הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61927

⸱

24 בנובמבר 2020

 ,  , 
1Children's Nutrition Research Center, Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מספק שלוש גישות קלות ונגישות להערכת חילוף החומרים של השומנים בעכברים.

תקציר

הערכת חילוף החומרים של השומנים היא אבן יסוד בהערכת תפקוד חילוף החומרים, והיא נחשבת חיונית למחקרי חילוף החומרים של vivo. שומנים הם סוג של מולקולות רבות ושונות עם מסלולים רבים המעורבים בסינתזה שלהם ואת חילוף החומרים. נקודת התחלה להערכת hemostasis שומנים עבור תזונה ומחקר השמנת יתר יש צורך. מאמר זה מתאר שלוש שיטות קלות ונגישות הדורשות מעט מומחיות או תרגול כדי לשלוט, וזה יכול להיות מותאם על ידי רוב המעבדות כדי לסנן עבור חריגות חילוף החומרים השומנים בעכברים. שיטות אלה הן (1) מדידה מספר מולקולות שומנים בסרום צום באמצעות ערכות מסחריות (2) בדיקה ליכולת טיפול שומנים תזונתיים באמצעות בדיקת סובלנות תוך ליפיד אוראלי, ו -(3) הערכת התגובה לתרכובת תרופות, CL 316,243, בעכברים. יחד, שיטות אלה יספקו סקירה ברמה גבוהה של יכולת טיפול בשומנים בעכברים.

מבוא

פחמימות ושומנים הם שני מצעים עיקריים לחילוף חומרים של אנרגיה. חילוף חומרים חריג של שומנים בדם גורם למחלות אנושיות רבות, כולל סוכרת מסוג II, מחלות לב וכלי דם, מחלות כבד שומני וסרטן. שומנים תזונתיים, בעיקר טריגליצרידים, נספגים דרך המעי לתוך מערכת הלימפה ונכנסים למחזור הדם הוורי ב chylomicrons ליד הלב1. שומנים נישאים על ידי חלקיקי ליפופרוטאין במחזור הדם, שם moieties חומצת שומן משוחררים על ידי הפעולה של ליפופרוטאין ליפאז באיברים היקפיים כגון שריר ורקמתשומן 2. שאריות השרידים העשירות בכולסטרול מנוקות על ידי הכבד3. עכברים היו בשימוש נרחב במעבדות כמודל מחקר לחקר חילוף החומרים של השומנים. עם ערכות כלים גנטיות מקיפות זמינות ומחזור רבייה קצר יחסית, הם מודל רב עוצמה לחקר האופן שבו שומנים נספגים, מסונתזים ומטבוליזם.

בשל המורכבות של חילוף החומרים של השומנים, מחקרי lipidomics מתוחכמים או מחקרי מעקב איזוטופיים משמשים בדרך כלל כדי לכמת אוספים של מינים שומנים או שטפים מטבוליים הקשורים שומניםוגורלות 4,5. זה יוצר אתגר עצום לחוקרים ללא ציוד מיוחד או מומחיות. במאמר זה, אנו מציגים שלוש בדיקות שיכולות לשמש מבדיקות ראשוניות לפני שימוש בטכניקות מאתגרות מבחינה טכנית. הם נהלים שאינם סופניים עבור העכברים, ולכן שימושי מאוד לזיהוי הבדלים פוטנציאליים ביכולת טיפול בשומנים וצמצום התהליכים המושפעים.

ראשית, מדידת מולקולות השומנים בסרום בצום יכולה לעזור לוודא את פרופיל השומנים הכללי של העכבר. עכברים צריכים להיות צמים, כי מינים שומנים רבים לעלות לאחר הארוחות, ואת היקף הגידול מושפע מאוד על ידי הרכב הדיאטה. מולקולות שומנים רבים, כולל כולסטרול כולל, טריגליצריד וחומצת שומן לא אסטרית (NEFA), ניתן למדוד באמצעות ערכה מסחרית וקורא לוחות שיכול לקרוא ספיגה.

