הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים

4.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61884

⸱

27 באוקטובר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מספק שיטת עיכול יעילה של collagenase לבידוד של אדיפוציטים בני קיימא ותאי SVF של מקטע כלי דם סטרומה משומן בטני אנושי בתהליך יחיד, כולל מתודולוגיה להשגת RNA באיכות גבוהה מאדיפוציטים ופנוטיפפיקציה של SVF-מקרופאגים באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לממברנה לניתוח על ידי ציטומטריית זרימה.

תקציר

רקמת השומן הקרבי (VAT) היא איבר מטבולי פעיל המורכב בעיקר מאדיפוציטים בוגרים ותאי מקטע כלי דם סטרומליים (SVF), המשחררים מולקולות ביו-אקטיביות שונות השולטות בתהליכים מטבוליים, הורמונליים וחיסוניים; נכון לעכשיו, לא ברור כיצד תהליכים אלה מוסדרים בתוך רקמת השומן. לכן, פיתוח שיטות להערכת תרומתה של כל אוכלוסיית תאים לפתופיזיולוגיה של רקמת השומן הוא קריטי. פרוטוקול זה מתאר את שלבי הבידוד ומספק את הנחיות פתרון הבעיות הדרושות לבידוד יעיל של אדיפוציטים בוגרים ברי קיימא ו- SVF מביופסיות מע"מ אנושיות בתהליך יחיד, תוך שימוש בטכניקת עיכול אנזימטית של collagenase. יתר על כן, הפרוטוקול מותאם גם לזיהוי תת-קבוצות מקרופאגים ולביצוע בידוד RNA אדיפוציט בוגר למחקרי ביטוי גנים, המאפשר ביצוע מחקרים המנתחים את האינטראקציה בין אוכלוסיות תאים אלה. בקצרה, ביופסיות מע"מ נשטפות, טחונות באופן מכני ומתעכלות כדי ליצור תרחיף חד-תאי. לאחר הצנטריפוגה, אדיפוציטים בוגרים מבודדים על ידי הנפקה מכדורית SVF. פרוטוקול מיצוי ה-RNA מבטיח תפוקה גבוהה של סך ה-RNA (כולל miRNAs) מהאדיפוציטים לצורך בדיקות ביטוי במורד הזרם. במקביל, תאי SVF משמשים לאפיון תת-קבוצות מקרופאגים (פנוטיפ פרו ואנטי דלקתי) באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה.

מבוא

רקמת השומן הלבן מורכבת לא רק מתאי שומן או אדיפוציטים, אלא גם ממקטע תאי שאינו שומן המכונה מקטע כלי דם סטרומה (SVF), המכיל אוכלוסיית תאים הטרוגנית המורכבת ממקרופאגים, תאי חיסון אחרים כתאי T רגולטוריים (Tregs), ואאוזינופילים, פרדיפוציטים ופיברובלסטים, המוקפים ברקמת כלי דם וחיבור 1,2. רקמת השומן (AT) נחשבת כיום לאיבר המווסת תהליכים פיזיולוגיים הקשורים לחילוף חומרים ודלקת באמצעות אדיפוקינים, ציטוקינים ומיקרו-רנ"א המיוצרים ומשוחררים על ידי תאים שונים לתוך הרקמה, עם השפעות אוטוקריניות, פרקריניות ואנדוקריניות 3,4. בבני אדם, רקמת השומן הלבן כוללת את רקמת השומן התת עורית (SAT) ואת רקמת השומן הקרבית (VAT), עם הבדלים אנטומיים, מולקולריים, תאיים ופיזיולוגיים חשובים ביניהן 2,5. SAT מייצג עד 80% של AT, בעוד מע"מ ממוקם בתוך חלל הבטן, בעיקר mesentery ו omentum, להיות פעיל יותר מטבולית6. יתר על כן, מע"מ הוא איבר אנדוקריני המפריש מתווכים בעלי השפעה משמעותית על משקל הגוף, רגישות לאינסולין, חילוף חומרים של שומנים ודלקות. כתוצאה מכך, הצטברות מע"מ מובילה להשמנה בטנית ולמחלות הקשורות להשמנת יתר כגון סוכרת מסוג 2, תסמונת מטבולית, יתר לחץ דם וסיכון למחלות לב וכלי דם, המייצגים מנבא טוב יותר לתמותה הקשורה להשמנת יתר 6,7,8,9.

