הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62028

⸱

19 בדצמבר 2020

 ,  ,  ,  , 
1PHYMEDEXP, INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier

במאמר זה

סיכום

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות היא שיטה פשוטה המאפשרת לחקור אינטראקציות פפטיד/ממברנה על מנת להבין את מעורבותם במספר תהליכים ביולוגיים ובמיוחד את היכולת של פפטידים חודרי תאים להפריע לפולניידים דו-שכבתיים במהלך תהליך טרנסלוקציה תאית ישירה.

תקציר

פפטידים חודרי תאים (CPPs) מוגדרים כנשאים המסוגלים לחצות את קרום הפלזמה ולהעביר מטען לתאים. אחד המאפיינים הנפוצים העיקריים הנדרשים לפעילות זו נבע אינטראקציות של CPPs עם קרום הפלזמה (שומנים) ובמיוחד עם מרכיבים של מטריצה חוץ תאית של הממברנה עצמה (הפרין סולפט). ואכן, ללא תלות בטרנסלוקציה הישירה או הפנמה תלוית אנדוציטוזיס, bilayers השומנים מעורבים בתהליך ההפנמה הן ברמת קרום הפלזמה והן ברמה של תנועה תאית (שלפוחיות אנדוסומליות). במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את השלבים השונים של שלפוחיות חד-צדדיות גדולות (LUVs) ניסוח, טיהור, אפיון ויישום בדליפת פלואורסצנטיות על מנת לזהות חוסר היציבות / אינטראקציה אפשריים של קרום CPP ולטפל בתפקידם במנגנון ההפנמה. LUVs עם הרכב שומנים המשקף את תוכן קרום פלזמה נוצרים על מנת לתמצת הן צבע פלואורסצנטי ו quencher. תוספת של פפטידים במדיום החוץ-לימודי וגיוס של אינטראקציות פפטיד-קרום על LUVs עשוי לגרום באופן תלוי מינון עלייה משמעותית פלואורסצנטיות חושף דליפה. דוגמאות מסופקות כאן עם טריפטופן שפותח לאחרונה (W)- וארגינין (R)פפטידים אמפתיים עשירים (WRAPs), אשר הראו משלוח siRNA מהיר ויעיל בשורות תאים שונים. לבסוף, אופי האינטראקציות האלה ואת הזיקה של שומנים נדונים כדי להבין ולשפר את טרנסלוקציה הממברנה ו / או את הבריחה האנדוסומית.

מבוא

לאחר גילוים בשנות התשעים, פפטידים חודרי תאים (CPPs) פותחו כדי לקדם משלוח סלולרי יעיל של מטענים דרך קרום הפלזמה1,2. CPPs הם בדרך כלל פפטידים קצרים, בדרך כלל 8 עד 30 חומצות אמינו, בעל מגוון רחב של מקורות. הם הוגדרו תחילה כנשאים "טרנסלוקציה ישירה", כלומר הם הצליחו לחצות את קרום הפלזמה ולהעביר מטען לתאים ללא תלות בכל מסלול אנדוציטוטי לא דרישת אנרגיה ולא מעורבות קולטן. עם זאת, חקירות נוספות גילו כי תצפיות ראשונות אלה הגיעו בעיקר מהערכת יתר פלואורסצנטית בשל החפץ הניסיוני ו / או לפרוטוקולי קיבעון באמצעות מתנול3. כיום, מקובל כי ספיגת CPP מתרחשת הן על ידי אנדוציטוזיס והן טרנסלוקציה עצמאיתלאנרגיה 4,5,6,7 בהתאם לפרמטרים שונים כגון אופי המטען, הקשר המשומש בין CPP למטען, קו התא הנחקר וכו '.

