הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

אפנון מולקולרי על ידי shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס בנוירונים סטרס ברשתית האנדופלסמית

1.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/61974

⸱

24 באפריל 2021

 ,  , 
1Instituto de Investigación Médica M y M Ferreyra, INIMEC-CONICET, Universidad Nacional de Córdoba

במאמר זה

סיכום

במחקר הנוכחי, הביטוי מופל משני מרכיבי איתות במורד הזרם של מסלול PERK, הקלצינוירין הציטופרוטקטיבי וה- CHOP הפרו-אפופטוטי, באמצעות shRNA ספציפי. בדרכים הפוכות, אלה מווסתים את הרגישות של נוירונים קליפת המוח הראשוניים לניוון עצבי לאחר השראת מתח רשתית אנדופלסמית.

תקציר

הצטברות של חלבונים מקופלים בתוך הרשתית האנדופלסמית (ER), הנגרמת על ידי כל מצב לחץ, מפעילה את תגובת החלבון המקופלת (UPR) באמצעות הפעלת חיישנים מיוחדים. UPR מנסה תחילה לשחזר הומאוסטזיס; אבל אם הנזק נמשך, האיתות גורם לאפופטוזיס.

ישנן ראיות הולכות וגדלות לכך שלחץ מתמשך ובלתי פתור בחדר המיון תורם למצבים פתולוגיים רבים, כולל מחלות נוירודגנרטיביות. מכיוון שה-UPR שולט בגורל התא על ידי מעבר בין תהליכים ציטופרוטגונטיים ואפופטוטיים, חיוני להבין את האירועים המגדירים את המעבר הזה, כמו גם את האלמנטים המעורבים במודולציה שלו.

לאחרונה הדגמנו כי הצטברות חריגה של גנגליוזיד GM2 גורמת לדלדול תכולת ER Ca2+ , שבתורה מפעילה את PERK (PKR-like-ER kinase), אחד מחיישני ה-UPR. יתר על כן, איתות PERK משתתף בניוון הנויריטים ובאפופטוזיס המושרה על ידי הצטברות GM2. מבחינה זו, הקמנו מערכת ניסיונית המאפשרת לנו לווסת מולקולרית את הביטוי של רכיבי PERK במורד הזרם ובכך לשנות את הפגיעות של נוירונים לעבור ניוון עצבי.

ביצענו הפלה של ביטוי calcineurin (cytoprotective) ו-CHOP (פרו-אפופטוטי) בתרביות נוירונים בקליפת המוח של חולדות. התאים נדבקו ב-shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס ולאחר מכן טופלו ב-GM2 בזמנים שונים, תוקנו והוכתמו במערכת החיסון באמצעות נוגדן אנטי-MAP2 (חלבון 2 הקשור למיקרו-צינוריות). מאוחר יותר, תמונות תאים הוקלטו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי וצמיחת נוירוט כוללת הוערכה באמצעות תוכנת עיבוד התמונה ImageJ הנחלת הכלל. עיכוב הביטוי של אותם רכיבי איתות PERK איפשר בבירור להאיץ או לעכב את הניוון העצבי הנגרם על ידי לחץ במיון.

גישה זו עשויה לשמש במודלים של מערכת התא של עקה בחדר מיון כדי להעריך את פגיעותם של נוירונים לניוון עצבים.

מבוא

לחץ רשתית אנדופלסמית (ER) מוגדר ככל הפרעה הפוגעת ביכולת קיפול החלבון באברון. הצטברות החלבונים המקופלים בתוך לומן המיון מפעילה אות מפל התמרה הנקרא תגובת חלבון מקופלת (UPR). מסלול איתות מורכב זה מתוזמר על ידי שלושה חיישני מאמץ: PERK (חלבון קינאז RNA [PKR]-like ER kinase), IRE1 (אנזים הדורש אינוסיטול 1) ו-ATF6 (גורם שעתוק מופעל 6). כולם יחד מנסים לשחזר את ההומאוסטזיס. אבל אם הלחץ נמשך, UPR בסופו של דבר גורם למוות תאי על ידי אפופטוזיס1.

