מאמר שיטה

פגיעה קריו גרמה להתחדשות לב באקסולוטל ובאקו לב והיסטולוגיה כמותית בלתי משוחדת להערכת התקדמות רגנרטיבית

2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61966

⸱

10 במאי 2021

 , 
1Department of Clinical Medicine (Comparative Medicine Lab), Aarhus University

במאמר זה

סיכום

כאן אנו מציגים פרוטוקול ניתוח לגרימת פגיעה בשריר הלב החדר של האקסולוטל. בנוסף, אנו מציגים פרוטוקול להערכה לא פולשנית של שבר אוטם במהלך תהליך ההתחדשות עם אקו לב ופרוטוקול למדידה מדויקת של שבר אוטם בלב שנכרת עם היסטולוגיה כמותית בלתי מוטה.

תקציר

הדו-חיים האורודליים, סלמנדרות וניוטים, מייצגים את הקבוצה הפילוגנטית הקרובה ביותר ליונקים המסוגלים לבצע התחדשות מלאה של שריר הלב לאחר כריתת החדר. מודל הכריתה יצר ידע בסיסי על התהליכים המעורבים בתיקון לב. עם זאת, המודל אינו מתייחס היטב למצבים קליניים שבהם נזק לרקמות, אפופטוזיס, נמק, פיברוזיס והיפרטרופיה הם כולם השלכות מזיקות מרכזיות של אוטם שריר הלב הנגרם על ידי איסכמיה ולא הסרת רקמות. מצד שני, אוטם שריר הלב המושרה על ידי פגיעה בהקפאה דומה יותר לאוטם שריר הלב המושרה על ידי איסכמיה. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של הליך הפגיעה באקסולוטל (Ambystoma mexicanum), המספק כלי לחקירת מנגנונים בסיסיים בתיקון לב במודל טטרפוד. בנוסף, אנו מספקים שיטות כמותיות להערכת גודל האוטם באופן לא פולשני in vivo עם אקו לב ולמדידת גודל האוטם במדויק עם היסטולוגיה כמותית בלתי משוחדת ex vivo.

מבוא

מחלת לב איסכמית היא גורם מוביל לתמותה ברחבי העולם 1,2. אוטם שריר הלב המושרה על ידי איסכמיה גורם למוות תאים נרחב בקרדיומיוציטים3. למרות שהתערבות רפואית מהירה יכולה להפחית את הסיכון למוות מיידי, התגובה הפיברוטית הנובעת מכך שבני אדם חולקים עם חיות מודל יונקים מסורתיות (עכבר, חולדה, ארנב, חזיר וכו') גורמת להיווצרות רקמת צלקת שעלולה בסופו של דבר להוביל להיפרטרופיה לבבית, הפרעות קצב ואי ספיקת לב4. בניגוד ליונקים, התחדשות הלב מבוססת היטב בכמה מודלים של בעלי חיים שאינם מי שפיר כמו דג הזברה5 וסלמנדרות6. באופן מסורתי, התחדשות הלב נחקרה במינים אלה לאחר כריתה חלקית של החדר או צביטה 5,6,7,8,9,10. עם זאת, בשנת 2011, שלוש קבוצות פיתחו באופן עצמאי טכניקת אוטם שריר הלב הנגרמת על ידי פגיעה קריולוגית בדגי זברה 11,12,13. טכניקת ההקפאה גורמת לנמק ואפופטוזיס בחלק גדול מחדר הלב של דג הזברה ולהצטברות ראשונית של רקמה פיברוטית המדמה מקרוב יותר את ההתפתחות הפתולוגית של לב היונקים לאחר אוטם איסכמי בהשוואה לכריתת חדרים 11,12,13. בנוסף, השוואות מתודולוגיות של אוטם שריר הלב המושרה על ידי פגיעה קריולוגית לאוטם שריר הלב המושרה על ידי איסכמיה על ידי קשירת עורקים כליליים בעכבר ובחזיר הוכיחו שטכניקת הפגיעה בהקפאה היא אלטרנטיבה שימושית במודלים של בעלי חיים של יונקים14,15. בהשראת השיטות המעורבות במודל פגיעת הקריו של דג הזברה16,17 פיתחנו מודל דומה באקסולוטל18, דו-חיים הידוע ביכולות ההתחדשות שלו19, המאפשר לחקור את המנגנונים המעורבים בתיקון הלב בטטרפוד זה לאחר נזק לרקמות ולא הסרת רקמות.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד לבצע אוטם שריר הלב המושרה על ידי פגיעה קריולוגית באקסולוטל. אנו שמים דגש מיוחד על צעדים חיוניים מהירים וזעיר פולשניים המגבירים את ההישרדות, ההתאוששות והשחזור הניסיוני. בנוסף, אנו מספקים הוראות לטכניקות מתאימות להערכת התחדשות אנטומית in vivo באמצעות אקו לב ו-ex vivo באמצעות היסטולוגיה כמותית מבוססת סטריאולוגיה בלתי משוחדת.

