מאמר שיטה

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

DOI:

10.3791/61890

⸱

22 בדצמבר 2020

 ,  , 
1Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, Goettingen, Germany, 2DZHK (German Center for Cardiovascular Research), Partner Site Goettingen, Germany, 3Cairn Research Ltd, Faversham, United Kingdom, 4Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Goettingen, Germany

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים רכישה אופטית ואפיון של פוטנציאל פעולה מתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית במהירות גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות מיקרו-אלקטרוקטרודה תאיות קונבנציונליות לכימות אלקטרופיזיולוגיה של קרדיומיוצית הן מורכבות ביותר, עתירות עבודה, ובדרך כלל מבוצעות בתפוקה נמוכה. התרחבות מהירה ומתמשכת של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC) מציגה סטנדרט חדש במחקר לב וכלי דם ושיטות חלופיות נחוצות כעת כדי להגדיל את התפוקה של נתונים אלקטרופיזיולוגיים ברמת תא אחד. VF2.1Cl הוא צבע רגיש למתח שנגזר לאחרונה המספק ערוץ יחיד מהיר, תגובה בעוצמה גבוהה לתנודות בפוטנציאל הממברנה. יש לו קינטיקה עדיפה על אלה של מחווני מתח קיימים אחרים ועושה נתונים פונקציונליים זמינים שוות ערך לזה של טכניקות מיקרו-ectrode מסורתיות. כאן, אנו מדגימים אפיון פוטנציאלי פעולה פשוטה ולא פולשנית ב cardiomyocytes אנושיים בקצב חיצוני באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית ובמחיר סביר מאוד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מידול אלקטרופיזיולוגי של קרדיומיוציטים ובניית פלטפורמות יעילות להקרנת תרופות לב חיוניות לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למגוון הפרעות קצב. התרחבות מהירה של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרה (iPSC) יצרה חדירה מבטיחה למידול מחלות אנושיות ולחקירה פרמקולוגית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בחולה מבודד (iPSC-CM). טכניקות "תקן זהב" לאפיון אלקטרופיזיולוגי של תאים אלה באמצעות מהדק תיקון (מהדק זרם) יכולות לכמת את פוטנציאל הפעולה (AP) מורפולוגיה ומשך זמן, עם זאת, שיטה זו מורכבת ואיטית להפליא, ואינה מתאימה לרכישת נתוני תפוקה גבוהה1. iPSC-CMs מדווחים באופן קבוע יש פוטנציאל ממברנה דיאסטולית מוגברת וזרם דליפה מוגבר בהשוואה לקרדיומיוציטים ילידים למבוגרים2. הוא הציע כי גודל תא קטן יותר קיבוליות ממברנה מופחתת שנצפו iPSC-CMs עלול לייצר כמה שגיאה שיטתית בעת שימוש בטכניקת מלחציים הנוכחי, אולי להסביר את הסטיות האלה3. על מנת למקסם את התועלת של פלטפורמת iPSC-CM, שיטה נוספת היא בעלת ערך כדי להגדיל את התפוקה ולהבטיח דיוק נתונים בעת אפיון שינויי מתח transmembrane ברמת תא יחיד ב- iPSC-CMs.

צבעים רגישים למתח (VSD) כבר זמן רב שיטה מוצעת כדי לספק ניתוח מהיר יותר, לא פולשני שווה ערך של קינטיקה AP לב בהשוואה לאלה של טכניקות מסורתיות4. מחקר שנערך לאחרונה הדגים את ההתאמה של פוטומטריה רגישה למתח רציטרי כדי לכמת במדויק את AP הלב5. יתר על כן, היכולת להגדיל בקלות את הגישות פוטומטריה אופטית מעניק טכניקה זו בקנה מידה גדול מסכי cardiotoxicity קריטי בפיתוח תרופות טיפוליות (למשל, CiPA). פיתוח פרוטוקולי cardiotoxicity מתוקננים במחקר מרובה אתרים עיוור באמצעות מערך microelectrode וטכניקות אופטיות חישת מתח הדגים את הערך העיקרי של גישה זו6.