CPPs יכול לשמש כסוכני transfection על פי שתי אסטרטגיות, או מעורבים קישור כימי (אסטרטגיה covalent) או אינטראקציות אלקטרוסטטיות / הידרופוביות (אסטרטגיה לא קוולנטית) בין CPP למטען שלה8,9,10,11. למרות ששתי האסטרטגיות הראו את יעילותן בהעברת תאים של מספר מטענים, הבנת מנגנון ההפנמה על ידי CPPs עדיין נמצאת במחלוקת והאיזון בין מסלולי אנדוציטוזיס או חדירה ישירה עדיין קשה למדוד12,13. למרות קבוצה של כלים ניסיוניים ואסטרטגיות זמינים כדי לטפל בבירור במעורבות של תהליכים אנדוציטיים, טרנסלוקציה ישירה נראה, עם זאת, קשה יותר לאפיין שכן הוא מרמז על אינטראקציות דיסקרטיות יותר עם רכיבי קרום פלזמה. ממברנות ביולוגיות מורכבות בדרך כלל מרכיבים רבים, מפוספוליפידים ועד חלבוני ממברנה, אשר עשויים להשתנות בהתאם לסוג התא ו /או לסביבה (תנאי לחץ, חלוקת תאים וכו '). מגוון זה של הרכב, וכתוצאה מכך היעדר מודל ממברנה תאית אוניברסלי אינו מאפשר מחקרים באופן אחד. עם זאת, כדי לעקוף מגבלות אלה צעד אחר צעד גישות פותחו עם תמציות ממברנה מלאכותית או ממברנה. משלשלות חד-צדדיות קטנות ועד גישות של מונו-שכבתיות, כל דגם היה רלוונטי בבירור לענות על שאלות ספציפיות14,15. ביניהם, שלל חד-צדדי גדול (LUVs) מהווים מודל חיקוי ממברנה מתאים לחקר אינטראקציות פפטיד / ממברנה כנקודת מפתח בתהליך ההפנמה.

בהקשר זה, הפרוטוקול הבא מתאר את חקירת ההשפעות של פפטידים ואינטראקציות פפטיד / ממברנה על שלמות LUVs באמצעות ניטור של צבע פלואורסצנטי אניוני שלה ואת quencher פולי-cationic המקביל שלה encapsulated ליפוזומים. כלי זה משמש לחקר אינטראקציות CPP / ממברנה על מנת להבין אם הם מסוגלים לבצע טרנסלוקציה ממברנה ישירה. למרות שבדרך כלל מיושם כדי להשוות פפטידים שונים אינטראקציה ממברנה, זה LUV פלואורסצנטי דליפת אסאי יכול לשמש גם לחקירת מצומדים מטען CPPs (אסטרטגיה covalent) ו- CPP:מתחמי מטען (אסטרטגיה לא covalent).

הפרוטוקול הנוכחי יתבטא תחילה עם טריפטופן שפותח לאחרונה (W)- וארגינין (R) פפטידים אמפתיים עשירים (WRAP)16. WRAP מסוגל ליצור חלקיקים מבוססי פפטיד כדי לספק במהירות וביעילות RNA מפריע קטן (siRNA) בכמה קווי תאים16. תכונות דליפת הפלואורסצנטיות של פפטיד WRAP לבד או חלקיקים מבוססי WRAP טעונים siRNA היו מנוטרים כדי לאפיין את מנגנון ההפנמה התאית שלהם. הראינו שמנגנון ההפנמה שלהם כלל בעיקר טרנסלוקציה ישירה7. בדוגמה שנייה, פפטיד WRAP היה מצומד באופן קוולנטי לחלבון / חלבון מפריע פפטיד iCAL36 (WRAP-iCAL36)17 ואת יכולתו לערער את הממברנות הושווה בדליפת פלואורסצנטית assay ל iCAL36 בשילוב חדירה18 (חדירה-iCAL36), CPP אחר.

לבסוף, היתרונות והמגבלות של השיטה יידונו הן מבחינה טכנולוגית והן ביחס לשל רלוונטיות ביולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת שלשלים חד-צדדיים גדולים

