מאמר שיטה

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה, הדמיה קונפוקלית ושחזור תלת ממדי של הצומת הסינואטרולי והאטריובנטריקולרי בעכבר

DOI:

10.3791/62058

⸱

22 בדצמבר 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב לצביעה אימונופלואורסצנטית מלאה של הצומת הסינואפרוזדורי (SAN) והצומת האטריובנטריקולרי (AVN) בלבבות מורין.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האות החשמלי שנוצר פיזיולוגית על ידי תאי קוצב לב בצומת הסינואפרוזדורי (SAN) מתבצע דרך מערכת ההולכה, הכוללת את הצומת האטריובנטריקולרי (AVN), כדי לאפשר עירור והתכווצות של הלב כולו. כל תפקוד לקוי של SAN או AVN גורם להפרעות קצב, דבר המצביע על תפקידן הבסיסי באלקטרופיזיולוגיה והפרעות קצב. מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר הפרעות קצב, אך החקירה הספציפית של SAN ו- AVN נותרה מאתגרת.

ה- SAN ממוקם בצומת של מסוף הקריסטה עם הווריד הנבוב העליון ו- AVN ממוקם בקודקוד המשולש של קוך, שנוצר על ידי פתח הסינוס הכלילי, הטבעת הטריקוספידית והגיד של טודרו. עם זאת, בשל הגודל הקטן, הדמיה על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית נותרה מאתגרת והיא אינה מאפשרת את המחקר של SAN ו- AVN בסביבת התלת-ממד שלהם.

כאן אנו מתארים גישה אימונופלואורסצנטית של הר שלם המאפשרת הדמיה מקומית של SAN ו- AVN של עכבר מתויג. צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה מלאה מיועדת למקטעים קטנים יותר של רקמה ללא צורך בחתך ידני. לשם כך, לב העכבר מנותח, עם רקמות לא רצויות הוסרו, ואחריו קיבוע, חדירה וחסימה. תאים של מערכת ההולכה בתוך SAN ו-AVN מוכתמים בנוגדן אנטי-HCN4. מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ועיבוד תמונה מאפשרים התמיינות בין תאי קשרית לבין קרדיומיוציטים עובדים, ולמקם בבירור SAN ו- AVN. יתר על כן, ניתן לשלב נוגדנים נוספים כדי לסמן גם סוגי תאים אחרים, כגון סיבי עצב.

בהשוואה לאימונוהיסטולוגיה קונבנציונלית, צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה שומרת על השלמות האנטומית של מערכת הולכת הלב, ובכך מאפשרת חקירה של AVN; במיוחד כך לתוך האנטומיה שלהם ואת האינטראקציות עם שריר הלב עובד שמסביב תאים שאינם מיוציטים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעות קצב הן מחלות שכיחות הפוגעות במיליוני אנשים, והן גורמות לתחלואה ותמותה משמעותיות ברחבי העולם. למרות התקדמות עצומה בטיפול ובמניעה, כגון פיתוח קוצבי לב, הטיפול בהפרעות קצב נותר מאתגר, בעיקר בשל הידע המוגבל מאוד לגבי מנגנוני המחלה הבסיסיים 1,2,3. הבנה טובה יותר הן של האלקטרופיזיולוגיה הרגילה והן של הפתופיזיולוגיה של הפרעות קצב עשויה לסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפול חדשניות, חדשניות וסיבתיות בעתיד. בנוסף, כדי לחקור באופן מקיף הפרעות קצב, חשוב למקם ולדמיין את מערכת הולכת הלב הספציפית במודלים של בעלי חיים כגון עכבר, שכן עכברים נמצאים בשימוש נרחב במחקר אלקטרופיזיולוגי.

החלקים העיקריים של מערכת ההולכה הלבבית הם הצומת הסינואפרוזדורי (SAN), שבו נוצר הדחף החשמלי בתאי קוצב מיוחדים, והצומת האטריובנטריקולרי (AVN), שהוא החיבור החשמלי היחיד בין האטריה לחדרים4. בכל פעם שהתכונות האלקטרופיזיולוגיות של SAN ו- AVN משתנות, הפרעות קצב כגון תסמונת סינוס חולה או בלוק אטריובנטריקולרי יכולות להתרחש אשר עלולות להוביל להידרדרות המודינמית, סינקופה ואפילו מוות, ובכך להדגיש את התפקיד החיוני של SAN ו- AVN הן באלקטרופיזיולוגיה והן בהפרעות קצב5.