צבעים פוטנציומטריים רבים זמינים מסחרית, ופיתוח סינתטי מתמשך של בדיקות חדשות מראה פוטנציאל מרגש לייעול האפקטיביות שלהם על פני מגוון מבנים לב ועצביים. VSD האידיאלי יהיה קינטיקה מוגברת ורגישות, תוך הצגת עומס קיבולי מופחת, ליטוף פוטו וציטוטוקסיות. VF2.1Cl מסונתז לאחרונה (FluoVolt) מבטא רבים של תכונות מועילות אלה בעיקר בשל המבנה המולקולרי מבוסס חוט החדש שלה, משותף על ידי חברים אחרים של מתח Fluor החדש (VF) משפחה7. בניגוד VSDs אלקטרוכרומי נפוץ שבו בדיקות פשוטות מצומדות מולקולרית וחשמלית לקרום הפלזמה, צבע זה מורכב חוט סינתטי מוחדר באופן פסיבי, המשתרע על פני ממברנה אשר משייך תורם עשיר באלקטרונים עם פלואורופור פלואורסין שונה (FITC). פרטים מכניים מסופקים באיור 1. צבע זה מדגים רגישות מעולה לתנודות מתח הממברנה, ומציג שינוי של 27% בעוצמת הפליטה לכל 100 mV לעומת ~ 10% שנראה בבדיקות נפוצות אחרות במהירויותדומות 7. בנוסף, מערכות PeT מבוססות חוט אינן מתקשרות ישירות עם השדה החשמלי הסלולרי המייצר הפרעות חשמליות מינימליות ושינויים זניחים בעומס הקיבולי התאי.

figure-introduction-1
איור 1: פרמטרים כימיים, ספקטרליים ומכניסטיים של צבע VF2.1Cl. (A)מבנה כימי של תכונות מולקולריות VF2.1Cl. לציין כוללים קבוצות אלקיל מרובות בתוך חוט מולקולרי פנילן וינילן אשר להקל על החדרה לתוך קרום הפלזמה. קבוצת חומצה גופרתית טעונה שלילית הצומדת בגשושית FITC מבטיחה ייצוב פלואורופור על פני השטח החוץ-תאיים ומסייעת ליד החדרה מאונכת ביחס לשדה החשמלי של דו-שכבתי השומנים. (B)סכמטי פשוט של VF2.1Cl מאונך מוטבע לתוך קרום הפלזמה של תא יעד. (C)ספקטרום ספיגה ופליטה של צבע VF2.1Cl. ספקטרה זהה לזו של בדיקות FITC ו- GFP סטנדרטיות. (ד)תיאור של מצב הפעולה המכניסטי של VF2.1Cl. בתנאי מנוחה (היפרפולרי), מתחים תאיים שליליים מניעים אלקטרונים חופשיים לכיוון הפלואורופור של הרוסטרל. שפע אלקטרונים מבטיח העברת אלקטרונים המושרה על ידי תמונה (PeT) מועדף כמסלול מחוץ למצב הנרגש לאחר העירור האופטי, למעשה מרווה פלואורסצנטיות. לעומת זאת, פוטנציאל ממברנה דה קוטבי משפיע על תנועת אלקטרונים כלפי מטה ומעדיף פלואורסצנטיות על עירור אופטי. התגובה הפלואורסצנטית המתקבלת קשורה באופן ליניארי למתח הממברנה וניתן להשתמש בה במדויק כדי לאסוף מידע זמני מפורט על קינטיקה אלקטרופיזיולוגית תאית. (E)נציג brightfield (עליון) ופלואורסצנטיות ב 470 ננומטר (נמוך יותר) תמונות של קרדיומיוציטים לפולין טעון עם VF2.1Cl. (F)Z מחסנית Z של קרדיומיוציטים טעון יחיד. החצים מציינים אזורים של לוקליזציה ברורה של VF2.1Cl לממברנה התאית. תמונות נרכשו עם מערכת קונפוקלית דיסק מסתובב המורכבת ראש קונפוקלי דיסק מסתובב X-lightv3 עם תבנית חור סיכה 50 מיקרומטר; תאורת LDI-7; מצלמת Prime95B ומטרת PlanApo Lambda 100x. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הבדיקה FITC הצומדת ל- VF2.1Cl מבטיחה שניתן יהיה להשתמש בה ביעילות בתצורות מסנן רגילות ו- GFP, והיא דורשת רק מערכת רכישה של ערוץ אחד, שתיהן תכונות נפוצות של פלטפורמות הדמיה פלואורסצנטיות. ניתוח של מונוליות IPSC-CM אנושי צפוף עם צבע זה דווח לאחרונה8,9,10,11. הפרוטוקול שלנו שונה ממחקרים אלה עקב החקירה שלנו של iPSC-CMs יחידים, מבודדים, ללא הפרעה על ידי ההשפעות החשמליות והפרקרינית של monolayers סינכרוני צפוף, והשימוש שלנו במערכת פוטומטריה במחיר סביר וניתן להתאמה אישית בניגוד לסידורי הדמיה קונפוקליים או רחבים מורכבים.

כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לרכישה וניתוח מהירים של APs אופטי חזק מקרדיומיוציטים אנושיים מבודדים וקרדיומיוציטים מקומיים (ראה קובץ משלים). אנו משתמשים VF2.1Cl בשילוב עם המדינה הניתנת להתאמה אישית של פלטפורמת האמנות למדידות פוטומטריה של תא יחיד. פרוטוקולים ניסיוניים אלה אושרו על ידי ועדת האתיקה של המרכז הרפואי האוניברסיטאי גטינגן (מס '10/9/15).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנות סלולריות

הערה: IPSCs אנושיים המשמשים בפרוטוקול זה נגזרו מתורמים בריאים והובדלו בשכבות מונו-שכבתיות באמצעות אפנון מולקולות קטנות מוגדרות לחלוטין של טכניקות איתות וטיהור לקטט כפי שתואר בעבר12,13,14. iPSC-CMs נשמרו כל 2-3 ימים עם מדיום תרבות המתואר להלן.

  1. הכן מדיום תרבותי של בינוני בזאלי (RPMI 1640) ותוספת של 2% (B27). יש לאחסן ב-4 °C (75°F). יש להשתמש בטמפרטורת החדר (RT).
  2. הכן מדיום ציפוי של בינוני בזאלי (RPMI 1640), תוספת של 2% (B27) ומעכב רוק 1:2000. יש לאחסן ב-4 °C (75°F). השתמש ב- RT.
  3. מעיל מעוקר 10 מ"מ זכוכית עגולה #0 מכסה עם 150 μL של 1:60 גורם ללא פקטור מטריצת קרום מרתף חינם ודגרה ב 4 °C (4 °F) עבור 4 שעות.
    הערה: אופטימיזציה של נפח כיסוי יש צורך להבטיח את הזכוכית כולה מכוסה תוך שמירה על מתח משטח נאות כדי למנוע שפיכה. 150 μL מומלץ עבור כיסויים עגולים 10 מ"מ. גודל אצווה, סוג כיסוי, כיסוי נפח וסוג צלחת תרבות יכול להתאים לצרכים של הנסיינים.
  4. התחל ניתוק iPSC-CM עם ריאגנט דיסוציאציה של תאים מבוססי EDTA. ודא כי monolayer מנותק לחלוטין על ידי שטיפה בעדינות עם פיפטה 1,000 μL.
  5. מעבירים את המתלים הסלולריים לצינור 15 מ"ל ומוסיפים ציפוי כפול. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב-100 x גרם.
  6. resuspend הכדור עם נפח הרצוי (נפח resuspension) של מדיום ציפוי. ספירת תאים באופן ידני או אלקטרוני.
  7. בחר צפיפות אופטימלית לכל כיסוי (15,000) אשר יאפשר ניתוח תאי מבודד מאוחר יותר.
  8. חשב את הנפח של מתלה סלולרי 'פעיל' (A) הדרוש כדי צלחת כל כיסויים בצפיפות הרצויה. החל את הנוסחה הבאה ונסוג לתוך צינור נפרד:
    figure-protocol-1
  9. חשב את עוצמת הנפח של מדיום ציפוי נוסף (B) הדרוש כדי להתאים לכל כיסוי בנפח הרצוי. החל את הנוסחה הבאה והוסף את הנפח המתקבל לצינור של השעיה פעילה:
    figure-protocol-2
  10. הסר את המטריצה מכיסויים והחל את 'עוצמת הכיסוי' של השעיית התא (A+B) על כל כיסוי. באופן קבוע resuspend בצינור כדי להבטיח אפילו הפצה סלולרית.
  11. דגירה ב 37 °C (50 °F) במשך 1 שעות. ממלאים בעדינות את הבאר בחישוב בינוני.
  12. לאחר 24 שעות, להחליף מדיה עם בינוני תרבות נורמלית ולשמור כל 2-3 ימים.