ניתן ליישם אוטם שריר הלב המושרה על ידי פגיעה באקסולוטל כדי לחקור מנגנונים בסיסיים המעורבים בהתחדשות שריר הלב בטטרפוד זה. האקסולוטל סובלני לאוטם שריר הלב הנגרם על ידי קריו-פגיעה, המשפיע על לפחות 45% מהחדר, וכתוצאה מכך ירידה בנפח השבץ ובתפוקת הלב ללא שינויים התנהגותיים באורח חייו הרפוי יחסית, עם זאת, פציעות חמורות יותר עלולות להוביל לירידה בבריאות בעלי החיים.

בקיצור, כדי לגרום לפציעה קריו, נעשה חתך גחוני בבית החזה של אקסולוטל מורדם. הגישה לחדר מתבצעת באמצעות דיסקציה קהה ו-cryoprobe מקורר מראש מוחל למשך 10 שניות כדי לגרום לפגיעה בהקפאה. החתך הגחוני נתפר והחיה מתאוששת במהירות ללא סימנים לשינויים התנהגותיים לאחר החזרת ההכרה. חיות ביקורת/דמה מקבלות יחס דומה אך חוות קריו-פרוב שאינו מקורר. ניתן לנטר את ביצועי הלב באמצעות אקו לב (מערכות אולטרסאונד בתדר גבוה נחוצות, ≥20 מגה-הרץ) כפי שתואר באופן ממצה על לבבות אקסולוטל בריאים בעבר20, וניתן להעריך את מקטע האוטם באופן לא פולשני וחוזר במהלך תהליך ההתחדשות. ניתן לקצור לבבות עם אוטם בכל עת במהלך תהליך ההתחדשות של 3 חודשים, לעבור הקפאה לצורך היסטולוגיה ולצבוע אותם באמצעות הליכים סטנדרטיים (למשל, אאוזין והמטוקסילין או צביעת טריכרום של מאסון). בפרט, צביעת הטריכרום של מאסון מאפשרת הבחנה ברורה בין חלקים אוטמים ובריאים של החדר. מקטע האוטם של החדר נקבע באמצעות טכניקות סטריאולוגיות שתוארו בעבר עבור מחקרי לב21.

פרוטוקול

פרוטוקול זה תואם לכל התקנות וההנחיות המוסדיות (אוניברסיטת ארהוס) והלאומיות (פרוטוקול הפיקוח הלאומי על ניסויים בבעלי חיים # 2015−15−0201−00615).

1. הכנת קריו-פרוב

  1. חותכים שלושה גדילי חוט נחושת בקוטר 1 מ"מ לחתיכות של 10 ס"מ.
  2. סליל גדילי נחושת לחוט אחד.
  3. בעזרת לפיד גז ממיסים קצה אחד של חוט הנחושת ליצירת סיום כדורי בקוטר 2 מ"מ.
    הערה: לנחושת יש מוליכות תרמית גבוהה (401 W m-1 K-1 ב-0 מעלות צלזיוס) וניתן לעצב אותה בטמפרטורות הניתנות לניהול בקלות (נקודת התכה 1084.6 מעלות צלזיוס) אך למשטח נחושת יש נטייה להחליד לאורך זמן במיוחד אם הוא בא במגע עם דם, מה שמוריד את המוליכות התרמית בצורה ניכרת. לפיכך, יש ללטש קריופרוב על בסיס נחושת מדי פעם. מתכות חלופיות יציבות יותר שניתן להשתמש בהן גם עבור קריו-בדיקות הן כסף (מוליכות תרמית 428 W m-1 K-1 ב-0 °C, נקודת התכה 961.8 °C) וזהב (מוליכות תרמית 318 W m-1 K-1 ב-0 °C, נקודת התכה 1064.2 °C).
  4. הסר את הבוכנה ממזרק של 2 מ"ל ומשוך את ראש הגומי הרך.
  5. הכנס את הקצה הלא כדורי של חוט הנחושת דרך המזרק וקשר אותו לאקדח
  6. החזר את הבוכנה למקומה במזרק (איור 1A).
    הערה: כאשר ה-cryoprobe אינו בשימוש, יש להגן על חוט הנחושת על ידי משיכת הבוכנה לאחור במלואה. בעת השימוש, הבוכנה נדחפת עד הסוף כדי לחשוף את חוט הנחושת לאמבט הקירור.