מחקרים מקיפים על SAN או AVN דורשים לוקליזציה מדויקת והדמיה של שני המבנים, באופן אידיאלי בסביבה הפיזיולוגית שלהם. עם זאת, בשל גודלם הקטן ומיקומם בתוך שריר הלב העובד, מבלי לקבוע מבנה ברור הנראה לעין מבחינה מקרוסקופית, חקר האנטומיה והאלקטרופיזיולוגיה של SAN ו- AVN הוא מאתגר. ניתן להשתמש בציוני דרך אנטומיים כדי לזהות בערך את האזור המכיל SAN ו- AVN 6,7,8. בקצרה, SAN ממוקם באזור הבין-קוואלי של האטריום הימני הסמוך למסוף הקריסטה השרירי (CT), AVN ממוקם בתוך המשולש של קוך שהוקם על ידי המסתם הטריקוספיד, האוסטיום של הסינוס הכלילי והגיד של טודרו. עד כה, ציוני דרך אנטומיים אלה שימשו בעיקר כדי למקם, להסיר ולאחר מכן לחקור SAN ו- AVN כמבנים בודדים (למשל, על ידי היסטולוגיה קונבנציונלית). עם זאת, כדי להבין טוב יותר את האלקטרופיזיולוגיה המורכבת של SAN ו-AVN (למשל, השפעות רגולטוריות של תאים סמוכים של שריר הלב העובד), יש צורך לחקור את מערכות ההולכה בסביבה הפיזיולוגית התלת-ממדית.

צביעה אימונופלואורסצנטית מלאה היא שיטה המשמשת לחקר מבנים אנטומיים באתרם תוך שמירה על שלמות הרקמה שמסביב9. באמצעות שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי ובתוכנה לניתוח תמונה, ניתן להמחיש SAN ו-AVN באמצעות נוגדנים המסומנים באופן פלואורסצנטי המכוונים לתעלות יונים המבוטאות באופן ספציפי באזורים אלה.

פרוטוקול זה להלן מסביר את השלבים הדרושים לביצוע שיטת צביעה מבוססת היטב להרכבה מלאה עבור לוקליזציה והדמיה של מיקרוסקופ SAN ו- AVN. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מתאר כיצד (1) למקם SAN ו- AVN לפי ציוני דרך אנטומיים כדי להכין דגימות אלה לצביעה ולניתוח מיקרוסקופיה (2) לבצע צביעה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה של סמני הייחוס HCN4 ו- Cx43 (3) להכין דגימות SAN ו- AVN למיקרוסקופ קונפוקלי (4) לביצוע הדמיה קונפוקלית של SAN ו- AVN. אנו גם מתארים כיצד ניתן לשנות פרוטוקול זה כך שיכלול צביעה נוספת של שריר הלב העובד שמסביב או תאים שאינם מיוציטים כגון סיבי עצב אוטונומיים המאפשרים חקירה יסודית של מערכת הולכת הלב בתוך הלב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטיפול בבעלי חיים וכל הליכי הניסוי נערכו בהתאם להנחיות ועדת הטיפול והאתיקה בבעלי חיים של אוניברסיטת מינכן, וכל ההליכים שבוצעו בעכברים אושרו על ידי ממשלת בוואריה, מינכן, גרמניה (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). עכברי C57BL6/J נרכשו ממעבדת ג'קסון.

הערה: איור 1 מראה את המכשירים הדרושים לניסוי. איור 2 מראה המחשה של אנטומיה של הלב הגס. איור 3 מראה את המיקום של SAN ו-AVN בלב עכבר בוגר. איור 4 מראה את הדגימה המוכנה שהוטענה במיקרוסקופ קונפוקלי.

1. הכנות

  1. הכינו תמיסת פורמלדהיד 4% (4% PFA) על ידי דילול 10 מ"ל של תמיסת פורמלדהיד 16% ב-30 מ"ל PBS.
  2. הכינו תמיסת 15% סוכרוז ותמיסת 30% סוכרוז על ידי המסת 15 גרם ו-30 גרם אבקת סוכרוז ל-PBS של 100 מ"ל, בהתאמה. לאחר המסת אבקת הסוכרוז במלואה, יש לסנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים 0.2 מיקרומטר לפני האחסון בטמפרטורה של 4°C.
  3. הכינו ג'ל אגרוז 3%-4%, הוסיפו 3 גרם או 4 גרם אבקת אגרוז ו-100 מ"ל של 1x TAE (מדולל מתמיסת מלאי TAE פי 50) לכוסית. מניחים את הכד על מערבל מגנטי ומרתיחים אותו עד שהאגרוז מומס לחלוטין.
  4. מכינים את צלחת הדיסקציה על ידי מזיגה עדינה של 30 מ"ל ג'ל אגרוז (3%-4%) בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ. השאירו את צלחת הפטרי על הספסל בטמפרטורת החדר כדי להתקרר ולהתקשות.
  5. הכינו תמיסת חסימה ותמיסת כביסה בהתאם למתכונים המופיעים בטבלה 1. הכינו את כל הפתרונות שהוכנו ביום השימוש. אחסון לטווח ארוך אינו מומלץ.
  6. הכינו את תמיסות הנוגדנים על ידי דילול שלהן בקור (4°C) 1x PBS, הגנו על הדילול מפני אור (למשל, על ידי עטיפת רדיד אלומיניום מסביב) ושמרו דילול על קרח עד לשימוש. לדלל את הנוגדנים זמן קצר לפני הדגירה. הימנעו מהשארת הנוגדנים המדוללים בטמפרטורת החדר.
    הערה: יש לבדוק את דילול הנוגדנים המתאים עם דגימות רקמה דומות על ידי ביצוע צביעה אימונופלואורסצנטית קונבנציונלית. כאן בדקנו את הנוגדנים על ידי צביעת חלקים קפואים שנחתכו בעובי של 10 מיקרומטר.