בתנאים הומיאוסטטיים אדיפוציטים, מקרופאגים ותאי חיסון אחרים משתפים פעולה כדי לשמור על חילוף החומרים של מע"מ באמצעות הפרשת מתווכים אנטי דלקתיים10. עם זאת, הרחבת מע"מ מוגזמת מקדמת גיוס של תאי T פעילים, תאי NK ומקרופאגים. למעשה, במע"מ רזה, היחס בין המקרופאגים הוא 5%, בעוד שיחס זה עולה עד 50% בהשמנת יתר, כאשר קיטוב המקרופאגים מפנוטיפ אנטי דלקתי לפנוטיפ פרו-דלקתי, יוצר סביבה דלקתית כרונית10,11.

כתוצאה ממגפת ההשמנה, מספר מדהים של דיווחים עלו המתייחסים לנושאי מחקר שונים של מע"מ, כולל ביולוגיה של אדיפוציטים, אפיגנטיקה, דלקת, תכונות אנדוקריניות ואזורים מתפתחים כמו שלפוחיות חוץ-תאיות, בין היתר 8,10,12,13. עם זאת, למרות שסביבת המע"מ מוגדרת על ידי הצלבה בין אדיפוציטים לבין המקרופאגים המתגוררים או המגיעים, רוב המחקרים התמקדו באוכלוסיית תאים אחת בלבד, ויש מידע מועט על האינטראקציה של תאים אלה במע"מ והשלכותיהם הפתופיזיולוגיות11,14. יתר על כן, מחקרים יקרי ערך העוסקים ביחסי הגומלין בין אדיפוציט-מקרופאגים ב-AT בוצעו באמצעות קווי תאים, ללא תנאי הפריימינג in vivo 11,14,15. אסטרטגיה מתאימה לנתח את האינטראקציה או את התרומה המסוימת של תאים אלה במע"מ דורשת בידוד של שני סוגי התאים מאותה ביופסיית שומן כדי לבצע בדיקות במבחנה המשקפות דומות ככל האפשר את תכונות in vivo המווסתות את חילוף החומרים במע"מ.

למרות ששיטות הדיסוציאציה הלא-אנזימטיות המבוססות על כוחות מכניים לשבירת ה-AT מבטיחות מניפולציה מינימלית, לא ניתן להשתמש בשיטות אלה אם המטרה היא לחקור תאי SVF, מכיוון שיש להם יעילות נמוכה יותר בשחזור תאים ויכולת קיום נמוכה של תאים בהשוואה לשיטות אנזימטיות, ויש צורך בנפח רקמה גדול יותר16,17. עיכול אנזימטי באמצעות collagenase היא שיטה עדינה המאפשרת עיכול נאות של קולגן וחלבוני מטריצה חוץ תאיים של רקמות סיביות כגון WAT18 והוא משמש לעתים קרובות כאשר טריפסין אינו יעיל או מזיק19. הפרוטוקול מספק הנחיות בסיסיות לפתרון בעיות לבידוד יעיל של אדיפוציטים בוגרים ותאי SVF ברי קיימא מביופסיות מע"מ אנושיות בתהליך יחיד, תוך שימוש בטכניקת עיכול אנזימטי של קולגן-אז, ומספק מידע כדי להבטיח תפוקות גבוהות (כמות, טוהר ושלמות) של סך כל הרנ"א מאדיפוציטים בוגרים, כולל מיקרו-רנ"א, עבור יישומי ביטוי במורד הזרם. במקביל, הפרוטוקול מותאם לזיהוי תת-קבוצות מקרופאגים מתאי SVF באמצעות צביעה של סמנים מרובים הקשורים לקרום לצורך ניתוח נוסף על ידי ציטומטריית זרימה20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

פרוטוקול זה אושר על ידי IRB של המכון הלאומי לפרינטולוגיה (212250-3210-21002-06-15). ההשתתפות הייתה מרצון, וכל הנשים שנרשמו חתמו על טופס הסכמה מדעת.

1. איסוף רקמות שומן בטני

  1. קבלת ביופסיות מע"מ באמצעות כריתה חלקית במהלך ניתוח קיסרי מנשים בוגרות בריאות עם הריונות סינגלטון במועד ללא לידה.
  2. לאחר סגירת הרחם hemostasis, להמשיך לזהות omentum גדול יותר ולהרחיב אותו על דחיסה רטובה. ה-AT החשוף הוא מע"מ.
  3. אתר את כלי הדם הגדול ביותר ועקוב אחר קו דמיוני של 7 x 5 ס"מ לבסיס omentum גדול יותר.
  4. זהה אזור אווסקולרי והשתמש במלקחיים של קלי כדי לקדוח את הצד החיצוני של המע"מ.
  5. השתמשו במלקחיים של אוקסנר כדי להדק את הצד הפרוקסימלי והדיסטלי באזור שבו קודחו מע"מ והשתמשו במספריים של מצנבאום כדי לחתוך את הרקמה.
  6. לקשור omentum גדול עם משי שחור מספר 1.
  7. הסר מלקחיים אוקסנר ולהעריך את hemostasis.
  8. הכניסו את ביופסיית המע"מ למיכל סטרילי והעבירו אותה מיד למעבדה.