2. אוטם שריר הלב הנגרם על ידי פגיעה קריולוגית

  1. להרדים אקסולוטל על ידי טבילתו ב-200 מ"ג/ליטר של חומר הרדמה בנזוקאין. שלושים דקות של טבילה יניבו ~2.5 שעות של הרדמה מלאה.
    הערה: בנזוקאין אינו מסיס במים ויש להמיס אותו תחילה ב-3 מ"ל (לכל 200 מ"ג בנזוקאין) אצטון שמתווסף לאחר מכן לאמבט המים. טבילה ממושכת בבנזוקאין עלולה לפגוע בהתאוששות, לכן יש לעקוב בקפידה אחר הזמן בבנזוקאין.
  2. הנח את האקסולוטל כשהצד הגחוני כלפי מעלה על צלחת ניתוח (ראש שמאלה למנתח ימני). לשתק על ידי עטיפת כל חלקי הגוף מלבד בית החזה במגבוני טישו ספוגים בתמיסת הרדמה (איור 1B).
    הערה: עטיפת החיה במגבוני טישו לחים מבטיחה סביבה לחה החיונית לדו-חיים ימיים ומבטלת את הצורך במשחה וטרינרית על העיניים. השתמש במכשירים חיטוי בשלבים הבאים כדי להבטיח סטריליות במהלך הניתוח.
  3. השתמשו במספריים לכריתת אירידקטומיה כדי לבצע חתך אורכי של ~1 ס"מ בעור מעט ימינה לקו האמצע של בית החזה (איור 1C).
  4. השתמש במלקחיים כדי לשחרר את לוחות הסחוס של חגורת החזה.
    הערה: חגורת החזה היא מבנה עדין ויש להקפיד שלא לפגוע באלמנטים שלה מכיוון שהדבר עלול לפגוע בריפוי פצעים מאוחר יותר ובתנועה ורווחה של בעלי חיים.
  5. פתח בעדינות את קרום הלב החשוף עם חתך מבלי לפגוע במבני הלב הבסיסיים. לפני שנוזל קרום הלב דולף החוצה, שאפו אותו למזרק של 1 מ"ל הנושא מחט קהה בקוטר 2 (איור 1D).
  6. הניחו מלקחיים קהים עם פתח קבוע (~1 ס"מ) בפצע כדי לשמור על קצוות הפצע ולוחות הסחוס במרחק זה מזה (איור 1E).
  7. הנח את ה-cryoprobe בנוזל N2 כשחוט הנחושת חשוף למשך 2 דקות לפחות.
    הערה: אם המסה של חוט הנחושת קטנה מדי (כלומר, היא קצרה מדי) או אם הוא מקורר בצורה לא מספקת, עלולה להיגרם פגיעה לא רצויה בהקפאה לא שלמה.
  8. נגבו בעדינות את החדר החשוף עם צמר גפן או מגבוני טישו מגולגלים היטב כדי לוודא שאין נוזל על פני החדר (איור 1F).
  9. הסר את הקריו-פרוב שהתקרר ל-196 מעלות צלזיוס מהנוזל N2 ומרח אותו ישירות על החדר החשוף (איור 1H). זה יתחבר לחדר. מיקום Cryoprobe צריך להיות בצד הצדדי של החדר לכיוון הקודקוד כדי למנוע נזק למבני לב אחרים ולאפשר חתכים רוחביים הבאים למיקרוסקופיה המכילה שריר לב בריא ואוטם כאחד. לאחר 10 שניות יש למרוח את נוזל קרום הלב שנאסף קודם לכן על קצה הקריופרוב (איור 1I). זה יפשיר את הגשושית ויאפשר ניתוק מהחדר.
    הערה: מריחת ה-cryoprobe על חדר עם עודף מים גורמת לאוטם הקפאה לא שלם, אם הגשושית מחוממת מהר מדי, או לנזק נרחב מדי לשריר הלב, אם שכבת מים דקה המכסה את כל פני החדר קפואה באופן מיידי. אף אחד מהמצבים אינו רצוי. במקרה של אינדוקציה מוצלחת של קריופגיעה, תופיע נפיחות מעגלית אדומה קטנה על החדר (איור 1J). כאשר מטפלים בחיות דמה, קריו-גשושית שאינה מקוררת ממוקמת באופן דומה למשך 10 שניות (איור 1G).
  10. הניחו את קרום הלב על גבי החדר, הסירו את המלקחיים שהשאירו את הפצע פתוח וסדרו מחדש את לוחות הסחוס של חגורת החזה.
    הערה: אם מבצעים אקו לב לאחר מכן כדי להעריך את תפקוד הלב, חיוני שכל כיסי האוויר, אפילו בועות זעירות הנוטות להתרחש מתחת ללוחות הסחוס, יוסרו מכיוון שאלו גורמים לחפצי הדמיה. ניתן להסיר בועות אלו על ידי לחיצה עדינה על הרקמה או על ידי הוספת תמיסת רינגר אמפיבית אוטוקלאבית (6.6 גרם/ליטר NaCl, 0.15 גרם/ליטר KCl, 0.15 גרם/ליטר CaCl2, 0.2 גרם/ליטר NaHCO3 במים מזוקקים) למשטח הפצע כדי להמיס את בועות האוויר.
  11. לתפור את העור (3-5 תפרים) באמצעות חוט נמס (6-0) (איור 1K).
  12. יש לכסות את אזור הניתוח במגבוני טישו לחים המורמים מעל הפצע ולאחר מכן להשרות בתמיסת הרדמה.
  13. הניחו את צלחת הניתוח עם החיה על קרח למשך שעתיים כדי לאפשר היווצרות ראשונית של אפידרמיס פצע, ואוטמים את קצוות הפצע לפני שהחיה נחשפת לסביבה המימית הלא סטרילית שלה.
  14. העבירו את החיה למיכל נקי עם מי אקווריום. החיה זה אמור לחזור להכרה בשלב זה. התבונן בבעל החיים עד שהוא חוזר להכרה מלאה ותנועות מתואמות. הפסק להאכיל ולהחליף מים במשך יומיים לאחר הניתוח והשאר את האקסולוטל לבד באקווריום שלו כדי לאפשר סגירת פצע לפני הכנסת הפרעות מחדש.
    הערה: לאחר שחזרו להכרה, לרוב האקסולוטל יש רצון לבלוע אוויר. כדי להקל על תהליך זה ולהגביל את כמות התנועה הדרושה, זה יכול להועיל להוריד את מפלס המים באקווריום זמן קצר לאחר הניתוח למשך 1-2 ימים לאחר הניתוח. ריכוז נמוך של בנזוקאין (20 מ"ג/ליטר) יכול לשמש כמשכך כאבים למשך 24 שעות לאחר הניתוח.

