Method Article

הערכת תכנות מחדש של הלב באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה

DOI:

10.3791/61859

⸱

October 26th, 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מציגים פרוטוקול לכימות תאים דמויי קרדיומיוציטים מושרים (iCMs) מתוכנתים מחדש ישירות במבחנה באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה. שיטה זו מאפשרת לנו לכמת את היעילות של תכנות מחדש של הלב בצורה אוטומטית ולדמיין ישירות iCMs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מטרת פרוטוקול זה היא לתאר שיטה לכימות תאים דמויי קרדיומיוציטים מושרים (iCMs), אשר מתוכנתים מחדש ישירות במבחנה על ידי טכניקת תכנות מחדש. תכנות מחדש של הלב מספק אסטרטגיה ליצירת קרדיומיוציטים חדשים. על ידי הכנסת גורמי שעתוק קרדיוגניים ליבה לפיברובלסטים; ניתן להמיר פיברובלסטים ל-iCMs ללא מעבר דרך מצב תאי גזע פלוריפוטנטיים. עם זאת, שיעור ההמרה של פיברובלסטים ל-iCMs עדיין נשאר נמוך. בהתאם לכך, היו גישות רבות נוספות לשיפור יעילות התכנות מחדש של הלב. רוב המחקרים הללו העריכו את יעילות התכנות מחדש של הלב באמצעות זרימה ציטומטרית, ובמקביל ביצעו אימונוציטוכימיה כדי להמחיש iCMs. לפיכך, נדרשות לפחות שתי קבוצות נפרדות של ניסויי תכנות מחדש כדי להדגים את ההצלחה של תכנות מחדש של iCM. לעומת זאת, ניתוח הדמיה אוטומטי בתוכן גבוה יספק הן כימות והן הסמכה של תכנות מחדש של iCM עם מספר קטן יחסית של תאים. בשיטה זו, ניתן להעריך ישירות את הכמות והאיכות של iCMs באמצעות ניסוי תכנות מחדש יחיד. גישה זו תוכל להקל על מחקרי תכנות מחדש עתידיים של הלב הדורשים ניסויי תכנות מחדש בקנה מידה גדול כגון סינון גורמים גנטיים או פרמקולוגיים לשיפור יעילות התכנות מחדש. בנוסף, היישום של פרוטוקול ניתוח הדמיה בתוכן גבוה אינו מוגבל לתכנות מחדש של הלב. ניתן ליישם אותו על תכנות מחדש של שושלות תאים אחרות כמו גם על כל ניסויי צביעה חיסונית הזקוקים הן לכימות והן להדמיה של תאים מוכתמים חיסוניים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכנות מחדש של הלב פותח כגישה חלופית לגישות בתיווך תאי גזע ליצירת קרדיומיוציטים חדשים. בהתחשב בכך שהוא אינו עובר דרך מצב תאי גזע, יש לו פוטנציאל גבוה לעקוף כמה מגבלות תורשתיות בגישות מתווכות תאי גזע. הוכח כי זיהום ויראלי של לפחות שלושה או ארבעה גורמי שעתוק קרדיוגניים לפיברובלסטים יכול להמיר פיברובלסטים לגורל לב על ידי ביטול תוכניות גנים פיברובלסטים ובנייה מחדש של רשתות שעתוק קרדיוגניות בפיברובלסטים 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט.

1. יצירת רטרו-וירוס ותכנות מחדש של הלב במבחנה

  1. תרבית תאי פלטינום E ב-DMEM בתוספת 10% FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין ו-10 מיקרוגרם/מ"ל בלסטיצידין עד שהמפגש של תאי פלטינה E מגיע ל-70%-80%.
  2. ביום הראשון, זרע ~0.55 x 106 תאים (באר ראשונה) ו~0.18 x 106 תאים (באר שנייה) לשתי בארות נפרדות של צלחת 12 בארות עם 1 מ"ל DMEM בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין יום לפני הטרנספקציה הראשונה.
    הערה: ניתן להשתמש בגדלים שונים של צלחות תרבית ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחר ניסויי תכנות מחדש, כימתנו iCMs באמצעות ניתוח הדמיה בתוכן גבוה כמתואר לעיל. תמונות מורכבות של 36 אתרי הדמיה ששימשו לניתוח הדמיה בתוכן גבוה הוצגו באיור 1. iCMs מוגדרים כתאים חיוביים כפולים (α-actinin+Titin-eGFP+) בניסויים אלה. ניתוח הדמיה בעל תוכן גבוה מראה כי ~26% מהתאים הראו את שני הסמנים הלבביים לאחר התמרת M-G-T-H, בעוד ש~1% מתאי הבקרה המומרים וקטור ריקים מראים תאים חיוביים כפולים. iCMs בודדים הודגמו בתמונות פי 10 שצולמו על ידי מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרי התכנות מחדש הקודמים העריכו את יעילות התכנות מחדש באמצעות ציטומטריית זרימה והדגימו את האיכות המבנית של iCMs באמצעות אימונוציטוכימיה בשני ניסויים נפרדים. ניתוח ציטומטריית זרימה דורש מספר גדול בהרבה של תאי התחלה, ובכך מגדיל את היקף הניסויים. לעומת זאת, ניתוח הדמיה בתוכן גבוה יכול להעריך הן את האיכות והן את הכמות של תכנות מחדש של iCM על ידי ניסוי יחיד עם מספר קטן יחסית של תאים. לכן, שיטה חדשה זו יכולה לספק פלטפורמה טכנית חדשה ויעילה למחקרי תכנות מחדש עתידיים. בפרט, שיטה חדשה זו תהיה שי.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניתוח הדמיה בתוכן גבוה בוצע במתקן הליבה של Vanderbilt High-Throughput Screening (HTS) בסיוע דיוויד ווסטובר וג'ושוע באואר. ליבת HTS מקבלת תמיכה ממכון ונדרבילט לביולוגיה כימית ומרכז הסרטן ונדרבילט אינגרם (P30 CA68485). עבודה זו נתמכה על ידי פרס הפרויקט החדשני של AHA 18IPA34110341 ו-NIH R01 HL146524 (Y-J. N.), ופרס מלגת הפוסט-דוקטורט של AHA 20POST35210170 (Z.Z).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01Tocris2939
אנטי עוף Alexa 488ThermofisherA11039
נוגדן נגד GFPInvitrogenA10262
אנטי עכבר Alexa 555ThermofisherA21422
נוגדן אנטי &אלפא אקטיניןSigmaA7811
תמיסת DAPIמעבדות וקטורH1200
Fugene 6PromegaE2691
אינסולין-טרנספרין-סלניום תוסף GInvitrogen41400-045
בינוני 199Invitrogen11150059
MEM תמיסת ויטמיןInvitrogen11120-052
MetaXpressתוכנה מכשיר
Micro XL מערכת דמיון תאים אוטומטיתמולקולרי
תמיסת חומצות אמינו חיוניות מינימליותSigmaM7145
Opti-MEMGibco31905-070
מסנן PES (0.45 & micro; m)תומאס מדעי1159T84
תאי Platninum E תאיםBiolabsRV-101
PolybreneSigmaH9268
SB431542SigmaS4317
מאגר חוסם אוניברסליBiogeneXHK083-50K
מולקולרי מכשיר

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  2. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac ReprogrammingHigh Content ImagingInduced Cardiomyocyte like CellsFlow CytometryImmunocytochemistryTranscription Factor ReprogrammingFibroblast ConversionAutomated Image AnalysisReprogramming EfficiencyGenetic Screening
Video Coming Soon

Related Articles