם נוגדן משני במשך 7 ימים ב 37 °C (50 °F) באמבט מים.
  6. לשטוף בתמיסה 2 במשך 5 פעמים, דגירה 1 שעה לכל לשטוף; יש לאחסן בפתרון 2 ב-RT למשך הלילה.
    הערה: כל השלבים מ- 5.6 ואילך, כולל אחסון סופי, צריכים להתרחש באור נמוך. צינורות מדגם ניתן להגן עם רדיד אלומיניום. הריכוזים המשמשים לנוגדנים בפרוטוקול זה היו: TH בשעה 1: 100, איבה1 בשעה 1: 200, ואת הנוגדן המשני בשעה 1: 100. הוסף פתרון נוסף 2 לשלבים 5.1-5.6 כדי להבטיח שצינורות מלאים לחלוטין.

6. ניקוי רקמות

  1. לדגור על המדגם בתמיסת מים דו-שנתית של 20% מתנול/80% למשך שעה אחת ב-RT.
  2. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 40% מתנול / 60% עבור 1 שעה ב RT.
  3. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 60% מתנול / 40% עבור 1 שעה ב RT.
  4. לדגור את המדגם בתמיסת מים deionized 80% מתנול / 20% עבור 1 שעה ב RT.
  5. לדגור על המדגם ב 100% מתנול עבור 1 שעה ב RT.
  6. דגירה טרי 100% מתנול לילה ב RT.
  7. דגירה ב 66% DCM / 33% מתנול במשך 3 שעות, עם רועד, בטמפרטורת החדר.
  8. דגירה באתר דיבנזיל (DBE) מבלי לרעוד. השאר את המדגם ב- DBE עד ניקוי ולאחסן ב- DBE עד הדמיה.

7. הרכבה

  1. קבל תא מודפס בתלת-ממד העשוי משרף קריסטל Visijet M3 (תבניות הזמינות באתר האינטרנט idisco.info).
  2. אבטחו את התא לשקופית מיקרוסקופ באמצעות אפוקסי.
  3. מניחים את הדגימה בחלל המרובע באמצע התא.
  4. מלא את התא לחלוטין עם DBE.
  5. מניחים כיסוי בעובי 0.17 מ"מ מעל התא ומפעילים לחץ עד שלכיסוי יש מגע מלא עם קירות התא.
  6. אוטמים את קצות כיסויי הכיסוי לתא באמצעות האפוקסי.
  7. סובבו את התא כדי לאפשר לבועות אוויר לברוח ממפרצון המילוי.
  8. מלא את התא ב- DBE נוסף.
  9. לאטום את מפרצון המילוי עם אפוקסי ולאפשר לרפא.
    הערה: עודף DBE יישפך במהלך הרכבה.

8. הדמיה

  1. השתמש במערכת מיקרוסקופ קונפוקלית כדי לבצע סריקת z בהגדלה פי 4 (ראה וידאו תלת-ממדיהמצורף ).
  2. להשיג עירור פלואורסצנטי של המדגם באמצעות ערכת לייזר לפלוט אורך גל דומה לאורך הגל שצוין על ידי הנוגדן המשני. עירור TH הושג תוך שימוש בערכת לייזר HeNe לפלוט ב 632 ננומטר.
  3. הגדר את הגלאי אורך גל קרוב לפליטת הלייזר. עבור הפרוטוקול הנוכחי, הגלאי עבור TH הוגדר 650 ננומטר.
  4. להעלות את הרווח של הגלאי עד שיש אות גלוי. הרווח של 650LP לתמונות נקבע על 7.50 B.
  5. באמצעות האפשרות סריקה בתוכנת ההדמיה הקונפוקלית, הזז את שלב המיקרוסקופ עד שהדגימה מובאת למוקד.
  6. נווט סביב הרקמה בכל המישורים וקבל תמונות בודדות או תמונות z-stack באמצעות תוכנת ההדמיה הקונפוקלית.
  7. לאחר השלמת ההדמיה, הסר את הדגימה מהתא. מניחים אותו בחזרה לתוך צינור מלא לחלוטין עם DBE ולאחסן ב RT במקום חשוך, רצוי מכוסה בנייר אלומיניום.
    הערה: ניתן טען מחדש ותמונה של דגימות כל עוד אות פלורסנס עדיין חזק.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניקוי מלא של חלקים גדולים של F344/N ו- HIV-1 רקמת מוח חולדה הושג באמצעות פרוטוקול ניקוי רקמות הידרופוביות זה שונה. איור 1 מציג תמונה קונפוקלית טיפוסית עבור TH באזור הסובסטנציה ניגרה. איור 1A מייצג כתמים צפופים וחיוביים. אזורים צפופים כגון אלה ניתן לנתח על ידי התמקדות דרך מישור "Z" כדי לאשר כתמים חיוביים מורפולוגיה תאים נכונה. איור 1B מייצג כתמים חיוביים דלילים, שניתן לזהותם על ידי המורפולוגיה הייחודית של תאי העצב TH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניקוי רקמות מציע פתרון למגבלות של פרוטוקול IHC המסורתי. מדגם שקוף ממזער את הפיזור והספיגה של האור, המספק גישה אופטית ברמה התאית לרקמות שלמות18,19. טכניקות ניקוי רקמות הופכות רקמה לשקופה באמצעות התלזות, דה-צבע ופירוק הסתיידות עם ניהול ממסים. לאחר אינדקס שבירה של דגימת הרקמה תואם את האינדקס שבירה של מדיום ההדמיה שנבחר, המדגם ייראה שקוף לחלוטין וניתן לדמיין כראוי3. הפרוטוקול ההידרופובי הנוכחי מסיר מים מהרקמה בשלבי ההתייבשות הראשוניים, ובכך מפ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאף אחד מהמחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענקי NIH: NS100624, DA013137, HD043680, MH106392 &32 הכשרה גרנט 5T32GM081740