3. מדידה לא פולשנית של מקטע אוטם עם אקו לב

  1. להרדים אקסולוטל כמתואר בשלב 2.1.
  2. הנח את החיה במצב שכיבה במיכל קטן עם 3-5 מ"מ של תמיסת הרדמה המכסה את פני הגחון.
  3. הנח את מתמר האולטרסאונד לאורך הציר הארוך של החיה מעט מימין לקו האמצע של אזור בית החזה.
  4. להערכה דו-ממדית של שבר האוטם [IF(אולטרסאונד, 2D)], תרגם את המתמר עד שאזור האוטם והחדר נראים מקסימליים במצב B (איור 2A-D, חומר משלים 1-2).
  5. רכוש ≥3 מחזורי לב עם > 50 פריימים לשנייה.
  6. מדוד את שטח החתך של החדר (CSAv) ושל אזור האוטם (CSAi) בקצה הדיאסטולה והעריך את שבר האוטם הדו-ממדי על ידי הנחת צורת חדר כדורית וצורת אזור אוטם חצי כדורי באמצעות המשוואה:
    figure-protocol-1 (1)
    הערה: כדי להעריך את ההנחות הגיאומטריות של צורת החדר ואזור השבירה, ניתן לסובב את המתמר ב-90° כדי להציג את הציר הקצר view של הלב (איור 2E-F, חומר משלים 3).
  7. להערכה תלת מימדית של שבר האוטם, מקם את המתמר שמאלה או ימינה עד שרק חלק קטן מהחדר יופיע בקצה הדיאסטולה החדרית.
  8. בשלבים (z) של 0.5 מ"מ (עבור בעלי חיים קטנים, מסת גוף ≤ 20 גרם) או 1 מ"מ (בעלי חיים גדולים, מסת גוף > 20 גרם) הזיזו את המתמר על פני החדר ורכשו לפחות 3 מחזורי לב לכל צעד/פרוסה.
    הערה: לדיוק סביר יש לרכוש 8 - 12 פרוסות (n).
  9. מדוד CSAv ו-CSAi בדיאסטולה הסופית עבור כל פרוסה (j) והעריך שבר אוטם תלת מימדי [IF(אולטרסאונד, תלת מימד)] ללא הנחות גיאומטריות של צורת החדר והשבירה באמצעות המשוואה:
    figure-protocol-2 (2)
    הערה: ניתן להשתמש ברכישה דו-ממדית ותלת מימדית למדידת תפקוד הלב (נפח שבץ ותפוקת לב) באופן גיאומטרי כמתואר בסעיפים 3 ו-6 של Dittrich et al. (2018)20. כמו כן, אינטגרלי זמן מהירות נרכשים במהירות גל פועם (איור 2G) יכולים לשמש גם למדידת תפקוד הלב כמתואר בסעיף 3 ב-Dittrich et al. (2018)20.
  10. חלץ אזורי עניין של CSAv ו-CSAi מצוירים בשלב 3.9 כמסכות בינאריות עם מרווח z בין פרוסות כדי לעצב באופן תלת מימדי את החדר ואזור האוטם בקצה הדיאסטולה והסיסטולה הסופית (איור 2H, חומר משלים 4).