PERK, חלבון טרנסממברנה של ER, על לחץ ER, מוביל את הזרחן של גורם החניכה האיקריוטי-2 אלפא (eIF2α), ומפחית את סינתזת החלבונים הגלובלית ובכך את עומס החלבונים ב- ER2. הראינו כי calcineurin A/B (CNA/B), הטרודימר Ca2+ phosphatase, קושר ישירות את התחום הציטוסולי של PERK, מגביר את הזרחן העצמי שלו ומשפר באופן משמעותי את עיכוב תרגום החלבונים ואת כדאיות התא 3,4. באופן מעניין, CNA/B נמצא בשפע במוח היונקים, ומבחין בין שני איזופורמים של תת-היחידה A של CN: α ו-β.

תחת לחץ מתמשך בחדר המיון, מסלול האיתות PERK הוא ענף ה-UPR היחיד שנותר פעיל, ובכך מתווך הן את התגובה הפרו-הישרדותית והן את התגובה האפופטוטית. בשלב הכרוני, אירוע מרכזי אחד במורד הזרם הוא השראת גורם השעתוק, CHOP (CCAAT/enhancer binding protein homologous protein)5. לחץ כרוני בחדר מיון מוכר יותר ויותר כתורם נפוץ למגוון רחב של הפרעות פתולוגיות, כולל מחלות נוירודגנרטיביות6. חשוב להבין כיצד UPR יכול להקל על איתות cytoprotective במקום מוות תאי 7. עם זאת, כיום מעט ידוע על המנגנון המדויק השולט במעבר בין שני שלבי UPR אלה.

לאחרונה מצאנו כי בתאי עצב בתרבית, גנגליוזיד GM2 מצטבר בקרומי המיון וגורם לדלדול הסידן הלומינלי. זה בתורו מפעיל איתות PERK, אשר מתווך ניוון עצבי אפופטוזיס 8. במחקר זה, הצטברות GM2 בתאי עצב בתרבית משמשת כמודל של מערכת התא של ניוון נוירוטים הנגרם על ידי לחץ ER. באופן ספציפי, שני ביטויי גורם PERK הם מניפולציה, CN-Aα ו CHOP, אשר מחליף את המעבר בין אירועים מוקדמים / מגן לשלב כרוני / אפופטוטי. כדי להשיג זאת, הגנים המתאימים מושתקים; לפיכך, תרביות נוירונים ראשוניים בקליפת המוח נגועים ב-shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס. ניתוח כתמים מערביים מגלה ירידה משמעותית ברמות הביטוי של CN-Aα ו- CHOP בהשוואה לתאי הביקורת, הנגועים בלנטיוירוס הנושאים shRNA מקושקש. לאחר טיפול זה, נוירונים נתונים לזמני דגירה שונים של GM2 אקסוגני, קבוע, ומוכתמים חיסוניתעם נוגדן 2 הקשור לחלבון 2 (MAP2) 9. התמונות מתקבלות באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. הגידול הכולל של תאי עצב מוערך ביחס למספר התאים הכולל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ההליכים בבעלי חיים מבוצעים על פי פרוטוקולים מאושרים של המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. אישור לביצוע המחקר ניתן על ידי ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים (CICUAL) של INIMEC-CONICET-UNC (החלטה מספרים 014/2017 B ו- 006/2017 A).