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תת-יחידה B של רעלן כולרה (רקומביננטי), Alexa Fluor 488InvitrogenC34775
DBESigma-Aldrich108014-1KG
DCMSigma-Aldrich270997-100 מ"ל
DMSOSigma-Aldrich472301-1L
גליציןפישר כימיG46-500
עיזים נגד ארנב Alexa Fluor Plus 647InvitrogenA32733
סרום עיזיםסיגמא מדעי החייםG9023-10mL
HeparinAcros Organics41121-0010
נוגדן ראשוני Iba1FUJIFILM Wako019-19741
Kwik-sil אפוקסיVWR70730-062
מתנולסיגמא-אולדריץ'34860-1L-R
PBSפישר ביוריאגנטיםBP2944-100
מכונת זלוףVWR70730-062מיני משאבה זרימה משתנה
PFAסיגמא-אולדריץ'158127-3KG
TH נוגדן ראשוניMillipore SigmaAB152
TritonX-100פישר ביוריאגנטיםBP151-500
טווין-20פישר ביוריאגנטיםBP337-500

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  2. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  3. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscienc. 21, 298(2020).
  4. Renier, N., et al. iDISCO: a simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  5. Renier, N., et al. Mapping of brain activity by automated volume analysis of immediate early genes. Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).
  6. Reid, W., et al. An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 98, 9271-9276 (2001).
  7. Vigorito, M., Connaghan, K. P., Chang, S. L. The HIV-1 transgenic rat model of neuroHIV. Brain, Behavior, and Immunity. 48, 336-349 (2015).
  8. McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285(2018).
  9. Fitting, S., Booze, R. M., Mactutus, C. F. HIV-1 proteins, Tat and gp120, target the developing dopamine system. Current HIV Research. 13, 135-137 (2015).
  10. Javadi-Paydar, M., Roscoe, R. F., Denton, A. R., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 and cocaine disrupt dopamine reuptake and medium spiny neurons in female rat striatum. PLos One. 12 (11), 0188404(2017).
  11. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Science Report. 8, 6152(2018).
  12. Denton, A. R., et al. Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure. Journal of neurovirology. 25 (4), 540-550 (2019).
  13. Berendse, H. W., Groenewegen, H. J., Lohman, A. H. Compartmental distribution of ventral striatal neurons projecting to the mesencephalon in the rat. Journal of Neuroscienc. 12 (6), 2079-2103 (1992).
  14. Peyron, C., Petit, J. M., Rampon, C., Jouvet, M., Luppi, P. H. Forebrain afferents to the rat dorsal raphe nucleus demonstrated by retrograde and anterograde tracing methods. Neuroscience. 82 (2), 443-468 (1998).
  15. Barrot, M., et al. Braking dopamine systems: a new GABA master structure for mesolimbic and nigrostriatal functions. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscienc. 32 (41), 14094-14101 (2012).
  16. Roostalu, U., et al. Quantitative whole-brain 3D imaging of tyrosine hydroxylase-labeled neuron architecture in the mouse MPTP model of Parkinson's disease. Disease Models & Mechanisms. 12 (11), (2019).
  17. Ransohoff, R., Cardona, A. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468, 253-262 (2010).
  18. Rocha, M. D., et al. Tissue Clearing and Light Sheet Microscopy: Imaging the Unsectioned Adult Zebra Finch Brain at Cellular Resolution. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 13(2019).
  19. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Hydrophobic Tissue ClearingRat Brain TissueTissue Clearing MethodMethanol DehydrationDCM Methanol SolutionDibenzyl Ether ClearingConfocal Microscopy ImagingAntibody Incubation ProtocolWhole Brain AnalysisCircuit Level Analysis

Related Articles