2. עיכול אנזימטי של רקמת שומן הקרביים ובידוד של אדיפוציטים בוגרים ותאי שבר כלי דם סטרומה

  1. שוקלים את ביופסיית המע"מ ושוטפים עם 1x PBS pH 7.4.
  2. חותכים 4 גרם מע"מ ומשתמשים במספריים כדי לטחון את הרקמה לחתיכות קטנות במגש דיסקציה.
  3. מעבירים מע"מ טחון לצינור צנטריפוגה סטרילי של 50 מ"ל, מוסיפים 20 מ"ל PBS ומנערים בעדינות כדי להסיר את עודף תאי הדם האדומים.
  4. בטל PBS וחזור על ההליך פעמיים.
  5. מעבירים מע"מ לצינור צנטריפוגה סטרילי חדש של 50 מ"ל ומוסיפים 25 מ"ל של תמיסת עיכול (0.25% קולגנאז סוג II, 5 מ"מ גלוקוז, 1.5% אלבומין ב-PBS).
  6. דגירה ב-37°C למשך 60 דקות בשייקר מסלולי, ב-125 סל"ד.
  7. מסננים את הרקמה המעוכלת דרך שלוש שכבות של גזה לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי חדש של 50 מ"ל.
  8. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  9. מתקבלים שני שלבים, שלב עליון המתאים לאדיפוציטים בוגרים, בעוד תאי SFV נשארים בכדור. מעבירים בעדינות את האדיפוציטים הבוגרים לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי חדש של 50 מ"ל באמצעות פיפטת העברה.
  10. הוסף 20 מ"ל של PBS קר, נער בעדינות וצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  11. בטל PBS וחזור על ההליך פעמיים.
  12. השתמש פיפטה העברה כדי להעביר בעדינות את האדיפוציטים הבוגרים לתוך 1.5 מ"ל DNase-RNase חינם microcentrifuge צינור.
  13. צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C ולהסיר את PBS עודף באמצעות מיקרופיפטה P200. חזור על שלב זה במידת הצורך.
  14. העבר בעדינות 300 μL של תרחיף אדיפוציט בוגר לתוך 1.5 מ"ל DNase-RNase חינם צינורות microcentrifuge. אחסנו אדיפוציטים בוגרים בטמפרטורה של -80°C עד למיצוי RNA.
    הערה: אדיפוציטים אינם יוצרים כדור.
  15. לאחר הפרדת האדיפוציטים (שלב 2.9), שאפו את רוב תמיסת העיכול עם פיפטת העברה, תוך שמירה על כדורית SVF בתחתית הצינור.
  16. מעבירים את הגלולה עם תאי SVF לצינור צנטריפוגה חדש של 50 מ"ל באמצעות פיפטת העברה.
  17. יש לשטוף את גלולת התא בעדינות, תוך השעיה מחדש של 20 מ"ל של PBS קר 1x על ידי פיפטינג למעלה ולמטה.
  18. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C במהירות להשליך את supernatant על ידי decantation.
  19. בצע שטיפה שנייה על ידי חזרה על שלבים 2.17 ו- 2.18.
  20. הוסף 5 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים השווה לטמפרטורת החדר (RT) לגלולת SVF והשהה על ידי פיפטינג חוזר. אין לערבל.
  21. דגירה במשך 5 דקות ב- RT וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב- 800 x גרם. בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה העברה ולהשליך כראוי.
  22. כדי לנטרל את מאגר הליזיס, הוסיפו 10 מ"ל של PBS קר 1x וערבבו בעדינות עד שכדור התא מתפרק.
  23. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות כדי לקבל גלולת SVF ולהשליך PBS. גלולה לבנה צריכה להיות גלויה בתחתית הצינור.
  24. תאי השהיה מחדש ב 5 מ"ל של 1x PBS ב RT על ידי פיפטינג חוזר וסינון דרך שלוש שכבות של גזה לתוך צינור חרוטי חדש 50 מ"ל. לאחר מכן, תאים אלה ישמשו לאפיון תת-אוכלוסיית מקרופאגים לפי ציטומטריית זרימה.