  1. הכן LUVs לשימושם כמו קרום התא מחקה לבדיקת דליפת פלואורסצנטיות.
  2. יש לערבב עם מזרק זכוכית המילטון פוספטידילכולין (DOPC, 786.11 גרם/מול), ספינגומיאלין (SM, 760.22 גרם/מול) וכולסטרול (Chol, 386.65 גרם/מול) ביחס הטוחנת 4:4:2. תמיסת השומנים מתקבלת מתמיסת מלאי של כל שומנים מסולבים במתנול/כלורופורם (3/1; נפח/נפח) ממס ב-25 מ"ג/מ"ל בבקבוק זכוכית 25 מ"ל. מבוסס על 4 מיקרומול של DOPC, 4 מיקרומול של SM, ו 2 מיקרומול של Chol, פתרון השומנים מתקבל מפתרון מלאי על ידי ערבוב 126 μL, 117 μL, ו 31 μL, בהתאמה.
    זהירות: מתנול הוא ממס רעיל ודליק וכלורופורם רעיל ומסרטן. שניהם צריכים להיות מטופלים עם ההגנה המתאימה מתחת למכסה המנוע.
  3. לאדות מתנול / כלורופורם באמצעות מאייד סיבובי תחת ואקום במהלך 45-60 דקות ב 60 °C (60 °F) עד היווצרות של סרט שומנים מיובש.
  4. הכן שני פתרונות מאגר HEPES של מלאי. הכן את חיץ HEPES 1 על-ידי ערבוב 20 מ"מ HEPES (238.3 גרם/מול) ו-75 מ"מ NaCl (58.44 גרם/מול) והתאם את ה-pH ל-7.4. הכן את חיץ HEPES 2 על-ידי ערבוב HEPES של 20 מ"מ ו-145 מ"מ NaCl והתאם את ה-pH ל- 7.4. מאגרי HEPES ניתן לאחסן ב 4 °C (5 °F) במשך חודש אחד.
    הערה: מומלץ לבדוק את osmolarity של המאגרים באמצעות osmometer.
  5. הכן פתרון הידרציה שומנים בדם על ידי המסת ממברנה קרום חדיר צבע-quencher זוג, 8-אמינונאפתאלן-1, 3, 6-טריסולפונית חומצה, מלח דיסודיום ב 12.5 mM (ANTS, 427.33 גרם / מול) ו p-קסילן-bispyridinium ברומיד ב 45 mM (DPX, 422.16 גרם / מול) בתמיסת חיץ HEPES. ערבוב נמלים עם DPX מוביל לפתרון בצבע צהוב. כדי להשיג את הריכוזים של 12.5 מ"מ של ANTS ו 45 מ"מ של DPX, להמיס 21.4 מ"ג ו 76 מ"ג, בהתאמה 4 מ"ל של חיץ HEPES 1.
    הערה: פתרון הידרציה שומנים ניתן לאחסן במשך 2 שבועות ב 4 °C (70 °F) על ידי עטיפת הצינור עם רדיד אלומיניום.
  6. לשחזר שלשולים multilamellar (MLV) על ידי שימוש חוזר בסרט השומנים היבש עם 1 מ"ל של תמיסת הידרציה השומנים ועל ידי מערבולת עד פירוק של סרט השומנים מיובש. ודא כי הפתרון הוא solubilized לחלוטין כמו אגרגטים שומנים קטנים ישפיעו לרעה על השלבים הקודמים. כמו כן, בדוק את הקיר של בקבוקון זכוכית עגולה כדי להבטיח כי אין סרט שומנים שנותר.
    הערה: הפתרון ייראה אופלסנט וצהוב בהיר לאחר solubilization.
  7. יש להכפיף את שלטיה לחמישה מחזורי הקפאה/הפשרה כדי להשיג שלל חד-צדדי. בצע כל מחזור על ידי הצבת בקבוקון עגול זכוכית במשך 30 s בחנקן נוזלי עבור צעד הקפאה, ולאחר מכן להשאיר אותו באמבט מים במשך 2 דקות עבור צעד הפשרה.
    הערה: טמפרטורת מי האמבטיה צריכה להיות 5-10 מעלות צלזיוס גבוה יותר מאשר טמפרטורת ההיתוך של השומנים.
  8. הכן מסחטת שומנים על ידי החדרת שני מסננים תומך ראשוני לח עם חיץ HEPES בכל פיסת מחול פוליטרפלואורואתילן (PTFE) להציב במכל מחול מתכת.
  9. שים קרום פוליקרבונט לח HEPES (גודל נקבובית 0.1 מיקרומטר, קוטר 25 מ"מ) על גבי תמיכה מסנן אחד.
  10. להרכיב את שני מיכלי מכבש מתכת ולברג אותם.
  11. מניחים את המהקסר המורכב במחזיק ומציגים מזרק 1 מ"ל בחור המתאים בגפיים של כל פיסת מחול פוליטרפלואורואתילן. שחול מתאים למעבר של הנוזל שנבדק ממזרק אחד לשני דרך קרום פוליקרבונט.
  12. בדוק את המהביל עם 1 מ"ל של מאגר HEPES טעון באחד המזרק 1 מ"ל כדי להבטיח כי אין דליפות או בעיות.
  13. החלף את מאגר HEPES של 1 מ"ל בדגימת MLV.
  14. בצע שחול על ידי העברת מדגם MLV ממזרק אחד למשנהו דרך קרום פוליקרבונט לפחות 21 פעמים כדי להשיג LUVs אחיד באותו גודל.
    הערה: שחול צריך להתבצע בטמפרטורה גבוהה יותר מאשר טמפרטורת ההיתוך של תערובת השומנים.

2. טיהור LUVs

  1. הכן טיהור עמודות כדי להסיר עודף ANTS ו- DPX שאינם עטופים.
  2. הציגו ג'ל דקסטרן מקושר (G-50) המוצב מחדש במדיום מימי עם 0.01% NaN3 (65 גרם/מול) בעמודת כרומטוגרפיה נוזלית (Luer Lock, ללא ז'קט, 1.0 ס"מ x 20 ס"מ, נפח המיטה 16 מ"ל) עד 1 ס"מ מתחת לחלק חסר הצבע של העמודה.
  3. פתחו את הברז ותנו לנוזל לזרום כדי ליישב את ג'ל דקסטרן המקושר.
  4. לשטוף את העמודה על ידי eluting עם 20 מ"ל של מאגר HEPES 2 ולבטל את זרימת הפלט של העמודה.
  5. סגור את הברז לאחר הנפח המת של ממס מעל העמודה ממוזער (<100 μL) אבל מספיק כדי למנוע כל ייבוש של ג'ל dextran מקושר.
  6. מניחים את ה- LUVs הטרי (צהוב) על העמוד ומניחים להם להיכנס לג'ל דקסטרן מקושר.
  7. הוסף ברציפות את מאגר HEPES 2 לעמודה כדי לבצע את טיהור LUV.
  8. יש לפנות כ-2 מ"ל של חיץ HEPES 2 (אל תשכחו למלא באופן קבוע את החלק העליון של העמודה כדי להימנע מייבוש ג'ל דקסטרן מקושר מוצלב): תמיסת ה-ANTS הצהובה וה-DPX החופשית נודדת לאט יותר מהליפוזומים.
  9. התחל לאסוף LUVs מטוהר בצינורות (1.5 מ"ל).
  10. שים לב טיפות של אלנט מן הטור וכאשר הם הופכים לשם, הם מכילים ליפוזומים. שנה את הצינור כדי לשחזר את השבר המכיל LUV.
  11. יש לחמוק עד שהטיפות כבר לא יהיו לשם (~1 מ"ל). לאחר מכן, לחמוק עוד 0.5 מ"ל בשבר נפרד ולאחר מכן להפסיק לברוח.
    הערה: תקנים זמינים כעת במגוון רחב של משקולות מולקולריות, כמו ערכות או משקולות מולקולריות בודדות לכייל את נפח ההתחמקות של LUVs.
  12. לעטוף את הצינורות עם LUVs בנייר אלומיניום כדי למנוע להלבנה של צבע פלואורסצנטיות.
  13. לשטוף את העמודה עם 20 מ"ל HEPES חוצץ 2.
  14. לאחר מכן ניתן לאחסן את LUVs במשך שבוע ב 4 °C (70 °F).
    הערה: כמו יציבות LUV עשוי להיות תלוי ריכוז LUV הרכב, כמו גם על כוח יוני, את הגודל של LUVs צריך להיות נשלט באמצעות מכשיר פיזור אור דינמי (DLS) (ראה סעיף 4. אפיון של גודל LUV הומוגניות) לפני כל בדיקה.