שנית, בדיקת סובלנות תוך ליפיד אוראלי מעריכה את יכולת הטיפול בשומנים כהשפעה נטו של ספיגה וחילוף חומרים. אינטרליפיד המנוהל בעל פה גורם לעלייה חדה ברמות הטריגליצריד במחזור (1-2 שעות), ולאחר מכן רמות הטריגליצריד בסרום חוזרות לרמות בזאליות (4-6 שעות). זה assay מציע מידע על כמה טוב עכבר יכול להתמודד עם שומנים אקסוגניים. רקמת שומן לב, כבד וחום הם צרכנים פעילים של טריגליצרידים, ואילו רקמת שומן לבנה מאחסנת אותה כמאגר אנרגיה. שינויים בפונקציות אלה יובילו להבדלים בתוצאות הבדיקה.

לבסוף, קידום lipolysis לגייס שומנים מאוחסנים נחשב אסטרטגיה אפשרית לירידה במשקל. מסלול איתות קולטן β3-adrenergic ברקמת השומן ממלא תפקיד חשוב בליפוליזה אדיפוזיט, והגנטיקה האנושית זיהתה פולימורפיזם Trp64Arg אובדן תפקוד ב β3-קולטן adrenergic בקורלציה עם השמנת יתר6. CL 316,243, אגוניסט קולטן β3-adrenergic ספציפי וחזק, מגרה ליפוליזה של רקמת שומן ושחרור של גליסול. הערכה של תגובת העכבר CL 316,243 יכול לספק מידע בעל ערך על הפיתוח, שיפור, והבנה של היעילות של המתחם.

באופן קולקטיבי, בדיקות אלה יכולות לשמש כמסך ראשוני לשינויים במצב חילוף החומרים של השומנים של עכברים. הם נבחרים לנגישות של המכשירים והריגנטים. עם התוצאות הנגזרות מבדים אלה, החוקרים יכולים ליצור תמונה כוללת של הכושר המטבולי של בעלי החיים שלהם ולהחליט על גישות מתוחכמות וממוקדמות יותר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

בעלי חיים שוכנים בתנאים סטנדרטיים בעקבות טיפול בבעלי חיים ופרוטוקולים ניסיוניים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכללת ביילור לרפואה (BCM). בעלי חיים מקבלים תזונה סטנדרטית או מיוחדת, מים ad libitum, ונשמר עם מחזור יום / לילה 12 שעות ביממה.

1. מדידת שומנים בסרום צום

  1. מעבירים עכברים לכלוב חדש אחרי השעה 17:00 ומהר עם גישה חופשית למים, לילה (עם כ -16 שעות של צום לפני הניסוי). צום הלילה מבטיח ריקון מלא של מערכת העיכול של העכברים.
    הערה: עכברים אוכלים את הצואה שלהם במהלך הצום, ולכן גמילה ממזון אינה יכולה להבטיח שהם צמים כראוי.
  2. למחרת בבוקר, לתפוס את העכבר בזנב ולהניח אותו על משטח. משוך לאחור בעדינות על זנב העכבר כדי למקם את העכבר במרסן. הנח את ריסון האף כדי לאמן מחדש את תנועת העכבר תוך מתן אפשרות לעכבר לנשום. הדק את הידית של ריסון האף. נטר את תנועות החזה כדי לוודא שבעל החיים נושם כרגיל ולמזער את הזמן שעכבר מבלה באזיקים.
  3. לעשות חתך שטחי (ניק) בווריד הזנב של העכבר הנע חופשי, ולמשוך 25 μL של דם מן החתך לתוך נימי זכוכית (מילוי על 1/3 של נימי) מבלי לרסן את העכבר. לפוצץ במהירות את הדם לתוך צינור microcentrifuge.
  4. להפסיק את הדימום באמצעות אבקות styptic, למלא את ההזנה בכלוב, ולוודא העכברים להראות שום סימנים של מתח.
  5. להשלים את נסיגת הדם לכל העכברים.
  6. אפשר לדם להישרש על ידי השארתו ללא הפרעה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. סובבו את דגימות הדם הקרישו ב-2,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במיקרוצנטריפוגה בקירור, והעבירו את הסופר-נטינט (סרום) לניתוח.
    הערה: סרום ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F) במשך מספר שבועות עד ניתוח. לאחסון לטווח ארוך, יש לשמור על הסרום ב-70°C.
  7. לנתח כל מטבוליט שומנים באמצעות הפרוטוקול שסופק על ידי היצרן.

