הליכים השתלת מח עצם בעכברים ללמוד Hematopoiesis שיבוט

סיכום

אנו מתארים שלוש שיטות של השתלת מח עצם (BMT): BMT עם הקרנת גוף כוללת, BMT עם הקרנה מוגנת, ושיטת BMT ללא מיזוג מראש (BMT מאמץ) לחקר המטופוזיס שיבוטים במודלים של עכבר.

תקציר

המטופויזיס קלונל הוא מצב נפוץ הקשור לגיל הנובע מהצטברות של מוטציות סומטיות בתאי גזע ו אבות מהמטופויטיים (HSPCs). מוטציות בגנים של הנהג, המעניקות כושר תאי, יכולות להוביל להתפתחות של שיבוטי HSPC מתרחבים שגורמים יותר ויותר לויקוציטים צאצאים המעניקים מחסה למוטציה הסומטית. מכיוון שהמטופוזיס שיבוטי נקשר למחלות לב, שבץ ותמותה, פיתוח מערכות ניסיוניות המרכיבות תהליכים אלה הוא המפתח להבנת המנגנונים העומדים בבסיס גורם סיכון חדש זה. הליכים השתלת מח עצם מעורבים מיזוג מיאלובלטיבי בעכברים, כגון הקרנת הגוף הכולל (TBI), משמשים בדרך כלל כדי ללמוד את התפקיד של תאים חיסוניים במחלות לב וכלי דם. עם זאת, נזק בו זמנית לגומחת מח העצם ולאתרים מעניינים אחרים, כגון הלב והמוח, הוא בלתי נמנע עם הליכים אלה. לכן, המעבדה שלנו פיתחה שתי שיטות חלופיות כדי למזער או למנוע תופעות לוואי אפשריות הנגרמות על ידי TBI: 1) השתלת מח עצם עם מיגון הקרנה ו 2) BMT מאמץ לעכברים לא מותנים. באיברים מוגנים, הסביבה המקומית נשמרת ומאפשרת ניתוח של hematopoiesis שיבוט בעוד הפונקציה של תאים חיסוניים תושב הוא ללא הפרעה. לעומת זאת, BMT מאמץ לעכברים לא מותנים יש יתרון נוסף כי הן את הסביבות המקומיות של האיברים ואת הנישה hematopoietic נשמרים. כאן, אנו משווים שלוש גישות שונות של שחזור תאים hematopoietic ולדון החוזקות והמגבלות שלהם למחקרים של hematopoiesis שיבוט במחלות לב וכלי דם.

מבוא

המטופוזיס שיבוט (CH) הוא מצב אשר נצפתה לעתים קרובות אצל אנשים קשישים מתרחשת כתוצאה של גזע hematopoietic מורחב תא אב (HSPC) שיבוט נושא מוטציה^{גנטית 1}. הוצע כי עד גיל 50, רוב האנשים ירכשו בממוצע חמש מוטציות אקסוניק בכל HSPC², אבל רוב המוטציות האלה יגרמו לתוצאות פנוטיפיות מועטות או לא לא לאדם. עם זאת, אם במקרה אחת מהמוטציות הללו מעניקה יתרון תחרותי ל- HSPC – למשל על-ידי קידום התפשטותו, חידושו העצמי, הישרדותו או שילוב כלשהו שלו – הדבר עשוי להוביל להרחבה מועדפת של שיבוט המוטנטים ביחס ל- HSPCs האחרים. כתוצאה מכך, המוטציה תתפשט יותר ויותר דרך מערכת hematopoietic כמו HSPC מוטציה מעוררת תאי דם בוגרים, המוביל לאוכלוסייה ברורה של תאים שעברו מוטציה בתוך הדם ההיקפי. בעוד מוטציות בעשרות גנים שונים של נהג מועמד קושרו עם אירועי שיבוט בתוך מערכת hematopoietic, בין אלה, מוטציות ב- DNA מתיל טרנספראז 3 אלפא (DNMT3A) ועשרה טרנסלוקציה 11 2 (TET2) הם הנפוצים ביותר³. מספר מחקרים אפידמיולוגיים מצאו כי אנשים הנושאים מוטציות גנטיות אלה יש סיכון גבוה יותר באופן משמעותי למחלות לב וכלי דם (CVD), שבץ, ותמותה סיבתית^3,4,5,6,7. בעוד שמחקרים אלה זיהו כי קיים קשר בין CH לבין שכיחות מוגברת של CVD ושבץ, איננו יודעים אם קשר זה הוא סיבתי או אפיפנומנון משותף עם תהליך ההזדקנות. כדי לקבל הבנה טובה יותר של קשר זה, מודלים בעלי חיים נאותים כי נכון לסכם את המצב האנושי של CH נדרשים.

