מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Fitzwilliam Seibertz; Martyn Reynolds; Niels Voigt

doi:10.3791/61890

מאמר שיטה

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

DOI:

10.3791/61890

⸱

22 בדצמבר 2020

Fitzwilliam Seibertz¹^,² , Martyn Reynolds³ , Niels Voigt¹^,²^,⁴

¹Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, Goettingen, Germany, ²DZHK (German Center for Cardiovascular Research), Partner Site Goettingen, Germany, ³Cairn Research Ltd, Faversham, United Kingdom, ⁴Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Goettingen, Germany

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים רכישה אופטית ואפיון של פוטנציאל פעולה מתאי גזע פלוריפוטנטים המושרים שמקורם בקרדיומיוציטים באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית במהירות גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות מיקרו-אלקטרוקטרודה תאיות קונבנציונליות לכימות אלקטרופיזיולוגיה של קרדיומיוצית הן מורכבות ביותר, עתירות עבודה, ובדרך כלל מבוצעות בתפוקה נמוכה. התרחבות מהירה ומתמשכת של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC) מציגה סטנדרט חדש במחקר לב וכלי דם ושיטות חלופיות נחוצות כעת כדי להגדיל את התפוקה של נתונים אלקטרופיזיולוגיים ברמת תא אחד. VF2.1Cl הוא צבע רגיש למתח שנגזר לאחרונה המספק ערוץ יחיד מהיר, תגובה בעוצמה גבוהה לתנודות בפוטנציאל הממברנה. יש לו קינטיקה עדיפה על אלה של מחווני מתח קיימים אחרים ועושה נתונים פונקציונליים זמינים שוות ערך לזה של טכניקות מיקרו-ectrode מסורתיות. כאן, אנו מדגימים אפיון פוטנציאלי פעולה פשוטה ולא פולשנית ב cardiomyocytes אנושיים בקצב חיצוני באמצעות מערכת פוטומטריה מודולרית ובמחיר סביר מאוד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מידול אלקטרופיזיולוגי של קרדיומיוציטים ובניית פלטפורמות יעילות להקרנת תרופות לב חיוניות לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למגוון הפרעות קצב. התרחבות מהירה של טכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטים המושרה (iPSC) יצרה חדירה מבטיחה למידול מחלות אנושיות ולחקירה פרמקולוגית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בחולה מבודד (iPSC-CM). טכניקות "תקן זהב" לאפיון אלקטרופיזיולוגי של תאים אלה באמצעות מהדק תיקון (מהדק זרם) יכולות לכמת את פוטנציאל הפעולה (AP) מורפולוגיה ומשך זמן, עם זאת, שיטה זו מורכבת ואיטית להפליא, ואינה מתאימה לרכישת נתוני תפוקה גבוהה¹. iPSC-CMs מדווחים באופן קבוע יש פוטנציאל ממברנה דיאסטולית מוגברת וזרם דליפה מוגבר בהשוואה לקרדיומיוציטים ילידים למבוגרים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנות סלולריות

הערה: IPSCs אנושיים המשמשים בפרוטוקול זה נגזרו מתורמים בריאים והובדלו בשכבות מונו-שכבתיות באמצעות אפנון מולקולות קטנות מוגדרות לחלוטין של טכניקות איתות וטיהור לקטט כפי שתואר בעבר¹²^,¹³^,¹⁴. iPSC-CMs נשמרו כל 2-3 ימים עם מדיום תרבות המתואר להלן.

הכן מדיום תרבותי של בינוני בזאלי (RPMI 1640) ותוספת של 2% (B27). יש לאחסן ב-4 °C (75°F). יש להשתמש בטמפרטורת החדר (RT).
הכן מדיום ציפוי של בינוני בזאלי (RPMI 1640), תוספת של 2% (B27) ומעכב רוק 1:2000. יש לאחסן ב-4 °C (75°F). השתמש ב- RT.
מעיל מעוקר 10 מ"מ זכוכי....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 3: פרופילי פוטנציאל פעולה אופטי (AP) של קרדיומיוציטים מקומיים מבודדים ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם נגזרים קרדיומיוציטים (iPSC-CM). (A)AP אופטי מייצג של קרדיומיוצייט מורין יחיד (במרכז) עם ממוצע ± SEM של APD₅₀ ו- APD₉₀ (n = 7, מימין). (B)AP אופטי מייצג של iPSC אנושי יחיד נגזר cardiomyocyte (במרכז) עם ממוצע ± SEM ש.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקול בסיסי כדי לרכוש בקלות פרופילי AP מפורטים מ- iPSC-CMs מבודדים המתאימים למידול אלקטרופיזיולוגי והקרנת תרופות לב. אנו מזהים APs רגילים וחזקים מה- iPSC-CMs שלנו עם זרעים דלילות, מה שמרמז הן על פונקציונליות המחוון והן על נאמנות מתודולוגית.