2. בדיקת סובלנות תוך ליפידית אוראלי

  1. לאחר השעה 17:00, שקול את העכברים לחישוב הנפח התוך-ליפידי שיינתן להם למחרת. לאחר מכן, להעביר את העכברים לתוך כלוב חדש לצום אותם לילה (16 שעות).
  2. למחרת בבוקר, סמנו זנבות של העכברים השוכן בכלוב אחד כדי לסייע בזיהוים בשלבי הדימום הבאים.
  3. לעשות ניק בווריד הזנב ולשאוב 15 μL של דם מן החתך לתוך נימי זכוכית (מילוי על 1/5 של נימי), במהירות לפוצץ את הדם לתוך צינור microcentrifuge עבור T = 0 סרום.
    הערה: אין צורך לעצור את הדימום במהלך ההסתה אלא אם כן העכברים מראים דימום עודף.
  4. עכברי Gavage 20% תוך ליפיד באמצעות מחט gavage 18G ביחס של 15 מיקרול לגרם של משקל גוף, באמצעות משקל הגוף טרום הצום. עורמים כל עכבר בדקה אחת.
    הערה: שקול את החיה ולקבוע את גודל מחט gavage המתאים. בדרך כלל, מחט gavage 18 מד מתאים לעכברים >25 גרם, ומחט 20-22 מד gavage יהיה מתאים יותר לבעלי חיים קטנים יותר. קשקוש העכבר, אוחז בעור מעבר לכתפיים כדי להחזיק את ראשו של החיה במקומו. מניחים את מחט הגאבג'י בפה ולאחר מכן מתקדמים בעדינות לאורך החיך העליון, עד להגעה לוושט. הצינור צריך לעבור ללא התנגדות. ברגע שמגיעים לעומק הנכון, ניתן לנהל לאט לאט את העומק האינטרליפידי. הסר בעדינות את המחט בעקבות אותה זווית במהלך החדרת מחט לאחר ניהול Intralipid. החזר את החיה לכלוב ולפקח על סימנים של נשימה מאומצת או מצוקה אחרת.
    הערה: חוקרים שאינם מנוסים עם gavage או טכניקות דימום זנב או זנב יכול לערום כל עכבר על ידי 2 דקות או אפילו יותר.
  5. משוך דם ב- T = 1, 2, 3, 4, 5 ו- 6 שעות: צייר 15 μL של דם (1/5 נימי) לעכבר באמצעות דימום בזנב, ופוצץ במהירות את הדם לתוך צינור microcentrifuge.
  6. סובבו את דגימות הדם ב-2,000 על גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות במיקרו-צנטריפוגה. העבר את supernatant, כולל שכבת השומן הצפה, לצינור PCR לאחסון. Supernatant ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F) במשך מספר שבועות עד ניתוח.
    הערה: סופר-נט צריך להיות פלזמה. אם כמה דגימות כבר קרישה על ידי זמן צנטריפוגה, זה לא משפיע על מדידת טריגליצריד.
  7. לאחר איסוף הדם האחרון, לעצור את הדימום באמצעות אבקות styptic, למלא את ההזנה בכלוב, ולוודא העכברים להראות שום סימנים של מתח קיצוני.
  8. טען 2 μL של תקן טריגליצריד ואסף supernatants לתוך צלחת 96 טוב.
  9. הוסף 200 μL של ריאגנט טריגליצריד ולתת את הצלחת לדגור במשך 5 דקות ב 37 °C (77 °F) להתפתחות צבע.
  10. מדוד את הספיגה ב 500 ננומטר עם אורך גל התייחסות של 660 ננומטר בקורא לוחות מעבדה, ולחשב את ריכוז המדגם.

