תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

Summary

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

Abstract

המיטוכונדריה הם אברונים חיוניים של תאים אוקריוטיים המסוגלים להנשמה אירובית. הם מכילים גנום מעגלי ומנגנון ביטוי גנים. גנום מיטוכונדריאלי של שמרי אופה מקודד שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p. מטרת השיטה המתוארת כאן היא לתייג במיוחד חלבונים אלה עם ³⁵S methionine, להפריד אותם על ידי אלקטרופורזה לדמיין את האותות כמו להקות נפרדות על המסך. ההליך כרוך במספר שלבים. ראשית, תאי שמרים מתרבתים במדיום המכיל גלקטוז עד שהם מגיעים לשלב הצמיחה הלוגריתמי המאוחר. לאחר מכן, טיפול ציקלוהקסימיד חוסם תרגום ציטופלסמי ומאפשר ³⁵S שילוב מתיון רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. לאחר מכן, כל החלבונים מופקים מתאי שמרים ומופרדים על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד. לבסוף, הג'ל מיובש ומדגיר עם מסך זרחן האחסון. המסך נסרק על זרחן החושף את הלהקות. השיטה יכולה להיות מיושמת כדי להשוות את שיעור הביוסינתזה של פוליפפטיד יחיד במיטוכונדריה של זן שמרים מוטציה לעומת סוג הבר, אשר שימושי לחקר פגמים ביטוי גנים מיטוכונדריאלי. פרוטוקול זה מספק מידע רב ערך על קצב התרגום של כל mRNAs המיטוכונדריה שמרים. עם זאת, הוא דורש מספר בקרות וניסויים נוספים כדי להסיק מסקנות נכונות.

Introduction

המיטוכונדריה הם אברונים מעורבים עמוק בחילוף החומרים של תא אוקריוטי. שרשרת העברת האלקטרונים שלהם מספקת לתא ATP, המטבע האנרגטי העיקרי המשמש במסלולים ביוכימיים מרובים. חוץ מזה, הם מעורבים אפופטוזיס, חומצת שומן סינתזה heme, ותהליכים אחרים. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה הוא מקור ידוע של מחלה אנושית¹. זה יכול לנבוע מוטציות בגנים גרעיניים או מיטוכונדריאליים קידוד רכיבים מבניים או רגולטוריים של organelles². שמרי בייקר Saccharomyces cerevisiae הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר ביטוי גנים מיטוכונדריאלי בשל מספר סיבות. ראשית, הגנום שלהם רצף לחלוטין³, מבואר היטב, וסכום גדול של נתונים כבר זמין בספרות הודות להיסטוריה הארוכה של חקירות שבוצעו עם האורגניזם הזה. שנית, המניפולציות עם הגנום הגרעיני שלהם הן מהירות וקלות יחסית בגלל קצב הצמיחה המהיר שלהם ומערכת רקומביניזציה הומולוגית יעילה מאוד. שלישית, שמרי האופה S. cerevisiae הוא אחד האורגניזמים הבודדים שעבורם המניפולציות עם הגנום המיטוכונדריאלי מפותחות. לבסוף, שמרי האופה הוא אורגניזם פקולטטיבי אווירוב-אנארוב, המאפשר בידוד וחקר של מוטציות פגומות בדרכי הנשימה, שכן הם יכולים לגדול במדיה המכילה מקורות פחמן מותססים.

אנו מתארים את השיטה ללמוד ביטוי גנים מיטוכונדריאלי של שמרי אופה S. cerevisiae ברמה התרגומית⁴. העיקרון העיקרי שלה מגיע מכמה תצפיות. ראשית, הגנום המיטוכונדריאלי של השמרים מקודד רק שמונה חלבונים: שלוש יחידות משנה של ציטוכרום c אוקסידאז (Cox1p, Cox2p ו- Cox3p), שלוש יחידות משנה של סינתאז ATP (Atp6p, Atp8p ו- Atp9p), תת-יחידה של האנזים אוביקינול-ציטוכרום c אוקסידורדוקטאז, ציטוכרום b (Cytb) וחלבון ריבוזומלי מיטוכונדריאלי Var1p⁵. מספר זה קטן, וניתן להפריד את כולם על ידי אלקטרופורזה על ג'ל יחיד בתנאים המתאימים. שנית, ריבוזומים מיטוכונדריאליים שייכים למעמד הפרוקריוטי ולא לאוקריוטיקה⁶, ולכן הרגישות לאנטיביוטיקה שונה עבור ריבוזומים ציטופלזמים ומיטוכונדריאליים. זה מאפשר עיכוב של תרגום ציטופלסמי עם ציקלוהקסימיד, מתן התנאים כאשר חומצת אמינו שכותרתו⁽³⁵S-מתיונין) משולב רק במוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. כתוצאה מכך, הניסוי מספק מידע על קצב שילוב חומצות האמינו בחלבונים המיטוכונדריים מסונתז דה נובו, המשקף את היעילות הכוללת של תרגום מיטוכונדריאלי עבור כל אחד משמונת המוצרים

Protocol

1. הכנת תרבות שמרים

1. שמרים פס מתרבויות מלאי קפוא על צלחות טריות עם המדיום המתאים. שים את הצלחות באינקובטור תרבות ב 30 מעלות צלזיוס עבור 24-48 שעות.
   הערה: תן למוטנטים הרגישים לטמפרטורה לגדול בטמפרטורה המתירנית.
2. לחסן תרביות שמרים ב 2 מ"ל של מדיום YPGal (2% פפטון, 1% תמצית שמרים, 2% גלקטוז) מן הפס הטרי ב 15 מ"ל צינורות לדגר אותם לילה נסער ב 200 סל"ד ב 30 °C (60 °F).
3. למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות באורך גל של 600 ננומטר (OD₆₀₀).
4. קח את הנפח המתאים 0.2 יחידות ספיגה בצינורות סטריליים, כדוריות שמרים תאים ב 9,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר, ולזרוק את supernatant.
5. לשטוף תאים עם 0.5 מ"ל של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך 5 s. כדורי שמרים תאים ב 9,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. לדלל תאים ב 2 מ"ל של מדיום YPGal טרי.
6. דגירה ב 200 סל"ד ו 30 °C (60 °F) עד OD₆₀₀ מגיע 1.5-1.9 ערכים.
   הערה: שיעורי הצמיחה של שמרים משתנים, לכן היו מוכנים לחכות. סביר לעשות צעדים 1.3-1.6 מוקדם בבוקר. זה בדרך כלל לוקח 4-5 שעות, אבל יכול לקחת יותר זמן.

2. התאגדות איזוטופ רדיואקטיבי

1. העבר את נפח התרבות המקביל ליחידה אופטית אחת בצינור מיקרוצנטריפוגה. לסובב את הצינורות ב 3,000 x g במשך 1 דקות ולהשליך את supernatant. לשטוף עם 0.5 מ"ל של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך 5 s.
   1. כדורי שמרים תאים ב 9,000 x g עבור 30 s בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant. הושהה מחדש של תאי שמרים ב- 0.5 מ"ל של מאגר תרגום סטרילי. מניחים את ההשעיה בצינור 15 מ"ל.
      הערה: מאגר תרגום הוא פתרון המכיל 2% גלקטוז (w /v) ו 50 מ"מ אשלגן פוספט עם pH 6.0.
2. הוסף ציקלוהקסימיד להשעיית התא עד ריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל. דגירה במשך 5 דקות נסער ב 200 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס כדי לעכב תרגום ציטוזולי.
   הערה: פתרון ציקולוהקסימיד (20 מ"ג / מ"ל, באתנול) צריך להיות מוכן טרי לפני הניסוי. כלורמפניקול יכול להיות מוחלף בהצלחה עם אניסומיצין באותו ריכוז⁷.
3. הוסף 25-30 μCi של ³⁵S-methionine להשעיית התא דגירה במשך 30 דקות נסער ב 200 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס.
   הערה: ניתן להשתמש גם בתערובת של ³⁵S-מת'ונין ^ו-35S-ציסטאין. תוצאות S-methionine טהורות באות החזק ביותר ויחס האות לרעש הטוב ביותר. בדרך כלל, מתונין יעיל יותר ציסטאין כי התוכן של חומצת אמינו זו בחלבונים המיטוכונדריים הוא גבוה יותר. עם זאת, תערובת EasyTag של ³⁵S-methionine וציסטאין הוא פחות יקר ונותן תוצאות^{דומות 7}.
   התראה: ³⁵S-מתונין הוא רדיואקטיבי. פעל בהתאם לנוהלי הבטיחות הרגילים לטיפול בחומרים רדיואקטיביים.
   הערה: ידוע כי שילוב הרדיואקטיביות מגיע למגבלה שבגללה רמת האותות הכוללת לאורך זמן. ברגע שמגבלה זו מגיעה, כמעט בלתי אפשרי לקבוע את התעריפים שבאמצעותם מוצרי התרגום השונים מסונתזים. כדי לנתח את קצב התרגום המיטוכונדריאלי, זה הכרחי להיות במצב שבו עוצמת האות עולה עם זמן הדגירה עם ³⁵S-methionine באופן ליניארי. עבור זנים נפוצים מסוג פראי במעבדה, האות כבר רווי לזמני דגירה קצרים בהרבה מ-30 דקות. מוטנטים תרגום יכולים להתנהג בצורה שונה מאוד. יש לבצע קורס זמן כדי לבסס את הקינטיקה של שילוב רדיואקטיביות ובכך את שיעור התרגום, לפחות בעת עבודה עם זן חדש. בשביל זה, אנו ממליצים לקחת דגימות עם מרווח של כמה דקות (למשל, 2.5, 5.0, 7,5, 10, ו 20 דקות).
4. הוסף מתונין "קר" ללא תווית (הריכוז הסופי צריך להיות 20 מ"מ) ו puromycine (הריכוז הסופי צריך להיות 1-10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי לעצור את התיוג. דגירה במשך 10 דקות נסער ב 200 סל"ד ו 30 מעלות צלזיוס.
   הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לתת ריבוזומים זמן לסיים לתרגם את הפפטידים. אחרת, כל הפוליפפטידים קצרים יותר מאורך מלא יזוהו בגודל שונה. ניסוי קורס זמן (דופק-מרדף) יכול להיעשות בשלב זה כדי לקבוע את היציבות של מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי. בשביל זה, להמשיך את הדגירה לוקח דגימות עם מרווח של 30 דקות (למשל, 30, 60, 90, ו 120 דקות).