1. תרביות נוירונים ראשוניים בקליפת המוח של חולדות

  1. הרדימו חולדות הרות מסוג E18 Wistar בתאCO2 עם תערובת של 80% CO 2/20% O2 למשך 60 שניות של חשיפה, ולאחר מכן הקריבו אותן על ידי נקע חוליות הצוואר.
  2. בצע את השלבים הבאים במכסה מנוע זרימה למינרית. לחלץ אנצפלון מן העוברים עם מלקחיים בסגנון # 3 ומספריים קפיציים קטנים ישרים וחדים (טבלה של חומרים) לתמיסת הנקס בצלחות תרבית תאים.
  3. נתחו את הרקמה תחת זכוכית מגדלת 20x, באמצעות שני מלקחיים עדינים בסגנון #5, המפרידים את קליפת המוח הקדמית מקרומי המוח. מעבירים את קליפת המוח הקדמית לצינור חרוטי של 15 מ"ל ודגרו על הרקמה עם 3-4 מ"ל של טריפסין-EDTA (0.25%) למשך 15 דקות, בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לעיכול כימי.
  4. לאחר העיכול, לדלל אותו עם 3-4mL של מדיום עיט שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% סרום עגל עוברי (FCS). לאחר מכן שטפו אותו 3 פעמים עם תמיסת מלח מאוזן של Hanks 2+/Mg 2+ ללא Ca 2+/Mg ו-0.1% גלוקוז בצנטריפוגה (3000 גרם למשך 5 דקות).
  5. נתק באופן מכני את הרקמה 10 פעמים על ידי צנרת למעלה ולמטה באמצעות קצה 1000 μL, ב- DMEM בתוספת 10% FCS (טבלה של חומרים). לאחר מכן צנטריפוגו את ההומוגנאט ב 100 x גרם במשך דקה אחת, לאסוף את supernatant ולהשלים את הנפח הנותר ל 1000 μL.
  6. לוחית את תרחיף התא על צלחות תרבית תאים בצפיפות של 520 תאים/מ"מ 2 עם2 מ"ל DMEM המכיל 10% FCS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-1% תוסף חומצות אמינו חיוניות (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן יש לדגור בטמפרטורה של 37°C בסביבה לחה עם 5% CO2 למשך שעתיים.
    1. הסרת חומר אורגני וציפוי פולי-ל-ליזין של צלחות תרבית תאים
      1. הסר את החומר האורגני על ידי הנחת חומר הזכוכית בתא תגובה והוסף 96% אלכוהול אתילי כמעט כדי לכסות את החומר. לאחר מכן הוסיפו 68% (w/v) חומצה חנקתית טיפה אחר טיפה עד שבועות חומות-ירקרקות מתחילות להופיע. ברגע שזה קורה, לכסות חלקית את המיכל ולאפשר את התגובה להמשיך עד פיצוץ מפסיק.
        הערה: יש להסיר את החומר האורגני מתחת לתא מיצוי גזים כדי למנוע חשיפה לגזים רעילים.
      2. לפני ציפוי פולי-ל-ליזין, יש לשטוף את הכוסות במים סטריליים מסוג Mili-Q כעשר פעמים. לאחר מכן יש לדגור על כוסות התרבית והצלחות עם פולי-L-ליזין 0.1 מיקרוגרם/μL למשך 4 שעות לפני השימוש בהם. לאחר הדגירה שוטפים את הכוסות במים סטריליים מסוג Mili-Q כעשר פעמים.
  7. כדי לאפשר התמיינות של תאים עצביים, החליפו את המדיום למדיום נוירו-בסיסי נטול סרום, עם תוסף ללא סרום (רשימת חומרים). שמור על תרביות ב 37 ° C עם 5% CO2 עד הטיפול.

2. ייצור Lentivirus

הערה: האוליגונוקלאוטידים המכילים את הרצפים המכוונים ל-3'UTR של איזופורם CN-Aα או CHOP ועם רצפים שאינם ממוקדים (ערבול) מפורטים בטבלה 1.