3. מיצוי RNA מאדיפוציטים בוגרים

  1. הכינו אזור נקי, באמצעות תרסיס טיהור RNase כדי למנוע התפרקות RNA. השתמש קבוצה של פיפטות שמורות עבור הליכי RNA. כל הצינורות והטיפים המועסקים צריכים להיות נטולי RNase.
  2. הפשיר את תרחיף האדיפוציט הבוגר (סעיף 2.14) ב 4 ° C אם הוא מאוחסן ל -80 ° C.
    הערה: הימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה מרובים.
  3. תאי ליז על ידי הוספת 1,000 μL של מגיב מבוסס חומצה-גואנידיניום-פנול, ומערבבים היטב עם מיקרופיפטה P1000 כדי ליצור הומוגניז.
  4. דגירה במשך 5 דקות ב- RT כדי להגביר את הדיסוציאציה של קומפלקסים נוקלאופרוטאינים.
  5. צנטריפוגה תא ליזט במשך 5 דקות ב 12,000 x גרם ב RT. יתקבלו שלושה שלבים: שלב עליון (צהוב) המתאים לשומנים אדיפוציטיים, שלב אמצעי (ורוד) המתאים לחומצות גרעין, וגלולה (פסולת תאית).
  6. בזהירות להסיר את שכבת השומנים, באמצעות micropipette P200.
  7. מעבירים את השלב האמצעי לצינור חדש של 2 מ"ל, תוך הימנעות משאריות שומנים והפרעה כדורית (כ-700 מיקרוליטר).

4. טיהור סך כל הרנ"א, כולל מיקרו-רנ"א

הערה: שיטת טיהור RNA כוללת מבוססת עמודות משמשת להשגת RNA כולל באיכות גבוהה.

  1. מוסיפים נפח שווה של אתנול (95%-100%) לדגימה מסעיף 3.7, בערך 700 מיקרוליטר, ומערבבים ביד היפוך הצינור במשך 10 שניות.
  2. מעבירים 700 μL מהתערובת לעמוד המוכנס לצינור איסוף, צנטריפוגה ומשליכים את הזרימה.
  3. טען מחדש את העמודה וחזור על שלב 4.2.
  4. העבר את העמודה לצינור איסוף חדש.
  5. הוסף 400 μL של חיץ טרום שטיפה לעמוד ולצנטריפוגה. מחק את הזרימה וחזור על שלב זה.
  6. הוסיפו 700 מיקרוליטר של חיץ כביסה לעמוד ולצנטריפוגה למשך 2 דקות.
  7. העבירו את העמוד בזהירות לתוך צינור ללא נוקלאז.
  8. הוסף 50 μL של מים נטולי נוקלאז ישירות למטריצת העמוד ומחק את הרנ"א באמצעות צנטריפוגה. להכין aliquots של 10 μL באמצעות צינורות microfuge 200 μL.
  9. מיד לשים aliquots על קרח ולהשתמש באחד מהם כדי לקבוע ריכוז RNA וטוהר.
  10. הכינו אליציטוט של 5 מיקרוליטר של סך כל הרנ"א המותאם ל-100 ננוגרם/מיקרוליטר כדי למדוד את שלמות הרנ"א ואת ריכוז המיקרו-רנ"א.
  11. יש לאחסן בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.

5. קביעת ריכוז, טוהר ושלמות RNA אדיפוציטי בשל; בדיקת כימות מיקרו-רנ"א

הערה: קביעת ריכוז RNA וטוהר מבוצעת באמצעות ספקטרופוטומטר UV-Vis; שלמות ה-RNA וכימות ה-miRNA מבוצעים באמצעות מנתח בקרת איכות RNA.

  1. שטפו את קורא הדגימות במים מולקולריים ונגבו.
  2. טען 2 μL של מים elution (ריק), לשנות את ההגדרה RNA, ולחץ על כפתור ריק .
  3. טען 2 μL של מדגם ולחץ על כפתור מדידה .
  4. לאחר השלמת הקריאה, רשמו את יחסי A260/A280 ו-A260/A230 וכן את כמות הרנ"א (ng/μL) (איור 1A).
    הערה: RNA עם יחס OD260/OD280 ו-OD260/OD230 סביב 2.0 נחשב טהור.
  5. מדוד את מספר תקינות הרנ"א (RIN) באמצעות ערכת תקינות RNA בהתאם להוראות היצרן (איור 1B).
    הערה: RIN = 10 מתאים לרנ"א שלם, בעוד RIN ≤ 3.0 מציין RNA מפורק מאוד. עבור מיקרו-מערכי ביטוי או RT-qPCR, השתמש ב-RNA עם RIN ≥ 6.0.
  6. השתמשו בערכת רנ"א קטנה כדי לקבוע את הריכוז והאחוזים של מיקרו-רנ"א, בהתאם להוראות היצרן (איור 1C).
    הערה: כדי למנוע הערכת יתר של רנ"א קטן ומיקרו, השתמש בדגימות RNA עם RIN ≥ 6.0.