2. התקנה ניסיונית

  1. צייד מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות הפוך בהגדלה של פי 40, עדשת צמצם מספרי גבוה (N.A: > 0.75) כדי לערוך ניסויים.
  2. זוג נורית LED לבנה חמה במהירות ליציאת התאורה המשודרת של המיקרוסקופ. הכנס מסנן אדום פשוט של 660 ננומטר לנתיב האור ששודר.
    הערה: אור זה יכול להיות מופעל לאורך ניסויי פוטומטריה כדי לצפות במדגם מבלי לזהם את האות הפלואורסצנטי הירוק.
  3. הר ראש LED מיתוג מהיר 470 ננומטר להקלטת פוטומטריה. הכנס מסנן עירור 470/40 ביציאת האפיפלואורסצנטית של המיקרוסקופ כדי לנקות את האור שנוצר על-ידי נורית ה- LED.
    הערה: לכימות אותות אופטימלי מומלץ מערכת תאורה עם בקרת משוב במהירות גבוהה של פלט אופטי.
  4. הכנס קוביית מיקרוסקופ המכילה מפצל קרן מעבר באורך 495 ננומטר בקרוסלת יחידת המראה בתוך המיקרוסקופ.
  5. התאם זרוע זיהוי המכילה דיאפרגמת שדה מתכווננת ליציאת המיקרוסקופ C-הרכבה כדי לאפשר בחירת אזור עניין.
  6. בנפרד זוג גלאי photomultiplier (PMT) ומצלמת USB למיקרוסקופ. זה יהווה את הבסיס של מערכת זיהוי הפליטה.
  7. הכנס קוביית מסנן המכילה מפצל קרן מעבר ארוך של 565 ננומטר ומסנן פליטה של 535/50 ליציאת PMT. זה מפצל את אור הפליטה בין שני הגלאים.
    הערה: מצלמה המחוברת ליציאה המשודרת של מערכת זיהוי הפליטות יכולה לזהות אור משודר מתחת לברייטפילד לאורך כל הניסויים.
  8. צמד את PMT לאספקת חשמל ומגבר PMT. חבר את פלט מגבר PMT לפין קלט אנלוגי של מערכת רכישת נתונים.
  9. סנן נתונים אנלוגיים מה- PMT במהירות של 1 קילו-הרץ ומעלה.
  10. דיגיטציה של נתונים בתדר שהוא לפחות כפול מזה של התדירות הגבוהה ביותר הקיימת באות אנלוגי (2 kHz ומעלה) כדי למלא קריטריוני Nyquist ולמנוע כינוי.

3. טעינה סלולרית עם VF2.1Cl

הערה: כל השלבים הכרוכים בצבע זה חייבים להתבצע בתנאי תאורה חלשה.