4. היסטולוגיה כמותית בלתי משוחדת למדידת שבר אוטם

  1. חקור את ליבו של אקסולוטל מורדם המתואר בשלב 2.2 - 2.6.
  2. באמצעות מזרק של 1 מ"ל המצויד במחט בקוטר 26, הזרקו לאט מסת גוף של 5 מיקרוליטר/גרם של 1000 IU/mL תמיסת רינגר הדו-חיים לתוך הסינוס הוורידי והמתינו 2 דקות כדי לאפשר לנוגד הקרישה להתפשט במחזור הדם.
  3. המתת חסד על ידי עריפת ראש וכריתת הלב כולו על ידי חיתוך כלי הזרימה ולאחר מכן את דרכי הזרימה.
  4. העבירו את הלב על ידי הרמתו בעדינות בנתיב הזרימה לצלחתפטרי בגודל 60 × 15 מ"מ 2 המכילה את תמיסת רינגר.
  5. בהגדלה, שטפו את כל הדם שנותר בלב על ידי מילוי עדין של הסינוס וריד ב-100 IU/mL של תמיסת רינגר.
    הערה: בעוד שקיבוע מוקדם של הלב יכול להתבצע על ידי החדרת הלב עם פורמלין או פרפורמלדהיד חוצץ, זה לא הכרחי, מכיוון שהחתך מתבצע בטמפרטורת הקפאה. לאחר מכן ניתן לבצע קיבוע של החלקים על שקופיות זכוכית. לב שטוף לחלוטין ייראה חיוור ולבנבן ואינו מכיל עקבות של כדוריות דם אדומות. סביר להניח שייווצרו קרישי דם קטנים על פני החדר והפרוזדורים. הם אינם משפיעים על הדיוק בהליך ההיסטולוגיה הכמותית שלאחר מכן.
  6. העבירו את הלב לנייר טישו נטול מוך כדי לספוג למשך דקה אחת.
  7. הכן קריומולד בגודל מתאים על ידי מריחת טיפה אחת של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית והעביר את הלב לטיפה. סחטו את הלב בעדינות לתחתית.
  8. מרחו תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית יותר כדי למלא את הקריומולד וודאו שהחדר נשאר בתחתית. השאירו את התבנית למשך 5 דקות כדי לאפשר לתרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית להתפזר בדגימה.
  9. הצמד להקפיא את התבנית על ידי הנחתה על מכסה מקופסת קצה פיפטה צפה על חנקן נוזלי.
    הערה: להקפאת הצמד מבוקרת יותר, ניתן לאחסן לבבות למשך שעה אחת למשך הלילה בתמיסת סוכרוז של 10-30% וניתן לבצע הקפאה באמצעות איזופנטן מקורר חנקן נוזלי (2-מתילבוטן). מניסיוננו, התוצאה הסופית אינה שונה באופן ניכר.
  10. מחממים את הקריומולד בקריוסטט המוגדר לטמפרטורה של -18 עד -22 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות לפני החיתוך.
  11. חתכו דגימה בעובי פרוסה של 10 מיקרומטר ואספוכל פרוסה 10 כדי לספק עובי לוח (t) של 100 מיקרומטר. המשך בחתך עד שכל הלב נחתך.
    הערה: ניתן להשתמש בעובי פרוסות ולוחות שונים, אולם חשוב שאיסוף הפרוסות יתחיל בדיוק בנקודה שבה הלהב נוגע בחדר ושהלב כולו ייחתך עם לפחות 10-12 לוחות במרווחים שווים. ניתן לאסוף יותר מפרוסה אחת לכל לוח כדי לספק סטים כפולים.
  12. מכתים קטעי רקמה עם פרוטוקולים סטנדרטיים עבור המטוקסילין ואאוזין או הטריכרום של מאסון כדי לספק הבחנה ברורה בין אפיקרדיום, שריר הלב, שסתומים ואזור אוטם.
  13. דיגיטציה של קטע הרקמות באמצעות מיקרוסקופ מצלמה או סורק שקופיות בהגדלה מספקת כדי לחשוף בבירור את המבנה הטרבקולי של חדר האקסולוטל (איור 2I).
  14. טען את ערימת התמונות לתוך ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html) ואתחל את תוסף מונה התאים (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
  15. הפעל מאקרו רשת רב-תכליתית (https://imagej.nih.gov/ij/macros/Multipurpose_grid.txt) וצור רשת נקודתית עם צפיפות רשת נאותה.
    הערה: צפיפות הרשת (שטח הרשת) תלויה בגודל המדגם ובמורפולוגיה. כדי לספק דיוק רצוי, יש להבטיח לפחות 100-200 צמתים של נקודות רשת וכל אחד מהמבנים המעניינים.
  16. ספור את מספר ההצטלבויות בין רשת נקודות למבנים מעניינים באמצעות תוסף מונה התאים (איור 2I, הגדלה מימין).
    הערה: חשוב לדיוק לכלול רק את הצמתים המופיעים בדיוק בנקודת המטרה של הכוונת.
  17. חשב את שבר האוטם משטח רשת הנקודות המוגדר מראש [Ai(p) ו-Av(p)], עובי הלוח ומספר הצטלבויות רשת הנקודות בכל לוח (Pj) עם אוטם שריר הלב ושריר הלב הכולל באמצעות הנוסחה:
    figure-protocol-3 (3)