מספר מודלים של בעלי חיים CH הוקמו על ידי הקבוצה שלנו ואחרים באמצעות זברה, עכברים, פרימטים שאינם אנושיים^{8,9,10,11,12,13,14}. מודלים אלה משתמשים לעתים קרובות בשיטות שחזור hematopoietic על ידי השתלת תאים מהונדסים גנטית, לפעמים באמצעות Recombination Cre-lox או מערכת CRISPR. גישה זו מאפשרת ניתוח של מוטציה גנטית ספציפית בתאים hematopoietic כדי להעריך איך זה תורם להתפתחות המחלה. בנוסף, מודלים אלה מעסיקים לעתים קרובות תאים קוגניים או תאים כתב כדי להבחין בין ההשפעות של תאים מוטנטים מתאים נורמליים או פראיים. במקרים רבים, משטר טרום מיזוג נדרש בהצלחה לחרוט תאי גזע hematopoietic התורם.

נכון לעכשיו, השתלת מח עצם לעכברים המטופל ניתן לחלק לשתי קטגוריות עיקריות: 1) מיזוג מיאלובלטיבי 2) השתלה מותנית. מיזוג Myeloablative יכול להיות מושגת על ידי אחת משתי שיטות, כלומר, הקרנת הגוף הכולל (TBI) או^{כימותרפיה 15}. TBI מתבצעת על ידי החשפות הנמען למנה קטלנית של הקרנת גמא או רנטגן, יצירת הפסקות DNA או קישורים צולבים בתוך תאים המפרידים במהירות, מה שהפך אותם לבלתי הפיכים¹⁶. בוסולפן וציקלופוזפיד הן שתי תרופות כימותרפיות נפוצות המשבשות את הנישה ההמטופוביטית וגורמות באופן דומה לנזק לדנ"א לתאים המפרידים במהירות. התוצאה נטו של תנאי מקדים מיאלובלטיבי הוא אפופטוזיס של תאים hematopoietic, אשר הורס את המערכת hematopoietic של המטופל. אסטרטגיה זו לא רק מאפשרת חריטה מוצלחת של HSPCs התורם, אבל יכול גם למנוע דחיית השתל על ידי דיכוי המערכת החיסונית של המטופל. עם זאת, myeloablative תנאי מוקדם יש תופעות לוואי חמורות כגון נזק לרקמות ואיברים ותאי החיסון תושב שלהם, כמו גם הרס של נישה מח עצם יליד¹⁷. לכן, הוצעו שיטות חלופיות להתגבר על תופעות לוואי לא רצויות אלה, במיוחד לגבי נזק לאיברים בעלי עניין. שיטות אלה כוללות הקרנה מוגנת של עכברים נמענים ואת BMT מאמץ לעכברים לא מותנים^9,17. הגנה על בית החזה, חלל הבטן, הראש או אזורים אחרים מפני הקרנה על ידי מיקום של מחסומי עופרת שומרת על רקמות מעניינות מוגנות מפני ההשפעות המזיקות של הקרנה ושומרת על אוכלוסיית תאי החיסון התושבים שלהם. מצד שני, BMT מאמץ של HSPCs לעכברים מותנים יש יתרון נוסף כי זה משמר את הנישה hematopoietic יליד. בכתב יד זה, אנו מתארים את הפרוטוקולים והתוצאות של תחריט HSPC לאחר מספר משטרי השתלה בעכברים, במיוחד מסירת HSPC לעכברי TBI, לעכברים המוגנים חלקית מפני הקרנה, ולעכברים לא מותנים. המטרה הכוללת היא לעזור לחוקרים להבין את ההשפעות הפיזיולוגיות השונות של כל שיטה, כמו גם כיצד הם משפיעים על תוצאות ניסיוניות בהגדרה של CH ומחלות לב וכלי דם.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים בנושאים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת וירג'יניה.