  1. הכן את פתרון האמבטיה של טיירוד (ב- mM): 140 NaCl, 10 HEPES, 10 גלוקוז, 4 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, pH = 7.35 וחם עד 37 °C (7°F).
  2. הכן aliquot של פתרון טעינה בצינור microcentrifuge על ידי ערבוב 5 μL של 1,000x VF2.1Cl ו 50 μL של 20% פתרון פולוקסמר solubilizing.
  3. יש למרוח 5 מיקרו-אל של תמיסת הטעינה על 5 מ"ל של הפתרון של טיירוד מחומם (ריכוז צבע 0.1x) בצלחת פטרי 20 מ"מ.
    הערה: ריכוז הצבע הסופי הוא פי 0.1. זה 1/10th שהוצע על ידי היצרן. זה חוסך במשאבים, מבטיח ציטוקסיות זניחה, וחשוב מכך, עדיין שומר אותות אופטיים ברורים מתאים טעונים עם יחסי אות לרעש גבוהים.
  4. מוסיפים לצלחת פתק כיסוי IPSC-CM יחיד ודגר ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  5. להרכיב תא הדמיה תא חי מחומם. לעלות על במת המיקרוסקופ ולמלא עם 500 μL של הפתרון של טיירוד טרי.
  6. לשטוף את כיסוי עם פתרון טרי של טיירוד ב 37 °C (50 °F).
  7. יש למרוח בזהירות את כיסוי ה-iPSC-CM על תא האמבטיה שהתחמם מראש באמצעות מלקחיים עדינים.
    הערה: ודאו שהתא ותכולתו תמיד מחוממים בטמפרטורות פיזיולוגיות. אם תרצה, התחילו עם זלוף מתמשך של הפתרון של טיירוד מחומם.

4. גירוי שדה חשמלי

הערה: הפעלה חיצונית של iPSC-CM היא אופציונלית אך שימושית לתקנון של דינמיקה תאית ופרמטרים ניסיוניים. זה מגביר את קלות הניתוח ומאפשר חקירה של השפעות תלויות תדירות.

  1. חברו תוספת גירוי עם שתי אלקטרודות פלטינה מרווחות זו מזו ב-5 מ"מ לתא ההקלטה.
  2. חבר ממריץ חיצוני לתוספת הגירוי. מוגדר לפולסים דו קוטביים של 5 ms ב 0.5 הרץ.
  3. לקבוע מתח גירוי אופטימלי על ידי הגדלת הגירוי מ 1 V ומעלה. גירוי סף מוגדר כמתח הנמוך ביותר שבו תאים מתחילים להתכווץ. החל מתחים בערך 25% מעל סף זה. הטווח הנורמלי הוא בין 1 V ו 30 V.
  4. תקן תדירות גירוי עם הממריץ החיצוני או הפעל אותו באמצעות תוכנת רכישה.

5. רכישה פוטנציאלית של פעולה אופטית

הערה: פרוטוקול זה משתמש בתוכנה מסחרית לרכישה וניתוח.

  1. דמיינו את המיאוציטים בתצוגת Brightfield באמצעות נתיב האור המשודר ומצלמת ה- USB.
  2. בחר תא מבודד וחתוך בחוזקה את הנתיב האופטי שלו עם הסרעפת של השדה המבטיחה שרק אור מתא העניין מנוטר.
  3. הפעל את מגבר PMT והגדר את אספקת PMT ל- 750 V.
  4. הפעל את פרוטוקול הגירוי (ראה שלב 4) יחד עם תוכנת הרכישה ובו זמנית הפעל את נורית העירור של 470 ננומטר. זה האחרון יכול להיעשות באמצעות לוח מרוחק או אוטומטי בעוצמה קבועה (אות TTL).
  5. התאם רווח והיסט של מגבר PMT כדי לוודא שהאות אינו רווי וממוטב לטווח הזיהוי של מערכת ההקלטה.
  6. הקלט 10 סריקות המבטיחות זיהוי פוטנציאל פעולה יציב.
  7. המשך להקליט והזז מיד את שלב המיקרוסקופ כדי לרכוש בקצרה אות רקע מאזור נטול תאים. כבה את נורית העירור.
    הערה: ערך רקע זה(היסט F) ישמש לחשבון כל פלואורסצנטיות ברקע.
  8. אם תרצה, מקומי לשוטט תרופות התייחסות כגון 1 μM nifedipine כדי לזהות תגובות הסלולר מניפולציה פרמקולוגית.
  9. באופן רציף, חזור על שלבים 5.2-5.7, בכל פעם בחירת תא חדש. החליפו כיסויים אם רוצים להבטיח מחזור ניסיוני גבוה בישיבה אחת.
    הערה: פרוטוקולי טעינה ורכישת תמונות מתוארים באיור 2.