6. ספירה וכדאיות של תאי שבר כלי דם סטרומה

  1. יש לדלל 10 μL של תרחיף תאי SVF (סעיף 2.24) ל-90 μL של 0.4% Trypan Blue Solution (דילול סופי 1:10) ולמרוח 10 μL על המוציטומטר סטנדרטי.
  2. ספרו בזהירות את התאים בני הקיימא, למעט התאים המתים, בארבעה ריבועים בפינת תא הספירה.
  3. קבע את ריכוז התא הקיים בתרחיף המקורי: ריכוז תאים = ספירת תאים כוללת/4 x גורם דילול (10) x 10,000 = תאים/מ"ל
  4. כדי לחשב את התפוקה התאית (תאים לגרם רקמה) המתקבלת, יש להכפיל את ריכוז התאים בנפח הדגימה הכולל המקורי (במ"ל) ולחלק במשקל הרקמה המעוכלת (בגרמים).
  5. הערך את כדאיות התא כאחוז התאים החיים באופן הבא: % כדאיות = (מספר התאים בני קיימא / מספר התאים הכולל) x 100.

7. אפיון תת-קבוצות מקרופאגים ממקטע כלי דם סטרומה

  1. העבר סך של 1 x 106 תאי SVF / מ"ל למבחנה 5 מ"ל פוליפרופילן עגול תחתית עבור ציטומטריית זרימה ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  2. מערבולת בזהירות כדי לשחרר את הגלולה ולהשעות מחדש את התאים ב 100 μL של 1x PBS ב RT.
  3. הוסף ריכוז אופטימלי מראש של כל נוגדן חד-שבטי מצומד פלואורוכרום ספציפי לאנטיגן פני התא; מערבבים בעדינות ודגרים במשך 15 דקות בחושך ב-RT.
  4. הוסף עודף של 1x PBS קר (≈ 1 מ"ל) וצנטריפוגה את SVF ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  5. השליכו סופרנאטנטים במהירות על ידי הקנטה. היזהר לא להפריע את הכדור.
  6. הוסף 500 μL של תמיסת ליסינג 1x ודגר 15 דקות ב- RT, תוך הגנה על הצינורות מפני אור ישיר.
  7. הסר את התמיסה לאחר צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ואחסן ב 2-8 ° C בחושך עד איסוף נתונים.
  8. מערבלים את התאים ביסודיות במהירות נמוכה כדי להפחית את הצבירה לפני הרכישה.
  9. השהה מחדש את גלולת SVF ב -5 מ"ל של נוזל נדן ב- RT, ולאחר מכן סנן דרך שלוש שכבות של גזה למבחנה חדשה של 5 מ"ל פוליפרופילן בתחתית עגולה לפני ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה, כדי להפחית סתימת קווי מיון התא.
  10. מערבול כל צינור בקצרה לפני הניתוח.
  11. לרכוש נתונים מן הדגימות של עניין. עבור ניתוח זרימה, ספור מינימום של 10,000 אירועים.
    הערה: אם אתם משתמשים בציטומטר זרימה למיון תאים, הפרידו את המקרופאגים ליישום במחקרים הבאים.

8. אסטרטגיית גאטינג

  1. התווה את הגובה או הרוחב כנגד השטח עבור פיזור קדימה (FSC) כדי לקבוע את אוכלוסיית הסינגלט (איור 2A).
  2. בחרו תאים שמשרטטים את האזור עבור פיזור צד (SSC) כנגד FSC, ומשליכים את הפסולת התאית (איור 2B).
  3. מתוך תאים נבחרים, זהו את האוכלוסיות המבטאות CD45 כתאים המטופויטיים (איור 2C), ואת התאים החיוביים הכפולים CD45/CD14 כמקרופאגים (איור 2D).
  4. ממקרופאגים CD45+/CD14+, מזהים תאי HLA-DR שליליים וחיוביים (איור 2E).
    הערה: כלול את בקרות הפיצוי עבור לוח הנוגדנים והתאם את החפיפה הספקטרלית בציטומטר זרימה רב-צבעוני המתאים ללוח. אנו מבצעים ניתוח ציטומטריית זרימה באמצעות ציטומטר המצויד בשלושה לייזרים (לייזר סגול 405 ננומטר, לייזר כחול 488 ננומטר ולייזר אדום 640 ננומטר), וגלאים עבור הפלואורוכרום המצוין.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר שיטה אנזימטית המשתמשת בעיכול collagenase ואחריו צנטריפוגה דיפרנציאלית כדי לבודד, בתהליך יחיד, אדיפוציטים בוגרים קיימא ותאי SVF מביופסיות מע"מ המתקבלות מנשים הרות בריאות לאחר כריתה חלקית. במקרה זה, אנו משתמשים באדיפוציטים עבור מיצוי RNA וב- SVF עבור פנוטיפ מקרופאגים.