1. לפני תנאים קודמים

1. מניחים את העכברים המטופל על מים בתוספת אנטיביוטיקה (5 מ"מ סולפטוקסזול, 0.86 מ"מ trimethoprim) ~ 24 שעות לפני הקרנה. זה הכרחי כדי למנוע זיהום, כמו המערכת החיסונית דוכאה לאחר הקרנה, ומתוחזק במשך 2 שבועות לאחר הקרנה. בשלב זה, להשלים עכברים עם ג'ל תזונתי/ הידרציה כדי לעודד האכלה ולמנוע ירידה במשקל והתייבשות לאחר הקרנה.

איור 1: תמונות המציגות הגדרות שונות של תנאים מקדים. (A)מערך הקרנת הגוף הכולל של כלוב הפאי באמצעות קרן גמא (צסיום-137): קרן הקרינה מגיעה מגב הקרינה בכיוון ציר ה-y (קרינה אופקית). (B) כלוב העכבר ההתקנה הכוללת הקרנת הגוף באמצעות רנטגן: כלוב העכבר ממוקם בתא רפלקטיבי. קרן הקרינה מגיעה מראש הקרינה בצורת חרוט (קרינה אנכית). המרחק ממקור הקרינה לכלוב הוא 530 מ"מ. (C) מגש מתכוונן בקרן רנטגן: התקנה זו משמשת להקרנה מוגנת חלקית באמצעות רנטגן. קרן הקרינה מגיעה מראש הקרינה בצורת חרוט (קרינה אנכית). המרחק ממקור הקרינה למגש הוא 373 מ"מ, והרדיוס הוא 250 מ"מ.(D)מיגון בית החזה: עכברים מורדמים מונחים על מגש. העכברים ממוקמים הפוכים זה לזה בתנוחות סופיות עם ידיים ורגליים מורחבות לחלוטין. הקצה התחתון של מגן העופרת מיושר עם עצם xiphisternum ואת הקצה העליון עם התימוס. (ה)מיגון בטן: עכברים מורדמים ממוקמים כמו בהגדרת מגן בית החזה עם הקצה התחתון של מגן העופרת מיושר עם פי הטבעת ואת הקצה העליון מתחת לסרעפת. (ו)הגדרת הקרנה מגינה על הראש באמצעות קרן גמא (צסיום-137): תפאורת העכבר המורדמת מודבקת למטה והעכבר ממוקם במרסן חרוט. מגן העופרת השחור (מסומן) מכסה את ראשו ואוזניו של העכבר. קרן הקרינה מגיעה מגב הקרינה לכיוון ציר ה-Y (קרינה אופקית). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. תנאי מקדים של עכברים נמענים (אופציונלי)