3. β3 קולטן אדראנג'י אגוניסט CL 316,243 ליפוזיס מגורה

  1. הכן CL 316,243 כתמיסת מלאי של 5 מ"ג /מ"ל (50x) מלוחים סטריליים, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
  2. בבוקר, לשקול את העכברים כדי לחשב את כמות CL מדולל 316,243 פתרון הדרוש לניסוי. העכבר יקבל 10 μL לגרם של משקל גוף של CL מדולל 316,243, עבור מנה סופית של 1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף.
  3. מעבירים את העכברים לכלוב חדש עם גישה חופשית למים, ומהר אותם במשך 4 שעות.
  4. הפוך מספיק 1x CL 316,243 פתרון מתוך 50x מלאי באמצעות מלוחים. הריכוז הסופי של 1x CL 316,243 פתרון הוא 0.1 מ"ג / מ"ל. השתמש מלוחים עבור קבוצת הטיפול בקרה.
  5. סמן את זנבות העכברים השוכן באותו כלוב לזיהוי קל במהלך שלבי הדימום.
  6. לעשות ניק בווריד הזנב, ולשאוב 15 μL של דם מן החתך לתוך נימי זכוכית (מילוי על 1/5 של נימי), במהירות לפוצץ את הדם לתוך צינור microcentrifuge עבור T = 0 מדגם.
    הערה: אין צורך לעצור את הדימום במהלך ההסתה אלא אם כן העכברים מראים דימום עודף.
  7. הזרקת תמיסה מדוללת CL 316,243 (או שליטה אם כלול בניסוי) תוך-איטרא-אקריטונית בנפח של 10 μL/g משקל גוף. עורמים כל עכבר בדקה אחת. השתמש לכל היותר 5 עכברים עבור כל ניסוי של 60 דקות, או 10 עכברים עבור צוות של שני אנשים.
  8. להקיז דם ב T = 5, 15, 30, 60 דקות: לצייר 15 μL של דם (1/5 נימי) לכל עכבר דרך דימום הזנב.
  9. לאחר איסוף הדם האחרון, לעצור את הדימום באמצעות אבקות styptic, למלא את ההזנה בכלוב, ולוודא העכברים להראות שום סימנים של מתח קיצוני.
  10. ספין דגימות דם ב 2,000 x g ב 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות ב microcentrifuge בקירור. העבר את supernatant לצינור PCR לאחסון. ניתן לאחסן את הסופר-נט ב-20 מעלות צלזיוס למשך מספר שבועות עד לניתוח.
  11. טען 1 μL של 2x תקנים גלילסול מדולל באופן סדרתי (0.156, 0.312, 0.625, 1.25, ו 2.5 מ"ג / מיליליטר טריאולאין שווה ערך) ואסף supernatants לתוך צלחת 96 טוב. הוסף 100 μL של ריאגנט גליצ'רול חינם, ולתת את הצלחת לדגור במשך 5 דקות ב 37 °C (77 °F) עבור הצבע לפתח.
  12. מדוד את הספיגה ב 540 ננומטר באמצעות קורא לוחות מעבדה, ולחשב את ריכוז המדגם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנו מראים עם שלושה קטעים כי כל מטען מציע מידע בעל ערך על חילוף החומרים של השומנים של העכברים. עבור עכברים זכרים C57BL/6J, מאותגרים על ידי שמונה שבועות של תזונה עתירת שומן (HFD) האכלה החל משמונה שבועות של גיל, רמות הכולסטרול הכולל היו גבוהות באופן משמעותי, בעוד טריגליצריד סרום ו- NEFA לא היו (טבלה 1), דבר המצביע על כך טריגליצריד ו- NEFA בדם אינם מוסדרים בעיקר על ידי אתגר שומן תזונתי. בחבורה השנייה של עכברים, C57BL / 6J ו C57BL6 / N תת-מעצורים של C57BL6 הוזנו HFD במשך שמונה שבועות, החל בגיל שמונה שבועות. ר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

שלושת הבדיקות המתוארות מתפקדות היטב במעבדה, עם כמה שיקולים קריטיים. צום בן לילה נדרש לקביעת רמות השומנים בסרום הצום ובדיקת סובלנות תוך ליפיד דרך הפה. עבור בדיקת סובלנות תוך ליפיד אוראלי, זה קריטי לסובב את הדם בטמפרטורת החדר כדי למזער את היווצרות שכבת השומן, במיוחד בנקודות זמן של שעה ו 2 שעות; חשוב לא להשליך שכבת שומן זו אם היא נוצרת. הקפידו להעביר את הסופר-נט עם שכבת השומנים, וצרפו בעדינות כדי לערבב אותם יחד לקביעת טריגליצריד.