פרוטוקול מיצוי הרנ"א איפשר לקבל רנ"א בשלמות גבוהה ברמת טוהר נאותה, ומיקרו-רנ"א מאדיפוציטים בוגרים (איור 1). שלמות ה-RNA שהוערכה על ידי מנתח בקרת איכות RNA הביאה לערכים מצוינים עבור דגי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

מע"מ משחק תפקיד מכריע בוויסות מטבולי ודלקת. העניין הגובר בתפקידם של אדיפוציטים ותאי מערכת החיסון בדלקת הכרונית הקשורה להשמנת יתר הוביל לפיתוח טכניקות שונות להפרדת תאי SVF ושומן הנמצאים ב- AT. עם זאת, רוב הטכניקות אינן מאפשרות להשיג את שתי קבוצות התאים השונות הללו הניתנות ליישום במורד הזרם מאותה ביופסיית מע"מ בהליך יחיד, אשר עשוי להיות חיוני למחקרים הנוגעים לאינטראקציות בין אדיפוציטים ותאי SVF. לכן, יישמנו פרוטוקול זה המספק תיאור מפורט לבידוד אדיפוציטים בוגרים ברי קיימא ותאי SVF הנמצאים בביופסיית VAT. הוא שונה מדיווחים קו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי לפרינטולוגיה (מספרי מענקים: 3300-11402-01-575-17 ו- 212250-3210-21002-06-15) ו- CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (מספר מענק 2015-3-2-61661).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צינורות PCR 0.2 מ"לAxygenPCR-02-CRNase, צינורות מיקרוצנטריפוגה ללא DNase ולא פירוגניים
1.5 מ"לAxygenMCT-150-CRNase, ללא DNase ולא פירוגני
10 מ"ל פיפטות סרולוגיותקורנינגCLS4101-50EAעטוף בנפרד בניילון
10 ומיקרו; L קצה פיפט אוניברסליAxygenT-300-L-RRNase, נטול DNase ולא פירוגני
10 ומיקרו; L קצה פיפט אוניברסליAxygenT-300-R-SRNase, נטול DNase ולא פירוגני
1000 ומיקרו; L קצה פיפט אוניברסליAxygenT-1000-B-RRNase, צינור מיקרוצנטריפוגה נטול DNase ולא פירוגני
2.0 מ"לAxygenMCT-200-CRNase, ללא DNase ולא פירוגני
200 ומיקרו; L קצה פיפט אוניברסליAxygenT-200-Y-RRNase, ללא DNase ולא פירוגני
2100 מכשיר ביו-אנלייזרAgilentG2939BA-2101
Bioanalyzer PCAgilentG2953CA 2100 Expert Software מותקנת מראש במחשב
5 מ"ל מבחנה פוליסטירן תחתון עגולקורנינג352003 פקק נצמד, סטרילי
צינורות צנטריפוגה 50 מ"לקורנינגCLS430828-100EAפוליפרופילן, תחתית חרוטית וסטרילית
מגיב מבוסס חומצה-גואנידיניום-פנולZymo ResearchR2050-1-200TRI Reagent או דומה
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511-Agilent
ערכת RNA קטנהAgilent5067-1548-APC
/Cy7 נוגדן CD14 אנטי אנושיBioLegend3256200.4 מ"ג/106 תאים, קיים על מונוציטים/מקרופאגים, שיבוט HCD14
Baker-250 מ"ל,
אלבומין סרום בקרSigma-AldrichA3912-100Gמקטע הלם חום, pH 5.2, ≥ 96%
תחנת תחול שבבAgilent5065-9951-קולגנאז
סוג IIGibco17101-015אבקה
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G8270-100Gאבקת
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051מסופק עם 50 מ"ל TRI reagen
מלקחיים לניתוח-פלדה, לסתות משוננות ועגולות מסתיים
מגש חיתוך-נירוסטה
אלכוהול אתיליסיגמא-אולדריץ'E7023-500ML200  הוכחה, לביולוגיה מולקולרית
FACS Flow Sheath Fluid BDBiosciences342003-FACS
Lysing SolutionBD Biosciences
349202-FACSAria III Flow Cytometer/Cell SorterBD Biosciences
648282-FASCDiva SoftwareBD Biosciences642868Software v6.0 Hemacytometer Sigma מותקן מראש
Z359629-1EA-
מונה תאים ידני---
מספריים לניתוח מאיו-
מיקרוצנטריפוגה-טמפרטורה מתכווננת
NanodropThermo ScientificND2000LAPTOP-
שייקר אורביטלי-טמפרטורה ומהירות מתכווננות
עמ' 10  נפח משתנה  מיקרופיפטה Thermo Scientific-Finnpipette46420401 עד 10 μ L
P1000  נפח משתנה  מיקרופיפטה Thermo Scientific-Finnpipette4642090100 עד 1000 μ L
P2  נפח משתנה  מיקרופיפטה Thermo Scientific-Finnpipette46420100.2 עד 2 μ L
P200  נפח משתנה  מיקרופיפטה Thermo Scientific-Finnpipette464208020 עד 200 μ
מתלה אחסון צינור L PCRAxygenR96PCRFSP-PE
/Cy5 אנטי אנושי נוגדן HLA-DRBioLegend3076080.0625 מ"ג/106 תאים, קיים על מקרופאגים, שיבוט L243
PE/Cy7 אנטי-אנושי CD45 נוגדןBioLegend3040160.1 מ"ג/106 תאים, קיים על לויקוציטים, שיבוט H130
פוספט חוצץ מלחאבקת Sigma-AldrichP3813-10PAK, pH 7.4, להכנת תמיסות 1 ליטר
בקר פיפטה---
מאגר ליזה של תאי דם אדומיםRoche11 814 389 001לליזה מועדפת של כדוריות דם אדומות מדם מלא אנושי
צנטריפוגה מקוררת-מתאם לבן לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל
מיכל דגימה סטרילי---
העברת פיפטהThermo Scientific-Samco204-1Sסטרילי
טריפן כחולGibco15250-0610.4% מדפי צינור תמיסה
-לגדלים שונים של צינורות
מערבולת מיני שייקרCientifica SENNABV101-
לא סטרילי מנירוסטה ספקטרופוטומטר