1. הקרנת גוף כוללת
   1. מניחים עכברים נמען לתוך כלוב עוגה פרוס באופן אחיד, או כלוב עכבר בתא רפלקטיבי בתוך הרדיוס המחושב כדי לקבל את אותה מנה הקרנה; עם זאת, מומלץ לכל היותר 8 עכברים לכלוב עוגה ו-5 עכברים לכלוב עכברים כדי להבטיח הקרנה אחידה(איור 1A,B).
   2. כדי להשיג myeloablation מלא, להבטיח כי עכברים המטופל לקבל מינון קרינה כולל של 11 Gy בשני שברי Gy 5.5 מופרדים על ידי מרווח של 4-24 שעות.
      הערה: בעוד שניתן להשיג חריטה אופטימלית על-ידי יישום מרווח של 4 שעות בין שברים, ניתן להרחיב זאת למרווח של 24 שעות, דבר שיכול להועיל כאשר העבודה ו/או ההקרנה אינן זמינות.
2. הקרנה מוגנת חלקית
   1. הרדמה העכברים המטופל על ידי הזרקה תוך-אישית של קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (5-10 מ"ג/ק"ג). האיפוק של תנועת העכבר הוא קריטי כדי להבטיח הקרנה אחידה והגנה יעילה של איברי המטרה במהלך תהליך המיגון.
   2. למיגון בית החזה והבטן, כוון את קרן הקרינה של קרינה רנטגן אנכית לעכבר (איור 1C).
      1. מקמו את העכברים המרופדים על צלחת שטוחה, ומרכזים את מקור הקרינה מלמעלה. הניחו את העכברים הפוכים זה לזה בתנוחת על-חושית עם ידיים ורגליים מורחבות במלואן(איור 1D,E).
         הערה: מתקן הקרנת רנטגן, עבור ניסוי זה, מאפשר כי שני עכברים בכל פעם ניתן למקם ברדיוס יעיל המאפשר הקרנה אחידה. בעוד שהרדיוס האפקטיבי מחושב על סמך המרחק בין מקור הקרינה למגש, מספר בעלי החיים שניתן להקרין בו זמנית יהיה תלוי בהקרנה הספציפית.
      2. הדקו את כפות הרגליים של העכברים על הצלחת באמצעות סרט הדבקה כדי להבטיח שהעכברים משותקים במהלך הליך ההקרנה. מקם את מיגון העופרת כך שיכסה אזורים הדורשים הגנה.
      3. למיגון בית החזה, הכינו את מגן העופרת על ידי מדידת האורך מעצם xiphisternum של העכבר אל התימוס וחישוב העובי שיספק הגנה מספקת ממקור ההקרנה. הנח את מיגון העופרת כך שהקצה התחתון יתיישר עם עצם ה- xiphisternum. הקצה העליון של מחסום העופרת יתאים ליד התימוס(איור 1D).
      4. למיגון הבטן, הכינו את מגן העופרת על ידי מדידת האורך מפי הטבעת של העכבר לסרעפת וחישוב העובי שיספק הגנה מספקת ממקור ההקרנה. הנח את מיגון ההפניה כך שהקצה התחתון יתיישר עם פי הטבעת. הקצה העליון של מגן העופרת יתאים מתחת לסרעפת (איור 1E).
         הערה: לוקליזציה של מגן העופרת כך שיהיה עקבי בין קבוצות עשויה להפחית וריאציה מסוימת ביחס לגודל העכברים.
   3. עבור מיגון ראש, לכוון את קרן הקרינה של הקרנת צסיום אופקית לעכבר.
      1. בזהירות להקליט את ההסתעפות של עכבר מורדם לבטן. זה מבטיח כי הזרועות לקבל מנה מלאה של הקרנה ואינם מכוסים על ידי המגן.
      2. עבור מיגון ראש, למקם את העכבר במרסן חרוט, אשר מתאים בתוך מגן עופרת. לאחר שהעכבר נמצא בתוך המרסן החרוט, החלק את המרסן לתוך החריץ בתוך מגן העופרת(איור 1F). מגן העופרת אמור לכסות לחלוטין את ראשו ואוזניו של העכבר (~ 3.2 ס"מ), ולהשאיר את שאר גופו של העכבר חשוף להקרנה. ניתן להתאים את מיקום המרסן בתוך המגן כך שיתאים לבעלי חיים בגדלים שונים על ידי החלקתו פנימה או מחוץ למגן.
      3. מניחים עכברים בתוך ההקרנה, בניצב למקור להקרנה.
   4. לחשוף עכברים לשני שברי Gy 5.5 של הקרנה (המינון הכולל של 11 Gy) מופרדים על ידי מרווח של 4-24 שעות.
   5. לאחר כל שבר הקרנה, מניחים את הכלובים עם עכברים מורדמים על מחצלות מחוממות או תחת מנורות חום אדומות כדי למנוע היפותרמיה ולסייע בהתאוששות מהרדמה.
      הערה: יש לנקוט משנה זהירות כדי לא לחמם יתר על המידה את העכבר המומר בעת שימוש במנורה מכיוון שהם אינם יכולים להימלט מהחום. כפי שתואר לעיל, המיקום של בעלי חיים ועובי מגן העופרת יכולים להיות שונים בין מחקרים המבוססים על התכונות הספציפיות של הקרינה (סוג קרינה / כיוון של קרן, וכו '). החוקרים יצטרכו להתאים את הניסויים שלהם בהתאם.