6. ניתוח נתונים

  1. פתח הקלטה שמורה עם תוכנת הניתוח וממוצע 10 סריקות המכילות פוטנציאל פעולה מגורה מתא בודד.
  2. קח ממוצע של האות הבסיסי המייצגהיסט F והפחת אותו מהעקב הממוצע.
  3. חשב ∆F/F0 עם הנוסחה הבאה (כאשר F נמדד פלואורסצנטיות ו- F0 הוא פלואורסצנטיות דיאסטולית):
    figure-protocol-3
  4. זהה את קו הבסיס של המעקב (דיאסטולי) ואת תחום העניין (AP) ולמדוד את הפרמטרים הפוטנציאליים הרצויים של פעולת הלב. זה כולל אך אינו מוגבל לזמן הריקבון עבור 50% (APD50) ו 90% (APD90) repolarization.
  5. יצא את הנתונים מתא בודד זה לתוכנת גיליון אלקטרוני.
  6. חזור על שלבים 6.1 – 6.5 עבור כל ההקלטות. להעריך תוצאות עם בדיקות לא משוערות מתאימות או ניתוח של שונות.

figure-protocol-4
איור 2: פרוטוקולי טעינה ורכישת תמונות. (A)תרשים זרימה של פרוטוקול טעינה מלא של VF2.1Cl עבור iPSC-CMs וקרדיומיוציטים מקומיים. (B)סכמטי פשוט יותר של מפצל קרן (BS) ותצורות מסנן המשמשות בפרוטוקול זה לעריפה וזיהוי של פליטת VF2.1Cl בתגובה לשינויים במתח transmembrane. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 3: פרופילי פוטנציאל פעולה אופטי (AP) של קרדיומיוציטים מקומיים מבודדים ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם נגזרים קרדיומיוציטים (iPSC-CM). (A)AP אופטי מייצג של קרדיומיוצייט מורין יחיד (במרכז) עם ממוצע ± SEM של APD50 ו- APD90 (n = 7, מימין). (B)AP אופטי מייצג של iPSC אנושי יחיד נגזר cardiomyocyte (במרכז) עם ממוצע ± SEM ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי כדי לרכוש בקלות פרופילי AP מפורטים מ- iPSC-CMs מבודדים המתאימים למידול אלקטרופיזיולוגי והקרנת תרופות לב. אנו מזהים APs רגילים וחזקים מה- iPSC-CMs שלנו עם זרעים דלילות, מה שמרמז הן על פונקציונליות המחוון והן על נאמנות מתודולוגית.

בשל הספקטרום הרחב של מתודולוגיות מסחריות לתכנות מחדש של iPSC וחוסר סטנדרטיזציה לפרוטוקולי בידול לב, מודלים מבוססי iPSC יכולים להראות שונות עצומה בתפקודם ובמורפולוגיה16. זה יכול גם לעכב את האפקטיביות של מחקרי cardiot...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cairn מחקר בע"מ תמך בפרסום זה על ידי כיסוי עלויות הייצור של קובץ הווידאו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להכיר ב- Cairn Research Ltd. על תרומתם הכספית האדיבת אשר כיסתה את עלויות הייצור של פרסום זה. בנוסף, אנו מודים לגברת אינס מולר ולמרת סטפני קסטל על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם.