פרשנות של רמות השומנים בסרום הצום
צום הוכח כדי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכת על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH), מענק R00-DK114498, ומשרד החקלאות של ארצות הברית (USDA), מענק CRIS: 3092-51000-062 ל- Y. Z.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
20% תוך-ליפידיםSigma AldrichI141
BD מזרקים סטריליים עם קצה החלקה 1 מ"לShaotongB07F1KRMYN
CL 316,243 HydrateSigma-AldrichC5976
מחטי האכלה מעוקלות (18 מד)Kent ScientificFNC-18-2-2
מגיב גליצרול חופשיסיגמא אולדריץ'F6428
פתרון סטנדרטי גליצרולSigmaG7793
HR SERIES NEFA-HR(2) מגיב צבע AFujifilm Wako Diagnostics999-34691
HR SERIES NEFA-HR(2) מגיב צבע BFujifilm Wako Diagnostics991-34891
HR SERIES NEFA-HR(2) ממס AFujifilm Wako Diagnostics995-34791
HR SERIES NEFA-HR(2) ממס BFujifilm Wako אבחון993-35191
ערכת ייחוס לכימיה מטריקס פלוסVerichem9500
צינורות מיקרו צנטריפוגהפישר סיינטיפיק14-222-168
צינור נימי מיקרוהמטרוקריט, לא הפרניפישר סיינטיפיק22-362-574
פתרון סטנדרטי של NEFAFujifilm Wako Diagnostics276-76491
פוספט חוצץ מלחBoston BioproductsBM-220
Thermo Scientific טריגליצרידים ריאגנטפישר סיינטיפיקTR22421
סה"כ ריאגנטים לכולסטרולThermo ScientifiTR13421

מקורות

  1. Dixon, J. B. Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals. Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, Suppl 1 52-57 (2010).
  2. Nuno, J., de Oya, M. Lipoprotein lipase: review. Revista Clínica Española. 170 (3-4), 83-87 (1983).
  3. Williams, K. J. Molecular processes that handle -- and mishandle -- dietary lipids. Journal of Clinical Investigation. 118 (10), 3247-3259 (2008).
  4. Burla, B., et al. MS-based lipidomics of human blood plasma: a community-initiated position paper to develop accepted guidelines. Journal of Lipid Research. 59 (10), 2001-2017 (2018).
  5. Umpleby, A. M. Hormone measurement guidelines: Tracing lipid metabolism: the value of stable isotopes. Journal of Endocrinology. 226 (3), 1-10 (2015).
  6. Mitchell, B. D., et al. A paired sibling analysis of the beta-3 adrenergic receptor and obesity in Mexican Americans. Journal of Clinical Investigation. 101 (3), 584-587 (1998).
  7. Mahoney, L. B., Denny, C. A., Seyfried, T. N. Caloric restriction in C57BL/6J mice mimics therapeutic fasting in humans. Lipids in Health and Disease. 5, 13(2006).
  8. Hayek, T., et al. Dietary fat increases high density lipoprotein (HDL) levels both by increasing the transport rates and decreasing the fractional catabolic rates of HDL cholesterol ester and apolipoprotein (Apo) A-I. Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice. Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).
  9. Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats. Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry & Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).
  10. Tall, A. R. Functions of cholesterol ester transfer protein and relationship to coronary artery disease risk. Journal of Clinical Lipidology. 4 (5), 389-393 (2010).
  11. Singh, A. K., Singh, R. Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal. Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).
  12. Miller, M., et al. Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).
  13. Dron, J. S., Hegele, R. A. Genetics of Hypertriglyceridemia. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 11, 455(2020).
  14. Dole, V. P. A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose. Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).
  15. Bartelt, A., et al. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).
  16. de Souza, C. J., Burkey, B. F. Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans. Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).
  17. Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues. Journal of Experimental Biology. 221, Pt Suppl 1 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מטבוליזם של ליפידיםאנליזת ליפידים בסרוםמבחן סבילות תוך-ורידי ל-Intralipidטיפול ב-CL 316 243ליפידים בסרום בצוםמדידת טריגליצרידיםבדיקת גליצרולשימוש במיקרוצנטריפוגהאנליזה באמצעות קורא לוחותתזונה עשירה בשומן
הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.