מקורות

  1. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Barchetta, I., Cimini, F. A., Ciccarelli, G., Baroni, M. G., Cavallo, M. G. Sick fat: the good and the bad of old and new circulating markers of adipose tissue inflammation. Journal of Endocrinological Investigation. 42 (11), 1257-1272 (2019).
  4. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  5. Ronquillo, M. D., et al. Different gene expression profiles in subcutaneous and visceral adipose tissues from Mexican patients with obesity. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 616-626 (2019).
  6. Mittal, B. Subcutaneous adipose tissue and visceral adipose tissue. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 571-573 (2019).
  7. West-Eberhard, M. J. Nutrition, the visceral immune system, and the evolutionary origins of pathogenic obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (3), 723-731 (2019).
  8. Kaminski, D. A., Randall, T. D. Adaptive immunity and adipose tissue biology. Trends in Immunology. 31 (10), 384-390 (2010).
  9. Elffers, T. W., et al. Body fat distribution, in particular visceral fat, is associated with cardiometabolic risk factors in obese women. PLoS One. 12 (9), 0185403(2017).
  10. Macdougall, C. E., et al. Visceral adipose tissue immune homeostasis is regulated by the crosstalk between adipocytes and dendritic cell subsets. Cell Metabolism. 27 (3), 588-601 (2018).
  11. Sarvari, A. K., et al. Interaction of differentiated human adipocytes with macrophages leads to trogocytosis and selective IL-6 secretion. Cell Death & Disease. 6 (1), 1613(2015).
  12. Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-A potential role in obesity and type 2 diabetes. Frontiers in Endocrinology. 8 (1), Lausanne. 202(2017).
  13. Crujeiras, A. B., et al. Genome-wide DNA methylation pattern in visceral adipose tissue differentiates insulin-resistant from insulin-sensitive obese subjects. Translational Research. 178 (1), 13-24 (2016).
  14. Surmi, B. K., Hasty, A. H. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidology. 3 (5), 545-556 (2008).
  15. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  16. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015(2017).
  17. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (1), 88(2019).
  18. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (2), 189-199 (2015).
  19. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2016).
  20. Bravo-Flores, E., et al. Macrophage populations in visceral adipose tissue from pregnant women: potential role of obesity in maternal inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 1074(2018).
  21. Conde-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017(2016).
  22. Oberbauer, E., et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration. 4 (7), London, England. 1-14 (2015).
  23. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  24. Winnier, G. E., et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One. 14 (9), 0221457(2019).
  25. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and potentiality of human adipose-derived stem cells (hASCs) obtained from enzymatic digestion of fat graft. Cells. 8 (3), 282(2019).
  26. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 50-59 (2012).
  27. Lockhart, R., Hakakian, C., Aronowitz, J. Tissue dissociation enzymes for adipose stromal vascular fraction cell isolation: a review. Journal of Stem Cell Research & Therapy. 5 (12), 1000321(2015).
  28. Condé-Green, A., et al. Comparison between stromal vascular cells' isolation with enzymatic digestion and mechanical processing of aspirated adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 134 (4), 54(2014).
  29. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  30. Aguena, M., et al. Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies. Stem cells international. 2012 (1), 303610(2012).
  31. Yang, X. F., et al. High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Science. 18 (1), 59(2011).
  32. Conde-Green, A., et al. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 30 (2), 249-255 (2010).
  33. Hoareau, L., et al. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (5), 712-719 (2013).
  34. Xie, Y., et al. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (3), 482-487 (2010).
