אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גליה מעוגנים חוש הריח (OEG) מותאמים כל הדרך מן רירית הריח אל ולתוך שכבת עצב הריח (ONL) של נורת הריח. לאורך כל החיים הבוגרים, הם המפתח לגידול אקסונלי של נוירונים חוש הריח החדש שנוצר, מן הפרופריה למינה ל ONL. בשל תכונותיהם הפרו-רגנרטיביות, תאים אלה שימשו לטיפוח התחדשות אקסונית בחוט השדרה או במודלים של פגיעה בעצב הראייה.
אנו מציגים מודל במבחנה כדי לבצע בדיקה ולמדוד את היכולת הנוירו-רה-רגנרטיבית של OEG לאחר פגיעה עצבית. במודל זה, OEG אנושי מונצח באופן הפיך (ihOEG) הוא מתורבת כמונולאייר, רשתית מופקים חולדות מבוגרים נוירונים גנגליון רשתית (RGN) הם cocultured על מונולאיר OEG. לאחר 96 שעות, סמנים אקסונליים וסמוטונדריטיים ב- RGNs מנותחים על ידי כשל חיסוני ומספר ה- RGNs עם אקסון והאורך/נוירון האקסונלי הממוצע מכומתים.
לפרוטוקול זה יש יתרון על פני מבחני הפריה חוץ גופיים אחרים המסתמכים על נוירונים עובריים או לאחר לידה, כי הוא מעריך תכונות נוירו-רגנרטיביות OEG ברקמה הבוגרת. כמו כן, זה לא רק שימושי להערכת הפוטנציאל neuroregenerative של ihOEG אבל ניתן להרחיב למקורות שונים של OEG או תאים גליה אחרים.
מבוא
נוירונים במערכת העצבים המרכזית למבוגרים (CNS) יש יכולת רגנרטיבית מוגבלת לאחר פציעה או מחלה. אסטרטגיה נפוצה לקידום התחדשות מערכת העצבים המרכזית היא השתלה, באתר הפציעה, של סוגי תאים שגורמים לצמיחה אקסונאלית כגון תאי גזע, תאי שוואן, אסטרוציטים או חוש הריח ensheathing גליה (OEG) תאים1,2,3,4,5.
OEG נובעת מהציצה העצבית6 ומאתרת ברירית הריח ובנורת הריח. אצל המבוגרים, נוירונים חושיים חושיים חושיים מתים באופן קבוע כתוצאה מחשיפה סביבתית והם מוחלפים על ידי נו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדות ביואתיקה לאומיות ומוסדיות.
1. תרבות ihOEG (Ts12 ו- Ts14)
הערה: הליך זה נעשה בתנאים סטריליים בארון biosafety תרבית רקמות.
- הכן 50 מ"ל ME10 OEG תרבות בינונית כפי שסופק בטבלה 1.
- הכן 5 מ"ל של DMEM / F12-FBS, כפי שסופק בטבלה 1, בצינור חרוט 15 מ"ל.
- מחממים את שתי המדיה ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים, במשך 15 דקות.
- להפשיר Ts12 ו Ts14 בקבוקונים תאים ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים נקיים.
- התחדש והוסף תאים למדיום התרבות DMEM/F12-FBS שהוכן בשלב 2.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם.<....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בפרוטוקול זה, אנו מציגים מודל במבחנה כדי לתבוע את היכולת הנוירו-רגנרטיבית של OEG לאחר פגיעה עצבית. כפי שמוצג באיור 1, מקור ה-OEG הוא קו תאים שיבוט אנושי מונצח הפיך -Ts14 ו- Ts12-, הנובע מתרבויות עיקריות, המוכן מנורות חוש הריח המתקבלות בנתיחה שלאחר המוות15,17,18. רקמת רשתית מופקת חולדות מבוגרים, מתעכל, נוירונים גנגליון רשתית (RGN) השעיה מצופה על כיסויים שטופלו PLL או על monolayers ihOEG, Ts14 או Ts12.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השתלת OEG באתרי פגיעה במערכת העצבים המרכזית נחשבת לטיפול מבטיח לפציעה במערכת העצבים המרכזית בשל תכונותיה הפרו-נוירו-נוירו-רגנרטיביות המכוננות7,8,9. עם זאת, בהתאם למקור הרקמה - רירית חוש הריח (OM-OEG) לעומת נורת חוש הריח (OB-OEG) - או גיל התורם, קיימת שונות ניכרת בקיבולת כזו26,31,33,36. לכן, יש חשיבות י.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה כספית על ידי פרויקט SAF2017-82736-C2-1-R משריו דה סינסיה e Innovación ל MTM-F ועל ידי Fundación אוניברסיטת פרנסיסקו דה ויטוריה ל JS.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| נוגדן 514 | התייחסות 34 | אנטי-סרום רב-שבטי של ארנב, המזהה MAP2A ו-B. | |
| נוגדן SMI-31 | BioLegend | 801601 | נוגדן חד שבטי כנגד חלבוני MAP1B ו-NF-H |
| נוגדן נגד עכבר Alexa Fluor 488 נוגדן | ThermoFisher | A-21202 | |
| אנטי-ארנב Alexa Fluor 594 נוגדן | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 תוסף | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acid | Sigma | 283967 | מעכב קולטן NMDA |
| DAPI | Sigma | D9542 | כתם פלואורסצנטי גרעין |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | מדיום תרבית תאים |
| FBS | Gibco | 11573397 | סרום בקר עוברי |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | סרום בקר עוברי |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | מדיום הרכבה |
| ImageJ | המכונים הלאומיים לבריאות (NIH-ארה"ב) | תוכנת תמונה | |
| L-גלוטמין | לונזה | BE17-605F | |
| מדיום נוירובזאלי | Gibco | 21103049 | מדיום תרבית תאים עצביים |
| מערכת דיסוציאציה פפאין | תאגיד ביוכימי וורת'ינגטון | LK003150 | לשימוש בבידוד תאים עצביים |
| PBS | תוצרת | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| פניצילין/סטרפטומיצין/אמפוטריצין B | Lonza | 17-745E | יותרת המוח בקטריוסטטית וקוטלת חיידקים |
| יותרת | המוח | של Gibco | 13028014 |
| -L-ליזין (PLL) | Sigma | A-003-M |
מקורות
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