3. בידוד עצמות

הערה: באופן אידיאלי, עכברים תורמים ועכברים נמענים צריכים להיות דומים בגיל, ובתוך 8-12 שבועות. שימוש בלפחות 3 עכברים כתורמים (ולא כתורם יחיד) עדיף למזער את ההטרוגניות (גם בעת שימוש בעכברים עם אותו גנוטיפ). בערך, 40 מיליון תאי מח עצם לא מופרים ניתן להשיג משש עצמות (שתי עצם הירך, שתי שוקות, ושני humeri) של עכבר אחד. השתלה של 5 מיליון תאי מח עצם לכל עכבר נמען בדרך כלל תבטיח חריטה.

1. המתת חסד עכברים תורמים על ידי נקע בצוואר הרחם ללא הרדמה (שיטה מועדפת כדי למנוע זיהום כימי של תאים) ומניחים כל עכבר על כרית סופגת.
2. לחטא את העור באמצעות תרסיס אתנול 70%.
3. לעשות חתך רוחבי קטן בעור מתחת לכלוב הצלעות ולהחזיק את העור בחוזקה משני צדי החתך, לקרוע בכיוונים מנוגדים לכיוון הראש והרגליים. לקלף את העור מכל הגפיים.
4. חותכים מעל הכתפיים ומפרקי המרפק, ומסירים את השרירים המחוברים ואת רקמות החיבור בעזרת קימיפי כדי להשיג את humeri.
5. בזהירות לפרוק את מפרקי הירך בין עצם הירך ועצמות הירך. השתמש מספריים קהה לחתוך לאורך ראש עצם הירך לנתק את הרגליים. חותכים מעל מפרק הברך כדי להפריד את עצם הירך ואת השוקה, ולהסיר בזהירות את השרירים המצורפים ואת רקמות החיבור בעזרת קימוויפ כדי לקצור את עצם הירך ואת השוקה.
   הערה: שים לב במיוחד כדי לשמור על אפיפיזת העצם ללא פגע במהלך שלב זה. השלך את כל העצמות השבורות עקב אובדן עקרות. עצמות הירך ועצמות עמוד השדרה ניתן לאסוף בנוסף עצם הירך, השוקה, ועצם הזרוע. כדי לאסוף עצמות עמוד השדרה, מרגמה ועלי יכול לשמש כדי למחוץ את העצמות לחתיכות לקצור את תאי מח העצם.
6. מניחים את העצמות המבודדות מעכברים מאותו גנוטיפ לתוך צינור חרוט 50 מ"ל בהתאמה המכיל 20 מ"ל קרח קר סטרילי PBS, ולשמור אותו על הקרח עד לשימוש נוסף. שים לב במיוחד למקם את העצמות בצורה נכונה לתוך צינורות עם גנוטיפים תואמים.
7. חזור על השלבים לעיל עבור כל בעל חיים תורם שינוי כפפות בין כל עכבר. כמו כן, מספריים נקיים ומכשירים אחרים עם 70% אתנול בין כל עכבר.

4. בידוד תאי מח עצם

הערה: בצע את השלבים הבאים בארון מסוג BIOSAFETY II.