3. תמוגה של תאי שמרים ומיצוי חלבונים

1. לאסוף תאי שמרים על ידי צנטריפוגה ב 9,000 x g עבור 30 s. לשטוף את התאים עם 0.5 מ"ל של מים סטריליים על ידי מערבולת במשך 5 s. כדורי שמרים תאים ב 9,000 x גרם עבור 30 s בטמפרטורת החדר. השלך את הסופרנט.
   הערה. ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. אחסן את הדגימות ב- -20 °C (69 °F).
2. הוסף 75 μL של מאגר תמוגה לכדור ומערבולת במשך 5-10 s.
   הערה: מאגר תמוגה הוא פתרון של 1.8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol, ו 1 mM PMSF במים. הימנע דגירה מוגזמת עם מאגר תמוגה המוביל הידרוליזה אלקליין של חלבונים. המשך מיד לשלב 3.3.
3. הוסף 500 μL של 0.5 M Tris-HCl מאגר עם pH 6.8. וורטקס לזמן קצר.

4. משקעים של חלבונים

התראה: מתנול וכלורופורם הם ממיסים אורגניים. בצע את נוהלי הבטיחות הרגילים לטיפול בחומרים אורגניים.

1. הוסף 600 μL של מתנול לדגימה. וורטקס במשך 5 שניות.
2. הוסף 150 μL של כלורופורם לדגימה. וורטקס במשך 5 שניות.
3. צנטריפוגה הדגימות במשך 2 דקות ב 12,000 x g. השלך בזהירות את השלב העליון עם סמפלר.
4. הוסף 600 μL של מתנול לדגימה. מערבבים בזהירות על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.
5. צנטריפוגה הדגימות במשך 2 דקות ב 12,000 x g. השלך את הסופרנט.
6. אוויר לייבש את גלולה במשך 2 דקות ב 80 מעלות צלזיוס.
   הערה: כל הנוזל צריך להתאדות. קיים סיכון להפרדה חריגה של חלבונים בג'ל אם גלולה היה מיובש מספיק. עם זאת, לא ניתן לייבש יתר על הערך את גלולה, כך שזה יכול אפילו להיות מאוחסן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
7. ממיסים חלבונים משקעים ב-60 מיקרו-μL של מאגר מדגם 1x Laemmli.
8. מחממים במשך 10 דקות ב 40 מעלות צלזיוס.
   הערה: הימנע רותחים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס, כי זה גורם לצבירה. אם הצבירה עדיין נוצרת, סובב את הדגימות במהירות של 12,000 x g למשך 2 דקות ואסוף את ה- supernatant. ניתן לאחסן דגימות ב- -20 °C (69 °F). ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