בשל הספקטרום הרחב של מתודולוגיות מסחריות לתכנות מחדש של iPSC וחוסר סטנדרטיזציה לפרוטוקולי בידול לב, מודלים מבוססי iPSC יכולים להראות שונות עצומה בתפקודם ובמורפולוגיה¹⁶. זה יכול גם לעכב את האפקטיביות של מחקרי cardiot.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cairn מחקר בע"מ תמך בפרסום זה על ידי כיסוי עלויות הייצור של קובץ הווידאו.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מבקשים להכיר ב- Cairn Research Ltd. על תרומתם הכספית האדיבת אשר כיסתה את עלויות הייצור של פרסום זה. בנוסף, אנו מודים לגברת אינס מולר ולמרת סטפני קסטל על התמיכה הטכנית המצוינת שלהם.

המחקר של המחברים נתמך על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK), דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 ותחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2067/1- 390729940) ו-Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>ריאגנטים
0.25 טריפסין EDTA	גיבקו
25200056 תוסף B27	גיבקו
CaCl2	קארל רות'	HN04.2
D(+)-גלוקוז נטול מים BioChemica	ITW ריאגנטים	A1422
סרום בקר עוברי	גיבקו	10270-106
ערכת פוטנציאל ממברנה FluoVolt	Invitrogen	F10488
HEPES	קארל רוט	HN77.4
KCl	Sigma-Aldrich	6781.1
Lamanin	Sigma-Aldrich	114956-81-9
Matrigel	BD	354230
NaCl	סיגמא-אולדריץ'	9265.2
ניפדיפין	סיגמא-אולדריץ'	21829-25-4
פניצילין/סטרפטומיצין	אינוויטרוגן	15140
מעכב רוק Y27632	סטמולקולה	04-0012-10
RPMI 1640 בינוני	גיבקו
Versene EDTA	גיבקו	15040033
<חזק>ציוד
495LP מפצל קרן דיכרואי	Chroma Technology
Axopatch 200B			מולקולריים
כיסויי מעגלים, עובי 0	Thermo Scientific	CB00100RA020MNT0
Digidata 1550B	התקנים
ספק כוח OptoLED כפול	מחקר קיירן
מסנן עירור ET470/40x	Chroma Technology
ET535/50m	Chroma Technology
חרוט נויבאואר Hemacytometer			Hausser
	מחקר קיירן
IX73 מיקרוסקופ הפוך	אולימפוס
MonoLED	Cairn
מתאמים מרובי יציאות	מחקר קיירן
ממריץ תאי Myopacer	IonOptix
	מחקר קיירן
בקר מערכת Optoscan	Cairn Research
פלטפורמה מבוקרת טמפרטורה PH-1	וורנר אינסטרומנטס
גלאי מכפיל פוטו	מחקר קיירן
מגבר PMT הכנס	Cairn Research
PMT אספקה	Cairn Research
RC-26G תא אמבטיה פתוח	וורנר אינסטרומנטס
SA-OLY/2AL מתאם במה	אולימפוס
T565lpxr מפצל קרן דיכרואי	Chroma Technology
T660lpxr מפצל קרן דיכרואי	Chroma Technology
TC-20 בקר טמפרטורה דו-ערוצי	npi אלקטרוני
UPLFLN 40X אובייקטיבי	אולימפוס
מצלמת USB 3.0 צבעונית			הדמיה
תוכנה
Clampex 11.1	התקנים מולקולריים
Clampfit 11.1	התקנים מולקולריים
לכידת IC 2.4	מקור הדמיה
פריזמה 8	Graphpad

1750404461870010מגבר מכשירים מולקולריים קוביות מסנן מדעי מחקר תריס אופטומסכה הכנס מקור

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
Liang, P., et al.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Cardiomyocytes iPSC

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים