ניצול של גראפיקס לאיתור אינטראקציות חולפות של Saccharomyces cerevisiae Spliceosome subcomplexes

סיכום

כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), צנטריפוגה הדרגתית גליצריול בנוכחות crosslinker, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי שיתוף שנקשרים באופן חולף לקומפלקס spliceosome.

תקציר

שיתוף טרום-mRNA הוא תהליך דינמי מאוד הכולל סידורים מולקולריים רבים של תת-קומפלקסים spliceosome במהלך הרכבה, עיבוד RNA, ושחרור של הרכיבים המורכבים. צנטריפוגציה הדרגתית גליצל שימשה להפרדת חלבונים או מתחמי RNP (RiboNucleoProtein) למחקרים פונקציונליים ומבניים. כאן, אנו מתארים את הניצול של Grafix (קיבוע הדרגתי), אשר פותח לראשונה כדי לטהר ולייצב מתחמים macromolecular עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונים חלקיק יחיד, כדי לזהות אינטראקציות בין גורמי חוג שנקשרים ארעית למתחם spliceosome. שיטה זו מבוססת על צנטריפוגה של דגימות לריכוז הולך וגדל של ריאגנט קיבעון לייצוב מתחמים. לאחר צנטריפוגה של שמרים סה"כ תמציות טעון על שיפועים גליצריול, שברים התאושש מנותחים על ידי כתם נקודה לזיהוי של תת-מתחמים spliceosome וקביעה של נוכחות של גורמי splicing בודדים.

מבוא

שכפול הוא תהליך דינמי ביותר הדורש כריכה ושחרור של מספר רב של גורמים באופן מתואם. גורמי חוג אלה כוללים חלבונים מחייבים RNA, ATPases, helicases, קינאז חלבון ופוספטסות, רצועות בכל מקום, בין היתר^1,2,3; ולאפשר את הסידורים המולקולריים להתקיים, חלק מהגורמים האלה נקשרים באופן ארעי מאוד לתת-קומפלקסים של spliceosome, מה שהופך את הבידוד והזיהוי של מתחמי ביניים אלה RNP מאתגרים מאוד.

כאן, השתמשנו בשיטת Grafix^4,5 כדי לייצב את האינטראקציה של גורם חיבור שמרים Cwc24 עם קומפלקס^{B act 6} כדי לאפשר זיהוי של גורמים אחרים הקשורים במקביל לתת-קומפלקס זה ולקבוע אם ligase Ubiquitin Prp19 ממלא תפקיד כלשהו בכריכה או שחרור של Cwc24 למתחם תשע עשרה (NTC) ולסוף 5 ' של האינטרון לפני ההפעלה ותגובת הטרנססטרציה הראשונה לוקחת מקום. היתרון של חשיפת macromolecules לריכוז הולך וגדל של crosslinker לאורך שיפוע הגליצריול הוא שהוא נמנע בין מתחמים crosslinks^4,5, ולכן, היווצרות של אגרגטים.

שיטה זו שימשה כהשלמה לקוימונופרציפיטציה של חלבון ובדיקות משיכה, שלמרות שאפשרו בידוד של מתחמים גדולים, לא יכול להיות אמין לשמירה על אינטראקציות חולפות בתוך מתחמים דינמיים גדולים^7,8. השימוש ריאגנטים קיבעון בשיפוע הגליצריול מייצב את הכריכה של גורמים כאלה, ומאפשר אישור של אינטראקציות של חלבונים ספציפיים עם subcomplexes חוג. מכיוון שהקישור הנבחר היה בלתי הפיך מבחינה כימית, חלבונים שנמצאים בשברים שנמצאו נותחו על ידי כתם נקודה לאחר צנטריפוגת ההדרגה.

פרוטוקול

1. הכנת תמצית שמרים

1. לגדל את תאי שמרים המביעים את אחד הגורמים splicing התמזגו תג TAP⁹ ב 1 L YNB-דבק מדיה (שמרי חנקן בסיס בתוספת 2% מ '/v גלוקוז) עם חומצות אמינו מתאימות או בסיסים גרעיניים, במקרה זה, אדנין (20 מיקרוגרם / מ"ל), לאוצין (30 מיקרוגרם / מ"ל), טריפטופן (30 מיקרוגרם / מ"ל), עד OD₆₀₀ = 1.0.
2. לאסוף את התאים מתרבות 1 L על ידי צנטריפוגה בשלושה בקבוקי צנטריפוגה 500 מ"ל ב 17,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (60 °F) לשטוף פעמיים עם מים סטריליים 10 מ"ל.
3. Resuspend תאי שמרים שנאספו ב 1/10 של נפח התא של חיץ קר A (10 mmol L^-1 HEPES pH = 7.9, 1.5 mmol L^-1 MgCl₂, 50 mmol L^-1 KCl, 5% v / v גליצל, 0.5 mmol L^-1 DTT, קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA).
4. להקפיא טיפות קטנות של השעיית תא בחנקן נוזלי. טיפות קטנות ניתן להשיג על ידי pipetting פתרון התא resuspended ושחרור 50 μL ישירות לתוך חנקן נוזלי.
   אזהרה: חנקן נוזלי עלול לגרום לפציעות במגע עם העור או העיניים. יש לטפל בשימוש בציוד בטיחות מתאים.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. טיפות קפואות של השעיית התא ניתן לאחסן ב -80 °C (80 °F).
5. הכן תאי שמרים lysates על ידי שחיקה בהתקן כדור מיל דרך שישה מחזורים ב 20 הרץ / s במשך 3 דקות.
   הערה: לאחר כל מחזור, לטבול את המיכל מחסה התאים הקפואים בחנקן נוזלי כדי למנוע נמס. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן. ניתן לאחסן את התמציות הקפואות ב-80 מעלות צלזיוס. שמרים splicing תמציות יכול להיות מוכן גם באמצעות homogenizers ליסייט spheroplasts¹⁰, או באמצעות מרגמה ועלי^11,12.
6. ממיסים את התמצית על ידי הצבת הצינורות המכילים אותם במים בטמפרטורת החדר, רועד מדי פעם.
7. צנטריפוגות תמציות ב 45,000 x g עבור 1 שעות ב 4 °C (70 °F).
8. לכמת את תכולת החלבון של supernatant פינה על ידי שיטת BCA¹³.
9. הכן aliquots של תמציות, להקפיא אותם במהירות חנקן נוזלי ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

2. הכנת הדרגתי גליצריול

1. הכן שני פתרונות גליצריל במאגר A, אחד המכיל 10% v/v והשני המכיל 30% v / v גליסול.
2. הוסף את סוכן הקישורים glutaraldehyde ל 0.1% v /v בפתרון 30% v / v גליצלול ומערבב הומוגניזציה.
   אזהרה: יש לטפל בגלוטארלדהיד בתוך מכסה המנוע באמצעות ציוד בטיחות מתאים.
3. הוסף 6 מ"ל של פתרון גליסול 10% v / v קר בתחתית צינור צנטריפוגה 12 מ"ל (14 x 89 מ"מ).
4. הוסף 6 מ"ל של פתרון גליצריל 30% v/v קר בתוספת גלוטרלדהיד עם מזרק המחובר למחט ארוכה המסופקת עם התקן מעבר צבע מאסטר בתחתית הצינור, ממש מתחת לפתרון 10% v / v גליצל.
   הערה: לחלופין, פתרון 10% v /v גליצריל ניתן להקפיד בזהירות על החלק העליון של 30% v / v גליסטרול / glutaraldehyde פתרון.
5. השתמשו בהתקן 'תבנית מעבר צבע מאסטר' ליצירת מעבר צבע של צפיפות רציפה.
   הערה: בהתקן מעבר צבע מאסטר, הצינורות ממוקמים בארון תקשורת מתאים ומסתובבים לזמן קצר, בעקבות המלצות היצרן לקביעת הפרמטרים (זמן/ זווית / מהירות). בעבודה זו השתמשנו: 2:25 דקות / 81.5 ° / 11 סל"ד.
6. בזהירות להוסיף 200 μL של 7% v / v גליצל / חוצץ כרית על החלק העליון ממש לפני התוספת של תמציות התא.
   הערה: ריכוז הגליצרול של הכרית חייב להיות נמוך יותר מפתרון הגליצרול הפחות מרוכז המשמש ליצירת מעבר הצבע ליניארי.