תוצאות

באקסולוטלים עם מסת גוף של 11.8 ±-1.3 גרם ואורך כולל של 11.8 ±-0.5 ס"מ, הליך הפגיעה בהקפאה המבוצע עם קריו-פרוב בקוטר 2 מ"מ מביא לאזור אוטם המכסה 45.4 ±-14.2% משריר הלב החדר ב-7 ימים לאחר הפציעה שבהם אזור האוטם מפותח במלואו [איור 2I, השווה קטע מלב בריא לפני עבירת לב (למעלה) ו-7 ימים לאחר העבירה (למטה)]. להליך יש שיעור תמותה של 2.2% (2/90 בעלי חיים). ההליך מביא לאזור פגיעה מוגדר היטב שניתן לדמיין, לכמת ולדגמן באמצעות אקו לב לא פולשני (איור 2C-H, חומר משלים 1-4). בתחילה, אוטם שריר הלב הנגרם כתוצאה מפגיעה קריולוגית משפיע באופן משמעותי על תפקוד הלב, ומפחית את נפח השבץ ל-62.2% ואת תפוקת הלב ל-73.9% ב-7 ימים לאחר הפציעה בהשוואה לטרום הפציעה עם התאוששות הדרגתית של הצורה והתפקוד במשך שלושה חודשים (נתונים לא מוצגים). לא נצפו שינויים התנהגותיים בעקבות פגיעה בשריר הלב באקסולוטל השליו יחסית.

figure-results-1
איור 1: הליך אוטם קריו. ת, קריופרוב בהתאמה אישית מיוצר על ידי סלילה של שלושה חוטי נחושת, המסת הקצה לכדור והצמדת החוט לבוכנה של מזרק של 2.5 מ"ל. B-L, הליך אוטם הקריאום. לאחר עטיפת כל חלקי הגוף למעט אזור הניתוח במגבוני רקמות רטובים (B), מבוצע חתך גחוני בבית החזה מעט מימין לקו האמצע (מוצג ב-B) עם מספריים לכריתת אירידקטומיה (C), וחגורת החזה משוחררת על ידי דיסקציה של הגדם. קרום הלב נפתח בעדינות עם חתך ונוזל קרום הלב נשאב למזרק של 1 מ"ל באמצעות מחט קהה בגודל 23 (D). החדר נחשף והפצע נשאר פתוח עם מלקחיים עם רוחב פתח מוגדר מראש (E) וכל הנוזל שנותר בחדר נמחק (F). עבור ניתוח דמה מיושם קריופרוב לא מקורר (G) באותו אופן כמו עבור קריופגיעה, שבה מורחים את הקריופרוב המקורר בחנקן נוזלי (-196 מעלות צלזיוס) על הדופן הצדדית של החדר לכיוון הקודקוד (H). לאחר 10 שניות, נוזל קרום הלב מוחל מחדש על הקריופרוב כדי לשחרר אותו מהחדר (I). זה מניב אזור קריופגיעה מוגדר בבירור (J). לבסוף, קרום הלב וחגורת החזה מונחים על גבי הלב והעור נתפר (3-5 תפרים) בתפר נמס (K). החיה נשארת על קרח למשך שעתיים כדי להתחיל את תהליך ריפוי הפצע (L). הגולגולת היא לכיוון שמאל ב-B-L, המייצגת את כיוון החיה עבור מנתח עם יד ימין דומיננטית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: תוצאות צפויות. A ו-B, תמונות ציר ארוך במצב B של חדר אקסולוטל בריא בדיאסטולה (A) וסיסטולה (B). C ו-D, תמונות ציר ארוך במצב B של חדר אקסולוטל פצוע (יומיים לאחר הפציעה) בדיאסטולה (C) וסיסטולה (D). E ו-F, תמונות ציר קצר במצב B של חדר אקסולוטל פצוע (יומיים לאחר הפציעה) בדיאסטולה (E) וסיסטולה (F). G, דופלר גל דופק רכש אינטגרלי זמן מהירות של לב לפני (למעלה) ויומיים לאחר אוטם (למטה). H, מידול של לב לפני אוטם ויומיים לאחר אוטם מרכישת אולטרסאונד תלת מימדית. I, חתכים היסטולוגיה רוחבית מייצגת דרך חדר האקסולוטל 4 ימים לאחר דמה (למעלה) ו-7 ימים לאחר האוטם (למטה) מוכתמים בטריכרום של מאסון. הגדלה מימין מציגה רשת נקודות למדידה סטריאולוגית של שבר אוטם. נקודות המסומנות בעיגולים כחולים ואדומים מייצגות הצטלבות עם רקמות בריאות (עיגולים כחולים) ואוטמים (עיגולים אדומים). הגולגולת היא לכיוון ימין ב-A-D ובעלי חיים ימינה לכיוון שמאל ב-E-F, המייצג את התצוגה הקונבנציונלית של תמונות אקו לב. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

חומר משלים 1: ציר ארוך, חדר בריא לפני אוטם, מצב B (ראה איור 2A-B). אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

חומר משלים 2: ציר ארוך, חדר אוטם (יומיים לאחר האוטם), מצב B (ראה איור 2C-D). אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

חומר משלים 3: ציר ציר קצר, חדר אוטם (יומיים לאחר האוטם), מצב B (ראה איור 2E-F). אנא לחץ כאן להורדת סרטון זה.

חומר משלים 4: מודלים אינטראקטיביים תלת מימדיים של אותו לב כפי שניתן לראות באיור 2A-H וחומר משלים 1-3 לפני ואחרי אוטם. הפעל את קובץ ה-PDF האינטראקטיבי ב-Adobe Acrobat Reader 9 ואילך. לחצו על הדגם כדי להפעיל את תכונת התלת-ממד. סובבו, הגדלו והזזו את הדגם באמצעות הסמן. בעץ המודל בצד שמאל של המסך, ניתן להפעיל/להשבית את כל המקטעים או להפוך אותם לשקופים. עץ המודל בנוי כהירארכיה המכילה מספר שכבות משנה הניתנות לפתיחה (על-ידי בחירה באפשרות +). אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

דיון

כדי למזער את השונות הניסיונית, ההליך הכירורגי של הפגיעה צריך לעבור הליכים סטריליים ויש לבצע הכשרה כירורגית על מספר בעלי חיים לפני שמנסים להשתמש בבעלי חיים לניסויים רגנרטיביים ספציפיים. עם אימון, ניתן לבצע את הליך הפגיעה בהקפאה במגוון רחב של גדלים וגילאים של אקסולוטלים, החל מצעירים (5 גרם, 7 ס"מ) ועד בוגרים גדולים (100 גרם, 25 ס"מ). זה קריטי שהקריו-פרוב יהיה בגודל מספיק ומקורר כראוי כדי לספק פגיעה חזקה וניתנת לחזרה לחדר האקסולוטל. עבור בעלי חיים קטנים מאוד (5-8 גרם, 7-9 ס"מ), ניתן לבנות את הקריופרוב בקוטר קטן יותר. אמנם הכרחי שפרוטוקול ה-cryoinjury יתבצע באמצעות חומר הרדמה בעל תכונות משככות כאבים כמו בנזוקאין ו-MS-222 (או עם יישום נוסף של חומר משכך כאבים משני), ניתן לבצע אקו לב מעקב עם חומרי הרדמה אחרים בעלי תכונות משככות כאבים מוגבלות בלבד, כגון פרופופול, שתואר כמשפיע על תפקוד הלב פחות מבנזוקאין ו-MS-222 באקסולוטל22.

הליך הפגיעה בהקפאה מוגבל במובן זה שהוא אינו מייצר אוטם שריר הלב הנגרם על ידי איסכמיה על ידי חסימת עורקים כליליים באותו אופן כמו הליכי קשירת עורקים כליליים הדומים יותר למקרים קליניים של אוטם שריר הלב בבני אדם. עם זאת, השיטה המבוססת על קשירה אינה ישימה בלב הדו-חיים הטרבקולט עם מעט מאוד כלי דם כליליים ואספקת חמצן לומינלית בעיקרה. כמו כן, אוטם שריר הלב הנגרם על ידי פגיעות קריולוגיות תואר כדי לסכם את רוב ההשלכות הפתולוגיות של אוטם שריר הלב הנגרם על ידי איסכמיה14,16. אזור הפגיעה שנוצר על ידי פגיעה בהקפאה ממוקם מאוד לרקמה הסמוכה לקריופרוב, ולמרות שזה לא דומה לאוטם מורכב ומסועף הנובע מחסימה כלילית, זה יתרון בסביבה ניסויית שכן ניתן לזהות בקלות את אזור הגבול בין רקמה בריאה לאוטם, וניתן לחקור את התקדמות הקרדיומיוציטים החדשים שנוצרו.

האקסולוטל הוא בעל חיים גדול בהרבה מדגי הזברה עם מערכת לב וכלי דם מורכבת יותר, כולל לב המורכב משלושה חדרים (שני פרוזדורים, חדר אחד) והפרדה פונקציונלית, אם כי לא אנטומית, של זרימת הדם בזרמים מחומצנים ובלתי מחומצנים23 בהשוואה למערכת הלב הדו-תאית ומערכת הזרימה הטורית הנמצאת בטלאוסטים. הליך הפגיעה בהקפאה שתואר בעבר בדג הזברה אינו כרוך בתפירה לאחר הניתוח של משטח הגחון החתוך16,17. זה הכרחי באקסולוטל כדי למנוע חשיפה מיותרת של הלב לסביבה המימית הלא סטרילית בבית הגידול המעבדתי של החיה.