  1. לחישול, ערבבו שני אוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים עם רצפים משלימים בכמויות מולריות שוות, באמצעות חיץ חיץ (10 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA).
  2. חממו בחום של 95°C למשך 2 דקות ולאחר מכן קררו לאט על ידי העברת דגימות מבלוק החום או אמבט המים לספסל בטמפרטורת החדר. לדלל את המוצר המתקבל [RNA סיכת שיער קצרה, (shRNA) עם קצוות מלוכדים] לריכוז סופי של 0.5 מיקרומטר, aliquot אותם ולאחסן ב -20 ° C.
  3. שכפל את החדרת ה-shRNA לווקטור lentiviral pLKO.3G, עם GFP כסמן פלואורסצנטי ירוק. לשם כך, לעכל 1 מיקרוגרם של וקטור עם אנזימי הגבלה EcoRI ו- PacI על ידי ערבוב הדברים הבאים בצינור סטרילי: 2 μL של חיץ אנזים הגבלה 10x (100 mM bis-Tris פרופאן-HCl, pH 6.5, 100 mM MgCl2, 1 מ"ג / מ"ל אלבומין בסרום בקר), 1 μL של 1 מיקרוגרם / μL pLKO.3G, 0.5 μL של 10 U/μL ECoRI, 0.5 μL של PacI (10 U/μL), ו-16 μL של מים מיוננים סטריליים.
    1. מערבבים בעדינות על ידי פיפט. לדגור את התגובה במשך 3-4 שעות ב 37 ° C.
      הערה: עיכול במהלך הלילה הוא בדרך כלל מיותר ועלול לגרום לפירוק DNA.
  4. עבור קשירה, מערבבים את הווקטור המעוכל ומכניסים ביחס מולארי של 3:1 ודגרים אותו עם T4 ligase ו ligase buffer (מסופק על ידי היצרן) במשך הלילה ב 16 ° C.
    הערה: בשלב זה ניתן לאחסן תגובת קשירה בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף.
  5. התמירו תאים מוכשרים מסוג DH5α (טבלת חומרים) או זן E. coli מתאים אחר עם תגובת הקשירה כדלקמן.
    1. מערבבים E. coli מוכשר עם הנפח הכולל של תגובת קשירה ומצננים אותו על קרח במשך 15 דקות, מניחים אותו באמבטיה של 42 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות ואז מצננים אותו שוב על קרח למשך 15 דקות.
    2. העבר את הנפח הכולל הנתון להלם חום לצינור של 15 מ"ל והשלם את הנפח ל 1000 μL עם תווך נוזלי Luria-Bertani (LB) שנשמר בעבר ב 37 ° C. נערו את החיידקים במשך 90 דקות ב-37°C בשייקר מסלולי, בערך 330 סל"ד.
    3. צנטריפוגו אותם במהירות של 5,000 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C והשליכו 900 מיקרוליטר של סופר-נטנט. השתמש supernatant שנותר כדי להשעות מחדש את הכדור. יש לפזר את תרחיף החיידקים באופן שווה על צלחת LB מוצקה של אמפיצילין (100 מיקרוגרם/מ"ל).
    4. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה, ולאחר מכן לבדוק את צמיחת החיידקים. בשלב זה, החיידקים עשויים להיות מאוחסנים ב 4 ° C במשך 4-5 ימים.
    5. בחר מושבה אחת להעביר לתוך צינור 50 מ"ל עם 10 מ"ל של LB נוזל בינוני אמפיצילין (100 מיקרוגרם / מ"ל). יש לנער את החיידקים בטמפרטורה של 37°C בסביבות 330 סל"ד.
    6. צנטריפוגה את התרבית כדי לגלול את החיידקים ב 5,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, להשליך את supernatant ולשמר את גלולת החיידקים. זה יכול להיות מאוחסן ב -20 °C.
  6. לטהר את הפלסמיד עם ערכת טיהור DNA מכדורי חיידקים בהתאם להוראות היצרן (רשימת חומרים). חשב את ריכוז ה- DNA על ידי מדידת הספיגה ב- 260 ננומטר והכפלה בגורם הדילול, באמצעות הקשר הבא: A260 של 1.0 = 50 מיקרוגרם / מ"ל DNA טהור גדיל כפול (ds).

3. זיהום Lentivirus

הערה: בצע את הליך יצירת lentivirus במכסה מנוע זרימה למינרית Class II.