המחקר של המחברים נתמך על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK), דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 ותחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2067/1- 390729940) ו-Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
0.25 טריפסין EDTA גיבקו 
25200056 תוסף B27 גיבקו 
CaCl2קארל רות' HN04.2
D(+)-גלוקוז נטול מים  BioChemicaITW ריאגנטיםA1422
סרום בקר עוברי גיבקו 10270-106
ערכת פוטנציאל ממברנה FluoVolt Invitrogen F10488
HEPESקארל רוט HN77.4
KClSigma-Aldrich6781.1
LamaninSigma-Aldrich114956-81-9
Matrigel BD354230
NaCl סיגמא-אולדריץ'9265.2
ניפדיפין סיגמא-אולדריץ'21829-25-4
פניצילין/סטרפטומיציןאינוויטרוגן 15140
מעכב רוק Y27632סטמולקולה04-0012-10
RPMI 1640 בינוני גיבקו 
Versene EDTA גיבקו 15040033
<חזק>ציוד
495LP מפצל קרן דיכרואי Chroma Technology
Axopatch 200B מולקולריים
כיסויי מעגלים, עובי 0Thermo ScientificCB00100RA020MNT0
Digidata 1550Bהתקנים
ספק כוח OptoLED כפול מחקר קיירן 
מסנן עירור ET470/40x Chroma Technology
ET535/50mChroma Technology
חרוט נויבאואר HemacytometerHausser
 מחקר קיירן 
IX73 מיקרוסקופ הפוך אולימפוס 
MonoLEDCairn 
מתאמים מרובי יציאות מחקר קיירן 
ממריץ תאי Myopacer IonOptix
 מחקר קיירן 
בקר מערכת OptoscanCairn Research 
פלטפורמה מבוקרת טמפרטורה PH-1   וורנר אינסטרומנטס 
גלאי מכפיל פוטו מחקר קיירן 
מגבר PMT הכנסCairn Research 
PMT אספקהCairn Research 
RC-26G תא אמבטיה פתוח וורנר אינסטרומנטס 
SA-OLY/2AL מתאם במה אולימפוס 
T565lpxr מפצל קרן דיכרואי Chroma Technology
T660lpxr מפצל קרן דיכרואיChroma Technology
TC-20 בקר טמפרטורה דו-ערוצי npi אלקטרוני
UPLFLN 40X אובייקטיביאולימפוס 
מצלמת USB 3.0 צבעונית הדמיה
תוכנה
Clampex 11.1התקנים מולקולריים 
Clampfit 11.1התקנים מולקולריים 
לכידת IC 2.4 מקור הדמיה 
פריזמה 8Graphpad
1750404461870010מגבר מכשירים מולקולריים קוביות מסנן מדעי מחקר תריס אופטומסכה הכנס מקור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
  2. Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
  3. Horváth, A., et al. Low resting membrane potential and low inward rectifier potassium currents are not inherent features of hiPSC-derived cardiomyocytes. Stem Cell Reports. 10 (3), 822-833 (2018).
  4. Salama, G., Morad, M. Merocyanine 540 as an optical probe of transmembrane electrical activity in the heart. Science. 191 (4226), 485-487 (1976).
  5. Hortigon-Vinagre, M., et al. The use of ratiometric fluorescence measurements of the voltage sensitive dye Di-4-ANEPPS to examine action potential characteristics and drug effects on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Toxicological Sciences. 154 (2), 320-331 (2016).
  6. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  7. Miller, E. W., et al. Optically monitoring voltage in neurons by photo-induced electron transfer through molecular wires. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (6), 2114-2119 (2012).
  8. Bedut, S., et al. High-throughput drug profiling with voltage- and calcium-sensitive fluorescent probes in human iPSC-derived cardiomyocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (1), 44-53 (2016).
  9. McKeithan, W. L., et al. An automated platform for assessment of congenital and drug-induced arrhythmia with hiPSC-derived cardiomyocytes. Frontiers in Physiology. 8, 766(2017).
  10. Duncan, G., et al. Drug-mediated shortening of action potentials in LQTS2 human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells and Development. 26 (23), 1695-1705 (2017).
  11. Asakura, K., Hayashi, S., Ojima, A., Taniguchi, T., Miyamoto, N. Improvement of acquisition and analysis methods in multi-electrode array experiments with iPS cell-derived cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 75, 17-26 (2015).
  12. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  13. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  14. Kleinsorge, M., Cyganek, L. Subtype-directed differentiation of human iPSCs into atrial and ventricular cardiomyocytes. STAR Protocols. , 100026(2020).
  15. Knollmann, B. C., Katchman, A. N., Franz, M. R. Monophasic action potential recordings from intact mouse heart: validation, regional heterogeneity, and relation to refractoriness. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 12 (11), 1286-1294 (2001).