היסטולוגיה כמותית מבוססת סטריאולוגיה בלתי משוחדת אינה מדווחת כיום בתחום ההתחדשות שבו רוב המדידות הכמותיות של שבר האוטם מסתמכות על שטח המבוסס על חתך היסטולוגי באזור האוטם האמצעי ובמקרים מסוימים שני קטעים שכנים24. מכיוון שניתן ליישם את מושג הסטריאולוגיה בבדיקות היסטולוגיות בכל מין מודל כדי לספק מדידות חזקות ובלתי מוטות יותר, אנו מציעים לשלב שיטה זמינה זו בהערכות כמותיות של התחדשות הלב לא רק באקסולוטל, אלא בכל המינים המתחדשים.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מבקשים להודות לקספר בינדזוס פולדגר, אסגר אנדרסן ומייקל פדרסן (כולם במחלקה לרפואה קלינית, אוניברסיטת ארהוס) ולדיוויד גרדינר (המחלקה לביולוגיה התפתחותית ותאית, אוניברסיטת קליפורניה, אירווין) על העזרה בפיתוח הראשוני של מודל הקריאו-פגיעה באקסולוטל ובדיקת אולטרסאונד.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
S& מספריים T SAS-15S& T AG - מכשיריםמספריים לכריתת אירידקטומיה
Vevo 2100Fujifilm, VisualSonicsסורק אולטרסאונד בתדר גבוה
מיקרוכירורגיים

מקורות

  1. Forouzanfar, M. H., et al. Assessing the global burden of ischemic heart disease, part 2: analytic methods and estimates of the global epidemiology of ischemic heart disease in 2010. Global Heart. 7, 331-342 (2012).
  2. Go, A. S., et al. Executive summary: heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, 399-410 (2014).
  3. Murry, C. E., Reinecke, H., Pabon, L. M. Regeneration gaps: observations on stem cells and cardiac repair. Journal of the American College of Cardiology. 47, 1777-1785 (2006).
  4. Laflamme, M. A. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
  5. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298, 2188-2190 (2002).
  6. Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187, 249-260 (1974).
  7. Cano-Martínez, A., et al. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Archivos de Cardiología de México. 80, 79-86 (2010).
  8. Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Developmental Biology. 354, 67-76 (2011).
  9. Mercer, S. E., Odelberg, S. J., Simon, H. -G. A dynamic spatiotemporal extracellular matrix facilitates epicardial-mediated vertebrate heart regeneration. Developmental Biology. 382, 457-469 (2013).
  10. Piatkowski, T., Mühlfeld, C., Borchardt, T., Braun, T. Reconstruction of the myocardium in regenerating newt hearts is preceded by transient deposition of extracellular matrix components. Stem Cells and Development. 22, 1921-1931 (2013).
  11. Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jaźwińska, The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Developmental Biology. 11 (21), (2011).
  12. González-Rosa, J. M., Martín, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
  13. Schabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS ONE. 6 (4), 18503(2011).
  14. Van den Bos, E. J., Mees, B. M. E., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. The American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology. 289, 1291-1300 (2005).
  15. Yang, Y., et al. Characterization of cryoinjury-induced infarction with manganese-and gadolinium-enhanced MRI and optical spectroscopy in pig hearts. Magnetic Resonance Imaging. 28, 753-766 (2010).
  16. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nature Protocols. 7, 782-788 (2012).
  17. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666(2012).
  18. Lauridsen, H., Pedersen, M. Rebuilding a heart: complete regeneration after myocardial infarction in the axolotl. The Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), (2014).
  19. McCusker, C., Gardiner, D. M. The axolotl model for regeneration and aging research: a mini-review. Gerontology. 57, 565-571 (2011).
  20. Dittrich, A., Thygesen, M. M., Lauridsen, H. 2D and 3D Echocardiography in the Axolotl (Ambystoma Mexicanum). Journal of Visualized Experiments. (141), e57089(2018).
  21. Mühlfeld, C., Nyengaard, J. R., Mayhew, T. M. A review of state-of-the-art stereology for better quantitative 3D morphology in cardiac research. Cardiovascular Pathology. 19, 65-82 (2010).
  22. Thygesen, M. M., Rasmussen, M. M., Madsen, J. G., Pedersen, M., Lauridsen, H. Propofol (2,6-diisopropylphenol) is an applicable immersion anesthetic in the axolotl with potential uses in hemodynamic and neurophysiological experiments. Regeneration (Oxf.). 4, 124-131 (2017).
  23. Malvin, G. M., Heisler, N. Blood flow patterns in the salamander, Ambystoma tigrinum, before, during and after metamorphosis. Journal of Experimental Biology. 137, 53-74 (1988).
  24. Juul-Belling, H., Hofmeister, W., Andersen, D. C. A systematic exposition of methods used for quantification of heart regeneration after apex resection in zebrafish. Cells. 9, 548(2020).

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

התחדשות לב מושרית על ידי פגיעה בהקפאהאוטם שריר הלב באקסולוטלגודל אוטם באקו-קרדיוגרפיהמנגנוני תיקון לבבייםמודל התחדשות של טטרפודיםאוטם מושרה על ידי איסכמיההשוואה לחיתוך חדריםדימות לא פולשנימדידת אוטם היסטולוגית

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.