  35. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  36. Kanneganti, T. D., Dixit, V. D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology. 13 (8), 707-712 (2012).
  37. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Molecular Aspects of Medicine. 34 (1), 1-11 (2013).
  38. Raajendiran, A., Tsiloulis, T., Watt, M. J. Adipose tissue development and the molecular regulation of lipid metabolism. Essays in Biochemistry. 60 (5), 437-450 (2016).
  39. Rostam, H. M., et al. The impact of surface chemistry modification on macrophage polarisation. Immunobiology. 221 (11), 1237-1246 (2016).
  40. Chamberlain, L. M., Holt-Casper, D., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2864-2874 (2015).
  41. Williams, M. R., Cauvi, D. M., Rivera, I., Hawisher, D., De Maio, A. Changes in macrophage function modulated by the lipid environment. Innate Immunity. 22 (3), 141-151 (2016).
  42. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012 (1), 812693(2012).
  43. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00212(2015).
  44. van Harmelen, V., et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 27 (8), 889-895 (2003).
  45. Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA isolation from adipose tissue: an optimized procedure for high RNA yield and integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
  46. Mendez, V., et al. A rapid protocol for purification of total RNA for tissues collected from pigs at a slaughterhouse. Genetics and Molecular Research. 10 (4), 3251-3255 (2011).
  47. Pena, R. N., Canovas, A., Estany, J. Technical note: Efficient protocol for isolation of total ribonucleic acid from lyophilized fat and muscle pig samples. Journal of Animal Science. 88 (2), 442-445 (2010).
  48. Pratt, S. L., Burns, T. A., Owens, M. D., Duckett, S. K. Isolation of total RNA and detection procedures for miRNA present in bovine-cultured adipocytes and adipose tissues. Methods in Molecular Biology. 936 (1), 181-194 (2013).
  49. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472(2013).
  50. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  51. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages. Methods in Enzymology. 537 (1), 297-314 (2014).
  52. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  53. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 142-150 (2015).
  54. Nicoletti, G. F., De Francesco, F., D'Andrea, F., Ferraro, G. A. Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine. Journal of Cellular Physiology. 230 (3), 489-495 (2015).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  56. Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (18), 4252-4260 (2017).
  57. Silva, K. R., et al. Characterization of stromal vascular fraction and adipose stem cells from subcutaneous, preperitoneal and visceral morbidly obese human adipose tissue depots. PLoS One. 12 (3), 0174115(2017).
  58. Wankhade, U. D., Shen, M., Kolhe, R., Fulzele, S. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells International. 2016 (1), 3206807(2016).
  59. Zavan, B., et al. Persistence of CD34 stem marker in human lipoma: searching for cancer stem cells. International Journal of Biological Sciences. 11 (10), 1127-1139 (2015).
  60. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Frontiers in Immunology. 5 (1), 683(2014).
  61. Liddiard, K., Taylor, P. R. Understanding local macrophage phenotypes in disease: shape-shifting macrophages. Nature Medicine. 21 (2), 119-120 (2015).
  62. Prieur, X., et al. Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice. Diabetes. 60 (3), 797-809 (2011).
  63. Wang, H., et al. CD68(+)HLA-DR(+) M1-like macrophages promote motility of HCC cells via NF-kappaB/FAK pathway. Cancer Letters. 345 (1), 91-99 (2014).
  64. Yamamoto, Y., et al. Decreased human leukocyte antigen-DR expression in the lipid raft by peritoneal macrophages from women with endometriosis. Fertility and Sterility. 89 (1), 52-59 (2008).
  65. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5 (1), 514(2014).
  66. Perdiguero, E. G., Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 2-8 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA
בידוד אדיפוציטים בני קיימא ומקטע כלי דם סטרומלי מרקמת השומן הקרבית האנושית המתאימה לניתוח RNA ופנוטיפ מקרופאגים
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.