5. עמוד SDS

1. יצוק 17.5% Laemmli SDS-פוליאקרילאמיד ג'ל.
   הערה: 6 M אוריאה ניתן להוסיף את הג'ל כדי לפתור טוב יותר atp8 ו atp9. ג'לים הדרגתיים של 15%-20% יכולים גם לתת רזולוציה טובה יותר.
2. טען 15 μL (40-50 מיקרוגרם) של כל מדגם בכיסים.
   הערה: אין צורך למדוד ריכוז חלבון אם ערכי OD₆₀₀ היו קרובים בשלב 1.6. אם לא, למדוד ריכוזי חלבון באמצעות מבחני עם ריאגנטים תואמי דטרגנט.
3. מפעילים את הג'ל בחדר קר עד שהצבע הכחול מגיע לכ-65% מאורך הג'ל.
   הערה: עבור המערכת בשימוש (למשל, Protean II xi תא), אנו משתמשים בכל אחד משני המצבים: 16-17 שעות ב 5 V / cm או 5 שעות ב 15 V / cm. אין חלבונים לרוץ מהר יותר מאשר צבע כחול ברומופנול, אבל ריצות ארוכות יכול לגרום טשטוש של אותות atp8 ו- atp9.
4. הכתימו את הג'ל בכחול בוהק של Coomassie ובצעו סריקה או תמונה, הנדרשת כבקרת טעינה.
   הערה: דרך חלופית לעשות בקרת טעינה היא immunoblotting עם נוגדן לגן "שמירה על הבית" המיטוכונדריאלי, למשל, פורין 1.

6. אוטורדיוגרפיה

1. יבש את הג'ל במייבש ג'ל. שמור אותו בקלטת עם מסך זרחן אחסון למשך 3-5 ימים.
   הערה: חלופה להקרנת הג'ל המיובש היא העברת חלבונים לקרום ניטרוסלולוז על ידי נפיחות אלקטרו והקרנתו לאחר מכן. התוצאה היא אותות חזקים יותר ולהקות חדות יותר.
2. סרוק את המסך על זרחן.
   הערה: כחלופה להדמיית זרחן, ניתן להשתמש בסרט רנטגן גם כדי לחשוף את האותות.

Results

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, הקצינו מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי משני זני S. cerevisiae: סוג הבר (WT) ומוטנט הנושא מחיקה של הגן AIM23 (AIM23Δ), קידוד גורם ייזום תרגום מיטוכונדריאלי 3 (טבלה 1)⁸. מוצרי תרגום מיטוכונדריאלי סומנו באופן רדיואקטיבי והופרדו ב- SDS-PAAG9. הדגימות נאספו כל 2.5 דקות לפני הרוויה כדי לבנות קורס זמן (איור 1A). הג'ל היה מוכתם, מיובש ומוקרן לאחר התערוכה בת 5 הימים (איור 1A).

Discussion

חקירות של ביטוי גנים תופסות חלק מרכזי במדעי החיים המודרניים. פותחו שיטות רבות המספקות תובנות על תהליך מורכב זה. כאן, תיארנו את השיטה המאפשרת גישה לביוסינתזה של חלבונים במיטוכונדריה S. cerevisiae של בייקר. זה מיושם בדרך כלל כדי להשוות יעילות תרגום של mRNAs במיטוכונדריה של זן שמרים מוטנטים לעומת סוג פראי כדי לגשת להשלכות של המוטציה הנחקרת. זהו אחד הניסויים הבסיסיים שהחוקרים עורכים כאשר הם חוקרים את הפונקציה המיטוכונדריאלית של תאי שמרים הנושאים את המוטציה המוצעת להשפיע על המיטוכונדריה^8,...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-מרקפטואתנול	סיגמא-אולדריץ'	M3148
אקרילאמיד	סיגמא-אולדריץ'	A9099
אמוניום פרסולפט	סיגמא-אולדריץ'	A3678
אגר בקטריולוגי	סיגמא-אולדריץ'	A5306
מד צפיפות תאים Biowave CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
קוביות חד פעמיות סטנדרטיות	למותג Sigma-Aldrich	Z330361
כלורופורם	Sigma-Aldrich	288306
ציקלוהקסמיד	סיגמא-אולדריץ'	C1988
D-(+)-גלקטוז	סיגמא-אולדריץ'	G5388
D-(+)-גלוקוז	סיגמא-אולדריץ'	G7021
מחמם בלוק דיגיטלי	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-מתיונין, 500µ Ci (18.5MBq), תמיסה מימית מיוצבת	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-methionine	Sigma-Aldrich	M9625
מתנול	סיגמא-אולדריץ'	34860
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	M7279
ניו ברונסוויק Innova 44/44R חממת שייקר	ניו ברונסוויק פפטון מדעי
מבשר, בקטריולוגי	Millipore	91249
פנילמתאן סולפוניל פלואוריד	סיגמא-אולדריץ'	P7626
ערכת בדיקת חלבון Pierce 660nm	Thermo Scientific	22662
PowerPac ספק כוח בסיסי	Bio-Rad	1645050
Protean II xi תא	Bio-Rad	1651802
Puromycin dihydrochloride מ- Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
נתרן הידרוקסיד	סיגמא-אולדריץ	221465
סטורם 865 מצלמת זרחן	GE Healthcare
בסיס טריזמה	סיגמא-אולדריץ'	93352
מייבש ג'ל מחומם בוואקום	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
תמצית שמרים	Sigma-Aldrich	Y1625