3. כימות ריכוז LUVs

  1. הערכת ריכוז LUV על ידי ערכת כימות פוספוליפיד, המאפשרת הערכה של ריכוז כולין19. ניתן ליישם את ההסתה הזו כאשר פוספוליפידים עם כולין המכיל את ראש הקוטב משמעותיים (>50% מה-LUVs).
  2. הכן את ריאגנט הצבע על ידי המסת 18 מ"ג של מצע כרומוגן ב 3 מ"ל של חוצץ שסופק.
  3. טען קובט פוליסטירן, 10 x 10 x 45 מ"מ, עם 3 מ"ל של ריאגנט צבע.
  4. השתמש ריאגנט צבע טהור כתנאי ריק (ריק). הוסף 20 μL של דגימת LUV (בדיקה) או 20 μL של פתרון סטנדרטי של ריכוז כולין ידוע (סטנדרטי).
  5. מערבבים היטב ודגרה במשך 5 דקות ב 37 °C כל התנאים (ריק, בדיקה, וסטנדרט).
  6. מדוד את הספיגה (צפיפות אופטית, OD) של מדגם הבדיקה ואת הפתרון הסטנדרטי עם הפתרון הריק כמו הפקד ב 600 ננומטר עם ספקטרופוטומטר.
  7. בדוק את ערכי OD המאפשרים להעריך את ריכוז השומנים של LUVs, C[LUV], שווה ערך כולין לעומת הסטנדרט של ריכוז ידוע.
  8. בצע את החישוב באמצעות המשוואה הבאה:
    C[LUV] (מול / l) = (OD Sample / OD Standard) x C[Standard] (מול / l)
    הערה: ערכת כימות פוספוליפיד סיפקה כולין כלוריד (139.6 מ"ג / ליטר) פתרון סטנדרטי ב 54 מ"ג / ד"ל המתאים לריכוז טוחנת של C[Standard] = 3.87 mmol / L. דגימת OD ותקן OD הם ספיגות נמדדות ב 600 ננומטר עבור פתרונות LUV ו כולין, בהתאמה.

4. אפיון גודל LUV והומוגניות

  1. בצע מדידה באמצעות מכשיר DLS כדי לקבוע את גודל LUV (ב- nm) ואת אינדקס polydispersity (PdI).
  2. תכנת את "הליך הפעולה הסטנדרטי" (SOP) המתאים על-ידי ציון הצמיגות של הממס/המאגר ואת ה- cuvette המשומש.
  3. מקם 500 μL של פתרון LUV בפוליסטירן חצי מיקרו cuvette.
  4. הכנס את cuvette חצי מיקרו פוליסטירן במכשיר DLS.
  5. בטמפרטורת החדר, למדוד את התפלגות הגודל במונחים של גודל ממוצע (Z-ממוצע) של התפלגות החלקיקים ושל הומוגניות (מדד polydispersity, PdI).
  6. כל התוצאות מתקבלות משתי מדידות עצמאיות המבוצעות כל אחת בשלושה מחזורים חוזרים ונשנים.
    הערה: ערכים סטנדרטיים עבור LUVs יהיו בגודל ממוצע של 137 ± 7 ננומטר עם PdI של 0.149 ± 0.041.

5. הכנת פתרונות פפטיד

  1. הכן פתרון מלאי של הפפטיד, אשר צריך להיות מנותח לבדיקת הדליפה.
  2. ממיסים אבקת פפטיד (>95% טוהר) במים טהורים (למשל, 1 מ"ג פפטיד ב-500 μL מים טהורים).
    הערה: מומלץ לדלל פפטידים במים טהורים ולהימנע דימתיל סולפוקסיד (DMSO) solubilization, אשר יכול לגרום חפצים (למשל, פרמזיזציהממברנה 20).
  3. מערבולת פתרון פפטיד עבור 5 s.
  4. Sonicate פתרון פפטיד באמבט sonication מים במשך 5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 12,225 x גרם. לאסוף את supernatant לקביעת ריכוז.
  5. למדוד את הספיגה ב 280 ננומטר של שלושה דילול פפטיד עצמאי ולאחר מכן לחשב ריכוז פפטיד באמצעות מקדם הכחדה טוחנת שלה ε (בהתאם תכולת טריפטופן טירוזין ברצף פפטיד) וחוק באר-למברט.
    הערה: אם הפפטיד מכיל טריפטופן וטירוזין, מקדם הכחדת הטוחנת ε מחושב על בסיס טריפטופן ε = 5,690 M-1ס"מ-1 וטיירוסין ε = 1,280 M-1ס"מ-1. אם רצף הפפטיד אינו מכיל טריפטופן או טירוסין, ניתן לבצע מבחן צבעוני אחר כדי למדוד את הריכוז (למשל, BCA או ברדפורד).
  6. לדלל את פתרון פפטיד במים טהורים לפתרון סופי של 100 מיקרומטר ולאחסן ב 4 °C (70 °F).
    הערה: במים טהורים, אין השפלה פפטיד מתרחשת במהלך אחסון 4 °C (4 °F). עם זאת, ריכוז פפטיד צריך להימדד כל 2 שבועות כדי להבטיח כי אין אידוי מים מתרחשת.