3. צנטריפוגה תמציות

1. טען כ 2 מ"ג של חלבון הכולל על גבי כל 12 מ"ל שיפוע גליסול ליניארי 10%-30% גלוטרלדהיד עם כרית.
2. מניחים את הצינורות ברוטור דלי נדנדה מקורר מראש.
   הערה: יש לטפל בצינורות בעדינות כדי להימנע מערבוב לפני אולטרה-צנטריפוגה.
3. צנטריפוגה ב 194,000 x g עבור 16 שעות ב 4 °C (70 °F).
4. Aliquot כל צינור 12 מ"ל בעשרים וארבעה שברי μL באמצעות EconoSystem מותאם או על ידי צנרת בקפידה.
   הערה: EconoSystem מותאם מורכב ממשאבה פרייסטלית, גלאי UV ואספן השבר המחובר למכשיר ניקוב הצינור. ניתן לעקוב אחר פרופיל המשפך על ידי מדידת הספיגה ב- 280 ננומטר.
5. השתמש בתמיסת 40% v/v glycerol דרך המשאבה peristaltic כדי לדחוף את הגליצריל 10%-30% הדרגתי מהצינור לאספן השברים.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. יש לאחסן את השברים ב- -80 °C (70 °F) עד לשימוש.
6. טען 50 μL של כל שבר ישירות על ממברנות ניטרוצלולוז על כתם נקודה או התקן כתם חריץ. לזהות חלבון על ידי אימונובלוט באמצעות נוגדן נגד CBP (1:6,000, כדי לזהות את החלק CBP של תג TAP) ו IgG אנטי ארנב מצומד עם פרשת Peroxidase (1:15,000) נוגדן משני.

תוצאות

כדי לנתח את פרופיל המשקעים של Cwc24-TAP ולקבוע אם שיטת Grafix הייתה יעילה לייצוב האיגוד שלה לשיתוף תת-קומפלקסים, הפרדנו בין תמציות שמרים כוללות של תאים המבטאים Cwc24-TAP באמצעות צנטריפוגציה על שיפועי גליצול, בנוכחות או היעדר גלוטרלדהיד כסוכן קישור צולב. דגימות של עשרים וארבעה שברי μL 500 נותחו לאחר מכן על ידי כתם חריץ עם נוגדן נגד חלק CBP של תג TAP. התוצאות מראות כי בהיעדר ההצלבה, Cwc24 מרוכז בין שברים 5 ל -13 (איור 1B),המקביל למתחמים של כ 80 עד 200 מד"א^14. עם זאת, בנ...

דיון

חלבון-חלבון וחומצות ריבונוקלאיות-חלבון אינטראקציות ניתן לייצב באמצעות חומרים crosslinking. חשוב כי המתחם המתקבל יציב לעמוד ultracentrifugation על מעבר צבע גליצריול. בנוסף, תנאי המאגר אמורים לאפשר את האינטראקציה, אך מחמירים מספיק כדי להימנע מאיגוד לא ספציפי. בניסויים המוצגים כאן, השתמשנו בפתרון חיץ שכבר הוקם עבור תגובות^15.

המהירות וזמן של צנטריפוגה צריך להיות מותאם עבור המתחמים מנותחים. בדקנו תנאי משקעים שונים, דגימות צנטריפוגה ב 94,000 x g ו 194,000 x g

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אנטי-קלמודולין קושר חלבון אפיטופ	Millipore	07-482
ECL אנטי-ארנב IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	חלקים של EconoSystem בשימוש: משאבה פריסטלטית, גלאי UV ואספן השברים
מעכב פרוטאז ללא EDTA קוקטייל	רוש	11873580001
מערכת שחזור שברים	בקמן קולטר	270-331580	מכשיר ניקוב צינורות שהיה מחובר לחלקי EconoSystem
Gradient Master דגם 107ip	Biocomp	107-201M
טחנת מיקסר MM 200	Retsch	207460001	מכשיר טחנת כדורים
רוטור F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus צנטריפוגה	Thermo Scientific	36-101-0816
רוטור דלי מתנדנד P40ST	היטאצ'י
אולטרה-צנטריפוגה CP 80 NX	היטאצ'י	901069
צינורות צנטריפוגה ברורים במיוחד (14 x 89 מ"מ)	בקמן קולטר	344059