  1. 24 שעות לפני ההדבקה, זרעו 1-5 × 106 HEK 293 תאים לתוך 100 מ"מ של צלחות תרבית בקוטר 8 מ"ל של מדיום גידול ולדגור אותם ב 37 ° C, 5% CO2 לילה.
  2. יש לערבב 14 מיקרוגרם של וקטור pKLO.3G עם תוספת ספציפית, 10.5 מיקרוגרם של פלסמיד אריזה psPAX ו-3.5 מיקרוגרם של פלסמיד מעטפה pMD2.G (טבלת חומרים). לדלל 45 μL של מגיב טרנספקציה פלסמיד (טבלה של חומרים) ב 700 μL של מדיה מופחתת בסרום (טבלה של חומרים) ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן ערבבו את תערובת הדנ"א עם מגיב הפלסמיד המדולל, ערבבו בעדינות ודגרו במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. בינתיים, לשנות עבור DMEM טרי את המדיום של צלחת התרבית של HEK 293 תרביות תאים (70% confluent בזמן transfection). לאחר מכן הוסף את כל נפח תמיסת ה- DNA טיפה אחר טיפה. רוק את המנה בעדינות. אין צורך להוסיף/לשנות מדיום לאחר טרנספקציה.
  4. לדגור על התאים ב 37 ° C, 5% CO2 במשך 48 שעות - 72 שעות כדי לאפשר shRNA להגיע להתמרה אופטימלית שלהם נבדק על ידי פלואורסצנטיות GFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לאחר מכן, לאסוף את המדיום עם lentivirus ולאחסן ב 4 °C (75 °F).
  5. סנן supernatant ויראלי עם קרום ניילון 0.45 מיקרומטר. Aliquot את זרימת דרך ב 1 מ"ל. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 17,000 x גרם במשך 4 שעות. השליכו את הסופרנאטנט ושמרו את הכדור. אפשר גלולה בלתי נראית להתייבש, ולאחר ייבוש, לאחסן ב - 80 ° C.
    1. בצע טיטרציה ויראלית על ידי ציטומטריית שטף. זרע 4 x 105 HEK 293 תאים בצלחות 24 באר לדגור ב 37 ° C במשך 24 שעות. לאחר מכן להשעות מחדש את החלקיקים הנגיפיים ב 200 μL של מדיום תרבית DMEM (טבלה של חומרים) ולהוסיף 0.05, 0.02, ו 0.005 μL לכל באר.
    2. לדגור זיהום ויראלי במשך 72 שעות, להסיר בינוני טריפסיניזציה (0.05% טריפסין, 1 מ"ל) במשך 3 דקות. הוסף 1 מ"ל DMEM בתמיסת FCS 10% וצנטריפוגה ב 500 x גרם למשך 5 דקות. השליכו את הסופרנאטנט ושטפו את הגלולה פעמיים עם PBS.
    3. השהה מחדש את הגלולה עם 100 μL של PBS ותקן את התאים עם 100 μL של 2% paraformaldehyde (PFA) ב- PBS. לנתח את התאים עם ציטומטר שטף ולקבוע את אחוז התאים הפלואורסצנטיים GFP. אסוף נתונים אלה כדי לחשב טיטרציה ויראלית באמצעות הנוסחה הבאה:
      טיטרציה ויראלית
      figure-protocol-1

4. תרביות נוירונים ראשוניות בסטרס עם הצטברות גנגליוזיד GM2 ואימונוציטוכימיה באמצעות נוגדן אנטי-MAP2