6. בדיקת דליפת פלואורסצנטיות

  1. בדיקת דליפת פלואורסצנטיות נמדדת על ספקטרופלואורומטר בטמפרטורת החדר. עירור ואורך גל פליטה קבועים ב- Ex = 360 ננומטר ± 3 ננומטר ו- Em = 530 ננומטר ± 5 ננומטר, בהתאמה.
  2. לדלל LUVs 1 מ"ל HEPES חוצץ 2 לריכוז הסופי של 100 מיקרומטר ב cuvette פלואורסצנטי קוורץ. מוסיפים מערבל מגנטי כדי הומוגניזציה הפתרון במהלך הניסוי.
  3. מדוד את LUVs לבד במהלך 100 s הראשונים, בין t = 0 s ו- t = 99 s כדי לגשת פלואורסצנטיות הרקע.
    הערה: LUVs לבד יכול להימדד גם במהלך הניסוי כולו (15 דקות) על מנת לגשת פלואורסצנטיות רקע דליפות פוטנציאליות.
  4. לאחר מכן, למדוד דליפה כעלייה בעוצמת הפלואורסצנטיות עם הוספת עליקוטים של פתרון פפטיד עבור 900 s הבאים (15 דקות). פרוטוקול זה מתבצע עבור כל ריכוז של פפטיד נבדק מ 0.1 μM ל 2.5 μM.
  5. לבסוף, 100% פלואורסצנטיות הושגה על ידי solubilizing LUVs על ידי תוספת של 1 μL של טריטון X-100 (0.1%, v /v), וכתוצאה מכך בדיקה unquenched לחלוטין בין t = 1,000 s ו t = 1,100 s.

7. כימות הדליפה

  1. השמט ערכים שהושגו לאחר t = 1,090 s כדי לשמור על אותו מספר נקודות עבור כל תנאי שנבדק.
  2. חשב את הפלואורסצנטיות המינימלית, Fmin, על ידי ביצוע הממוצע של 50 נקודות בין t = 0 s ו- t = 49 s (LUVs בלבד).
  3. חשב את הפלואורסצנטיות המקסימלית, Fmax, על-ידי ביצוע הממוצע של 50 נקודות בין t = 1,041 s ו- t = 1,090 s (LUVs עם Triton X-100).
  4. חשב את אחוז הדליפה (%דליפה) בכל נקודת זמן (t = x), בהתאם למשוואה הבאה:
    %דליפה(t=x) = (F(t=x) - Fmin) / (Fmax - Fmin) x 100
  5. חשב את הממוצע ואת סטיית התקן עבור ערכים שהושגו עם הכנת LUV שונה (n ≥ 2) עבור אותו תנאי.
  6. התווה את אחוז הדליפה, %Leak(t=x), בפונקציה של זמן (ים).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

עיקרון בדיקת הדליפה פלואורסצנטית מוצג באיור 1. בפירוט, שלל חד-צדדי גדול (LUVs) המקיף צבע פלואורסצנטי וקונצ'ר (ללא אות פלואורסצנטי) מטופלים ביומולקול של עניין. בשל האינטראקציה של הפפטיד עם ממברנות השומנים, אשר יכול לרמוז על חלחול ממברנה, ארגון מחדש או אפילו קרע, צבע פלואורסצנטי ואת quencher משתחררים מן LUVs. דילולים הבאים במאגר גורמים לאות פלואורסצנטיות מוגבר.