1. הכנת ערכות צינור: לעשות חור קטן בחלק התחתון של צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 0.5 מ"ל באמצעות מחט 18 G ומניחים אותו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי 1.5 מ"ל, אשר מכיל 100 μL של PBS סטרילי קר כקרח בתחתית.
   הערה: כמו רק שש עצמות יכול להתאים לתוך צינור microcentrifuge 0.5 מ"ל, מומלץ להכין ערכות צינור מספיק כדי לעבד את כל העצמות באותו זמן.
2. שאפו את ה-PBS והעבירו את העצמות המבודדות לצלחת סטרילית של 100 מ"מ של תרבית תאים. מחזיקים כל עצם באמצעות מלקחיים עדינים, חותכים בזהירות את האפיפיזות מכל קצה באמצעות מספריים קטנות שעוקרו במובלעת אוטומטית. מניחים את העצמות החתוכות בערכות הצינור המוכנות.
3. צנטריפוגה הצינורות ב 10,000 x g עבור 35 s ב 4 מעלות צלזיוס.
4. לאחר צנטריפוגה, לאשר כי מח העצם הוסר בהצלחה מן העצמות. עצמות אמורות להיראות לבנות ושקוף עם גלולה אדומה גדולה יחסית בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. השלך את צינור המיקרוצנטריפוגה של 0.5 מ"ל.
   הערה: אם הבדיקה החזותית לא מצליחה לזהות מח עצם בתחתית צינור 1.5 מ"ל, לחתוך את העצם שוב ולחזור על שלב 4.3.
5. Resuspend מח העצם ב 1 מ"ל של PBS קר כקרח, ולאחר מכן להעביר את השעיית התא מאותו גנוטיפ לצינור חרוט תואם 50 מ"ל.
6. לנתק את התאים על ידי העברת אותם דרך מחט 18 G עם מזרק 10 מ"ל 10 פעמים.
7. סנן מתלים של תא יחיד באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר. הוסיפו PBS קר כקרח לנפח סופי של 10 מ"ל, והשתמשו מחדש בתאים באמצעות שימוש עדין בסיוע פיפטה.
8. צנטריפוגה ב 310 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
9. לשאוף את supernatant ו resuspend גלולת התא עם 10 מ"ל של מדיה RPMI ללא סרום. חילוף 30 μL של חומר זה לספירת תאים.
10. לקבוע ריכוז התא עם מונה התא, ולחשב את נפח ההשעיה התא הנדרש עבור ההשתלה. לדוגמה של 100% BMT, 5 x 10 6 תאי מח^עצם נדרשים עבור כל עכבר נמען.
    הערה: עבור BMT תחרותי, להכין סך של 5 x 10 6 תאי מח עצם הכוללים^תערובת של תאים תורמים (למשל, CD45.2⁺) ותאים מתחרים (למשל, CD45.1⁺). מומלץ מאוד להכין תאי מח עצם נוספים. לדוגמה, אם קיימים 10 עכברים נמענים לכל קבוצת ניסוי, אנו מכינים בדרך כלל מספיק תאים עבור עכברים 12 נמענים.
11. להעביר את הנפח המחושב של השעיית התא לתוך צינור חרוט חדש 50 מ"ל. צנטריפוגה ב 310 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
12. לשאוף את supernatant ו resuspend התאים באמצעות כמות מחושבת של בינוני RPMI ללא סרום כדי להשיג את צפיפות התא המתאים ואת נפח. בדרך כלל, 200 μL הוא נפח אופטימלי עבור הזרקת רטרו מסלולית.

5. השתלת תאי מח עצם לעכברים מוקרנים

1. יש למרדים את העכברים המטופלים עם 5% isoflurane.
2. בעוד עכברים מורדמים, לאט להזריק 200 μL של תאי מח עצם לתוך הווריד רטרו מסלולית באמצעות מחט 28-30 G עם מזרק אינסולין.
   1. לחלופין, בצע את המסירה של התאים התורמים על ידי הזרקה תוך ורידי זנב והזרקה תוך-רפואית של הירך, עם נפח מרבי של 0.2 מ"ל ו- 25 μL, בהתאמה.
3. לאחר התאים מוזרקים, מניחים טיפה של טיפות עיניים המכילות proparacaine על פני השטח של העין להקלה על הכאב. לאחר מכן ניתן לאפשר לחיה לחזור להכרה.

6. השתלת תאי מח עצם לעכברים לא מותנים

1. יש למרדים את העכברים המטופלים על ידי שאיפה של 5% isoflurane.
2. הזרק 5 x^{10 6} תאי מח עצם לא מופרים מגנוטיפ רטרו-מסלול לעכברים שאינם מוקרנים עם מזרק אינסולין 28-30 G.
3. חזור על שלבים 6.1 ו 6.2 על פני 3 ימים רצופים, כך העכברים המטופל יושתלו עם סך של 1.5 x 10⁷ תאי מח עצם.
   הערה: מכיוון שה-BMT המאמץ ללא הליך טרום-מיזוג דורש השתלת מח עצם במשך 3 ימים רצופים, יש לנסות להחליף עיניים לכל זריקה.
4. לאחר ההזרקה, לנהל טיפה של טיפות עיניים המכילות proparacaine לעין המושפעת.