  1. הדביקו את תרביות תאי העצב הראשוניים בקליפת המוח (15 ימים במבחנה) באוליגונוקלאוטידים ספציפיים של shRNA המכוונים ל-3' UTR של CN-Aα או CHOP ודגרו עליהם בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2 למשך יום אחד.
    הערה: תרביות נוירונים קליפת המוח ראשוניות של 7-8 ימים במבחנה יכולות לשמש גם אם התאים מראים צמיחה עצבית גבוהה.
    1. הכינו תמיסת מלאי של 500 מיקרומטר של גנגליוזיד GM2 באתנול וניקו אותה למשך שעה אחת.
    2. הוסף תמיסת ציר GM2 לצלחות התרבית בריכוז סופי של 2 מיקרומטר. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם 5%CO2 למשך 16, 24 ו-48 שעות.
  2. השתמש בתרביות מסוימות כדי להכין הומוגנט תאי לניתוח כתמים מערביים (למפרט נוגדנים, ראה טבלת חומרים).
  3. בצע את שלבים 1.4. ו-1.5. ולאחר מכן לתקן את התאים עם 4% PFA ו 120 mM סוכרוז ב PBS במשך 20 דקות ב 37 ° C, ולאחר מכן לשטוף אותו עם PBS. בצע הליך זה על קרום נגד החלקה בתא רטוב. לאחר מכן, יש להוסיף תמיסת חדירה (0.2% Triton X-100 ב-PBS) למשך 5 דקות ולשטוף עם PBS.
    1. יש להשתמש ב-5% BSA מדולל ב-PBS למשך 45 דקות כדי לאפשר חסימה, ולאחר מכן לדגור עם נוגדן אנטי-MAP2, מדולל 1:800 בתמיסת חסימה, ב-4°C למשך הלילה.
    2. בתום זמן הדגירה, יש לשטוף פעמיים עם PBS ולדגור עם נוגדן משני (טבלת חומרים) למשך שעה אחת. לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS והרכיבו את המשקפיים על שקופיות באמצעות אמצעי הרכבה מימי (Table of Materials).

5. ניתוח ניוון עצבים

  1. קבל תמונות עם עדשת אוויר 20x (NA 0.8) באמצעות מיקרוסקופ הפוך אפיפלואורסצנטי המצויד במצלמת CCD. נתח תמונות באמצעות תוספי ImageJ. לשם כך, טען את התמונה ל- ImageJ והחסר את הרקע על ידי לחיצה על תהליך | חיסור רקע.
  2. לחץ על תמונה | התאמה | סף או הקלד את המקשים הבאים: Ctrl (או Cmd) + Shift + T. חלון נפתח כדי להתאים ערכי מינימום, ומאפשר להבחין בין עקבות נתיב וסומה. לחץ על התמונה הבינארית (neurites ו somas הם בצבע לבן). בתמונה זו, השתמש בבחירה חופשית כדי למחוק סומות; אזור הסומא שנבחר הופך שוב לשחור.
  3. בחר מעקבים ולחץ על ערוך | בחירה | צור בחירה. קבל את החזר ההשקעה על ידי לחיצה על Ctrl (או Cmd) ו- T מקשים של הבחירה ושמור אותה. פתח את התמונה המקורית, ולאחר מכן לחץ על לוח מנהל החזר ההשקעה ובחר את החזר ההשקעה השייך, שהושג בעבר. לאחר מכן לחץ על התמונה המקורית.
  4. לאחר מעקב אחר החזר ההשקעה על התמונה, הקלד Ctrl (או Cmd) ו - M מקשים (נתח | מידה). חלון נפתח; העתק את הערך הממוצע (יחידות שרירותיות A.U.) כדי לעבד ניתוח סטטיסטי.
    הערה: כדי לקבל ערכים כמיקרומטר, לחץ על נתח | הגדר קנה מידה. חלון מוקפץ פתוח כדי להגדיר ערכים. הקפד להוסיף את קנה המידה הנכון (ניתוח | הגדר קנה מידה) בהתאם למאפייני המיקרוסקופ המשמש.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

כאן, אנו מתייחסים לשאלה האם השתקת שני רכיבי PERK במורד הזרם משפיעה על שלב המעבר של UPR במודל תאי לחץ ER. כדי להשיג זאת, אנו משתיקים את הגן CN-Aα כמו גם את הגן CHOP על ידי שני רצפי shRNA ספציפיים עבור כל אחד (טבלה 1) בתרבית תאי עצב ראשונית למשך יוםאחד 10. הביטוי מנותח על-ידי כתמים מערביים (איור 1 ואיור 2). עיכוב ברור נצפה של עלייה CN-Aα ו- CHOP בתיווך לחץ ב- ER בתאי דפיקה, אך לא בתאי ביקורת (shRNA scrambl...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

אנו מתארים מערכת ניסויית המאפשרת אפנון מולקולרי של המעבר משלב הישרדות לשלב UPR אפופטוטי במודל תאי עצב.