למרות תוכנית זו מציגה מבחן עם פפטידים חי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדיקת דליפת הפלואורסצנטיות המוצגת היא שיטה פשוטה ומהירה לטיפול בערערת הממברנה על ידי פפטיד חודר תאים. קל לעשות, זה גם מאפשר השוואה עקיפה בין פפטידים שונים אינטראקציה ממברנה או מולקולות אחרות אינטראקציה ממברנה. לגבי צעדים קריטיים של הפרוטוקול, כמו בדיקת זה מספקת ערכים יחסיים בין הבסיס (LUVs לבד) ושחרור פלואורסצנטי מקסימלי (מצב טריטון), אנו בדרך כלל מעריכים את הריכוז של LUVs באמצעות ערכת כימות פוספוליפיד, אשר רק מעריך את תרומת כולין של LUVs. עם זאת, ניתן גם לכלול מדידה מדויקת יותר של ריכוז LUV על ידי קביעת התוכן הכולל של ז...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

תודות

המחברים רוצים להודות לאמילי ג'וסה על הביקורת הביקורתית על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן "La Ligue contre le Cancer", "Fondation ARC לשפוך la Recherche sur le Cancer", ואת "המרכז הלאומי דה לה Recherche Scientifique" (CNRS).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בקבוק זכוכית עגול תחתון 25 מ"לפיירקס
8-אמינונפתלין-1, 3, 6-חומצה טריסולפונית, מלח דיסודיום (ANTS)InvitrogenA350הגן מפני אור 
כלורופורם סיגמא-אולדריץ'288306
כולסטרולסיגמא-אולדריץ'C8667
DOPC (דיולאוילפוספטידילכולין)Avanti Polar850375Pהגן מפני מכבש אוויר
Avanti Polar610000
פלואורידרPTI Serlabo
50 ומיקרו; מזרק זכוכית LHamilton705N
HEPESSigma-AldrichH3375
Labבדיקת פוספוליפיד וואקו 296-63801
עמודת כרומטוגרפיה נוזליתסיגמא-אולדריץ'
מתנולקרלו ארבה414902
קרום פוליקרבונט נוקלפור (0.1 ומיקרו; m גודל נקבוביות, קוטר 25 מ"מ)קוביית800309
, 10 x 10 x 45 מ"מGrener Bio-One614101
פוליסטירן חצי מיקרו קובטה, DLSFisher ScientificFB55924
p-xylene-bispyridinium bromide (DPX)InvitrogenX1525הגן מפני אור 
קובטה פלואורסצנטית קוורץHellma109.004F-QS
מערכת rotavapor HeidolphZ334898
Sephadex G-50 שרףאמרשם17-0042-01
נתרן אזיד (NaN3)Sigma-AldrichS2002
נתרן כלוריד (NaCl)Sigma-AldrichS5886
אמבט סוניקטורUSC300T VWR142-6001
SphingomyelinAvanti Polar860062Pהגנה מפני אוויר
טריטון X-100 Eromedex2000-B
Zetaziser NanoZS מלברןZEN3500
פוליסטירן Whatman

מקורות

  1. Langel, U. Handbook of Cell-Penetrating Peptides. , CRC Press. (2006).
  2. Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics. Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).
  3. Richard, J., et al. Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry. , (2003).
  4. Jones, A., Sayers, E. Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).
  5. Tünnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
  6. Jiao, C. -Y., et al. Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization. Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).
  7. Deshayes, S., et al. Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252(2020).
  8. Konate, K., et al. Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide. International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).
  9. Lehto, T., et al. Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).
  10. Hoyer, J., Neundorf, I. Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids. Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).
  11. Milletti, F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
  12. Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines. Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).
  13. Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs. Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).
  14. Maget-Dana, R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).
  15. Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).
  16. Konate, K., et al. Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells. Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).
  17. Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides. Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).
  18. Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).
  19. Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids. Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).
  20. Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).
  21. Konate, K., et al. Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).
  22. Vaissière, A., et al. A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery. Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34(2017).
  23. Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, Ü, Divita, G., Deshayes, S. Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).
  24. Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis. Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).
  25. Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation. FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).
  26. Mishra, A., et al. Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).
  27. Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots. Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).
  28. Bartlett, G. R. Phosphorus assay in column chromatography. Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).
  29. Stewart, J. C. M. Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).
  30. Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571(2012).
  31. Wimley, W. C. Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity. Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).
  32. Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo. FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).
  33. van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism. PloS One. 5 (12), 14292(2010).
  34. Hassane, F. S., et al. Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides. Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).
  35. Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291(2012).
  36. Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. Electrophysiological characterization of membrane transport proteins. Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

דליפת פלואורסצנטית אסאי לחקור את היציבות בקרום על ידי פפטיד חודר תאים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.