תוצאות

כדי להשוות את ההשפעה של שלוש שיטות BMT / טרום מיזוג על תחריט התא התורם, שברי תאים תורמים בדם היקפי ורקמת לב נותחו על ידי cytometry זרימה ב 1 חודש לאחר BMT. תאים מבודדים הוכתמו עבור סמני לויקוציטים ספציפיים כדי לזהות את קבוצות המשנה השונות של לויקוציטים. בניסויים אלה, תאי מח עצם תורמים מסוג בר(WT) C57BL/6 (CD45.2) הועברו ל-WT B6. SJL-Ptprc^aPrpc^b/ BoyJ (CD45.1) עכברים נמען להבחין תאים התורמים מתאי הנמען. אסטרטגיות גיטינג cytometry זרימה ששימשו מתוא...

דיון

במחקרים על hematopoiesis שיבוט, תיארנו שלוש שיטות של BMT: BMT עם הקרנה גוף כולל, BMT עם הקרנה עם מיגון חלקי, ושיטת BMT פחות נפוץ שאינו כרוך מיזוג מראש (BMT מאמץ). שיטות אלה שימשו כדי להעריך את ההשפעה של hematopoiesis שיבוט על מחלות לב וכלי דם. חוקרים יכולים לשנות שיטות אלה בהתאם כדי להתאים למטרה הספציפית של המחקר שלהם.

מודלים של המטופוזיס שיבוט
Hematopoiesis קלונל היא התופעה שבה תאים המוטנטים hematopoietic להתחרות עם תאים מסוג בר ולקבל דומיננטיות שיבוט לאורך זמן. כדי ליצור ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
0.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	05-408-121	אספקה כללית
1.5 מ"ל מיקרוצנטריפוגה	פישר סיינטיפיק	05-408-129	אספקה כללית
1/2 סמ"ק מזרק אינסולין LO-DOSE	EXELINT	26028	אספקה כללית
אתנול מוחלט (200 prfof)	פישר כימיקלים	200559	אספקה כללית
BD 1 מ"ל טוברקולין מזרקים 25 גרם 5/8 אינץ 'מחט	בקטון דיקינסון	309626	אספקה כללית
BD PrecisionGlide מחט 18G (1.22 מ"מ X 25 מ"מ)	Becton Dickinson	395195	אספקה כללית
צזיום-137 Irradiator	J. L. Shepherd	סימן IV	ציוד
DietGel 76A	Clear H2O	70-01-5022	אספקה כללית
פלקון 100 מ"מ TC-מטופל תרבית תאים צלחת	מדעי החיים	353003	אספקה כללית
פלקון 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים	פישר סיינטיפיק	352098	אספקה כללית
פישרברנד מסנני תאים סטריליים, 70 μ m	Fisher Scientific	22363548	אספקה כללית
Graefe מלקחיים	Fine Science Tools	11051-10	אספקה כללית
מספריים עדינים מוקשים	Fine Science Tools	14090-09	אספקה כללית
תמיסת איזותזיה (איזופלורן)	הנרי שיין	29404	תמיסה
קטמין	Zoetis	043-304	הזרקה
מגבי משימות עדינים	Kimwipes Kimtech Science	KCC34155	אספקה כללית
PBS pH7.4 (1X)	Gibco	10010023
Solution RadDisk – מכרסם Irradiator דיסק	Braintree Scientific	IRD-P M	אספקה כללית
RPMI בינוני 1640 (1X)	Gibco	11875-093
בינוני Sulfamethoxazole ו-Trimethoprim	TEVA	0703-9526-01	הזרקת
Xylazine	Akorn	139-236	הזרקת
רנטגן irradiator	מקור Rad	ציוד	RS-2000