  16. Leopold, J. A., Loscalzo, J. Emerging role of precision medicine in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (9), 1302-1315 (2018).
  17. Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of Ca2+ transients and membrane currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235(2013).
  18. Voigt, N., et al. Enhanced sarcoplasmic reticulum Ca2+ Leak and increased Na+-Ca2+ exchanger function underlie delayed afterdepolarizations in patients with chronic atrial fibrillation. Circulation. 125 (17), 2059-2070 (2012).
  19. Voigt, N., et al. Cellular and molecular mechanisms of atrial arrhythmogenesis in patients with paroxysmal atrial fibrillation. Circulation. 129 (2), 145-156 (2014).
  20. Fakuade, F. E., et al. Altered atrial cytosolic calcium handling contributes to the development of postoperative atrial fibrillation. Cardiovascular Research. , doi: 10.1093/cvr/cvaa162. Online ahead of print 162(2020).
  21. Gross, E., Bedlack, R. S., Loew, L. M. Dual-wavelength ratiometric fluorescence measurement of the membrane dipole potential. Biophysical Journal. 67 (1), 208-216 (1994).
  22. Matiukas, A., et al. Near-infrared voltage-sensitive fluorescent dyes optimized for optical mapping in blood-perfused myocardium. Heart Rhythm. 4 (11), 1441-1451 (2007).
  23. Mutoh, H., et al. Spectrally-resolved response properties of the three most advanced fret based fluorescent protein voltage probes. PLoS One. 4 (2), 4555(2009).
  24. Hochbaum, D. R., et al. All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins. Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).
  25. Huang, Y. L., Walker, A. S., Miller, E. W. A photostable silicon rhodamine platform for optical voltage sensing. Journal of the American Chemical Society. 137 (33), 10767-10776 (2015).
  26. Deal, P. E., Kulkarni, R. U., Al-Abdullatif, S. H., Miller, E. W. Isomerically pure tetramethylrhodamine voltage reporters. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9085-9088 (2016).
  27. Fluhler, E., Burnham, V. G., Loew, L. M. Spectra, membrane binding, and potentiometric responses of new charge shift probes. Biochemistry. 24 (21), 5749-5755 (1985).
  28. Fromherz, P., Muller, C. O. Voltage-sensitive fluorescence of amphiphilic hemicyanine dyes in neuron membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 1150 (2), 111-122 (1993).
  29. Salama, G., et al. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. Journal of Membrane Biology. 208 (2), 125-140 (2005).
  30. Jin, L., et al. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescent protein voltage probe. Neuron. 75 (5), 779-785 (2012).
  31. Kralj, J. M., Douglass, A. D., Hochbaum, D. R., MacLaurin, D., Cohen, A. E. Optical recording of action potentials in mammalian neurons using a microbial rhodopsin. Nature Methods. 9 (1), 90-95 (2012).
  32. Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nature Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
  33. Lundby, A., Mutoh, H., Dimitrov, D., Akemann, W., Knöpfel, T. Engineering of a genetically encodable fluorescent voltage sensor exploiting fast Ci-VSP voltage-sensing movements. PLoS One. 3 (6), 2514(2008).
  34. Bradley, J., Luo, R., Otis, T. S., DiGregorio, D. A. Submillisecond optical reporting of membrane potential in situ using a neuronal tracer dye. The Journal of neuroscience. 29 (29), 9197-9209 (2009).
  35. Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells & tissues. Circulation Research. 110 (4), 609-623 (2012).
  36. Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11, 464(2020).
  37. Kettlewell, S., Walker, N. L., Cobbe, S. M., Burton, F. L., Smith, G. L. The electrophysiological and mechanical effects of 2,3-butane-dione monoxime and cytochalasin-D in the Langendorff perfused rabbit heart. Experimental Physiology. 89 (2), 163-172 (2004).
  38. Képiró, M., et al. para-Nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable Myosin inhibitor. Angewandte Chemie International Edition. 53 (31), 8211-8215 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cardiomyocytes iPSC

מאמרים קשורים