לצורך ניתוח נכון של ניוון עצבים, חיוני להשיג תרביות נוירונים ראשוניות עם תהליכים רבים, ארוכים ומסועפים מאוד 9,11. זה מקל על בחינת הארכת תהליך הנוירונים, ומאפשר לזהות את ההבדלים הברורים בין הטיפולים. חשוב לציין כי אם תרביות נוירונים ראשוניים בקליפת המוח לאחר 7-8 ימים במבחנה כבר מראים צמיחה גבוהה של נוירוטים, ניתן להשתמש בהם כד...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

אנו מודים לד"ר גונזלו קוואסולו על עזרתו שלא תסולא בפז בהדמיה ולד"ר אנדראה פלגריני על התמיכה הטכנית בתרביות תאים.

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ: המכון הלאומי לבריאות, ארה"ב (#RO1AG058778-01A1, Subaward Agreement No 165148/165147 בין UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra) ומהסוכנות הלאומית של Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Argentina (ANPCyT, PICT 2017 #0618).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Alexa Fluor 488 Anti-MouseThermo Fisher Scientific#R37120
anti-CHOPThermo FisherMA1 - 250
Anti-CN-AαMillipore# 07-067
Anti-GM2Matreya#1961
anti-MAP2Sigma Aldrich# M2320
anti-β-actinThermo Fisher# PA1 - 183
aprotininSanta Cruz Biotechnology#3595
Axiovert 200 מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיZeiss
B27 תוסףLife Technologies#17504944
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Life Technologies#11966025
EcoRIPromega#R6011
סרום עגל עוברי (FCS)Life Technologies#16000044
מלקחיים עדינים   סגנון #5מלקחיים בסגנון דומונט
#3Dumont
HEK 293ATCC#CRL-1573
IRDye 680 CW נוגדן משניLI-COR Biosciences#92632221
IRDye 680 נוגדן משניLI-COR Biosciences#92632220
IRDye 800 CW נוגדן משניLI-COR Biosciences#92632210
IRDye 800 CW נוגדן משניLI-COR Biosciences#92632211
lentiviral מעטפת פלסמיד pMD2.GAddgene#12259
lentiviral אריזה פלסמיד psPAX2Addgene#12260
lentiviral vector pLKO.3GAddgene#14748
לופפטין המיסולפטסנטה קרוז ביוטכנולוגיה#295358
ליפופקטמין LTX & Plus Reagent (מגיב טרנספקציה פלסמיד)Life Technologies#A12621
MISSION shRNASigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2Matreya#1502
NanoDrop 2000Thermo Scientific
Neurobasal MediumLife Technologies#21103049
קרום ניטרוצלולוזה 0.45 & מיקרו; mBIO-RAD#1620115
מערכת הדמיית אינפרא אדום OdysseyLI-COR Bioscience
OneShot Top 10Life Technology#C404010
Opti-MEM (מדיה בסרום מופחת)Life Technologies#105802
PacIBioLabs#R0547S
פניצילין-סטרפטומיציןLife Technologies#15140122
פפסטין Aסנטה קרוז ביוטכנולוגיה#45036
פניל-מתיל-סולפוניל פלואורידסנטה קרוז ביוטכנולוגיה#329-98-6
פולי-L-ליזיןסיגמא אולדריץ'P#2636
מספריים קפיציים קטנים ישרים וחדיםמדע עדינים
T4 DNA LigasePromega#M1801
Trypsin-EDTA 0.25 %Life Technologies#25200056
מעבד נוזלי אולטראסוני Vibra-Cell (VCX 130)Sonics
Wizard plus SV Minipreps מערכת טיהור DNAPromega#A1330
# כלי

מקורות

  1. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
  2. Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
  3. Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925(2010).
  4. Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
  5. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
  6. Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
  7. Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170(2009).
  8. Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
  9. Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
  10. Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
  11. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
  12. Rusnak, F., Mertz, P. Calcineurin: form and function. Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).
  13. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
  14. Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

shRNAACHOPMAP2Western BlotGM2
אפנון מולקולרי על ידי shRNA ספציפי המועבר על ידי לנטיוירוס בנוירונים סטרס ברשתית האנדופלסמית
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.