2. קצירת איברים והכנת רקמות

  1. מרדימים את העכבר על ידי הכנסתו לתא דגירה המחובר למאדה איזופלורן. הגדר את הוופורייזר לספק 4-5% isoflurane (96-95% חמצן, בהתאמה).
    הערה: הרדמה מלאה מאושרת על ידי אובדן התגובה היציבתית ורפלקס התיקון על ידי גלגול עדין של החדר עד שהעכבר מונח על גבו.
  2. שים את העכבר במצב שכיבה על שולחן הניתוחים. הכניסו את אף העכבר למסכת הרדמה המחוברת למעגל Bain שונה עם הצינור הפנימי שלו מחובר לוופורייזר איזופלורן. כדי לשמור על הרדמה, יש להשתמש באיזופלורן 1-2% בחמצן בקצב זרימה של 1 ליטר/דקה. יש לסלק אדי הרדמה עודפים מהעכבר דרך הצינור החיצוני של המסכה ולשאוב דרך מיכל של פחם פעיל, אשר סופג את גז ההרדמה העודף.
  3. כאשר מושגת הרדמה מלאה, יש להזריק פנטניל לשיכוך כאבים (0.1 μגרם / 25 גרם משקל גוף i.p).
  4. כאשר רפלקס צביטת הבוהן אינו ניתן לגילוי, בצע חתך ברור מהג'וגולום לסימפיזיס באמצעות מספריים של הקשתית כדי להסיר פרווה ועור. בצע חתך נוסף משמאל לימין מתחת לצלעות באמצעות מספריים הקשתית כדי לפתוח בזהירות את הבטן.
  5. לחיות את הקסיפואיד קצת באמצעות מלקחיים מעוקלים כדי לאפשר לחתוך את הסרעפת משמאל לימין מבלי לפגוע באיברים. חתכו את כלוב הצלעות בקו מדיאלי בבית השחי משני הצדדים באמצעות מספריים של הקשתית כדי להפוך אותו באופן גולגולתי ולאפשר גישה ללב.
  6. חותכים את הווריד הנבוב התחתון ואת אבי העורקים החזי היורד בגובה הסרעפת באמצעות מספריים קשתית. נקב את הלב עם מחט 27 G באזור הקודקוד ולאחר מכן בזהירות לדחוף את המחט לתוך החדר השמאלי (LV). הזריקו בעדינות 5-10 מ"ל של PBS קר כקרח לתוך LV כדי לחורר את הלב.
    הערה: צבע הלב צריך להפוך מאדום לאפור המציין זילוח מוצלח עם PBS.
  7. בזהירות להרים את הקודקוד של הלב באמצעות פינצטה המאפשר לחתוך את כלי הדם הגדולים כדי להסיר את הלב.
  8. הבלו את הלב על ידי חיתוך העורקים והוורידים הגדולים רחוק ככל האפשר מהלב כדי למנוע נזק לווריד הנבוב העליון (SVC). שמור על SVC מכיוון שהוא ישמש ציון דרך חשוב במהלך עיבוד מאוחר יותר.
  9. לאחר הסרת הלב, כבו את מכשיר האידוי איזופלורן.
  10. הכניסו את הלב לצלחת דיסקציה מלאה ב-PBS קר כקרח מתחת למיקרוסקופ המנתחת. לאחר קביעת שמאל/ימין וחזית/גב הלב, סובבו את הלב כשקדמת הלב בתחתית הצלחת (כדי לחשוף את כלי הדם הגדולים הממוקמים מאחור).
  11. לשתק את הלב על-ידי הכנסת סיכה קטנה דרך הקודקוד ותוספתן פרוזדורים שמאלי (LAA) לתוך האגרוז בתחתית צלחת הדיסקציה (איור 2A). בעזרת פינצטה עדינה ומספריים, הסירו בזהירות רקמות שאינן לבביות סביב ה-SVC והווריד הנבוב התחתון (IVC) (למשל, ריאות, שומן, קרום הלב) כדי לחשוף את האזור הבין-קוואלי (איור 3A).
  12. הסר את רוב החדרים על ידי חיתוך מקביל את החריץ בין החדרים ואת אטריה עם מספריים מיקרו. שמרו חלק קטן מרקמת החדר לצורך העמסה מאוחרת יותר על טבעת הפרספקס.
  13. עבור קיבוע והתייבשות, לשים את הדגימה (המכילה את אטריה, SVC ו IVC) ב 4% PFA לילה ב 4 ° C.
  14. למחרת, להעביר את הלב לתמיסת סוכרוז 15% למשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
  15. למחרת, להעביר את הלב לתמיסת סוכרוז 30% למשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: עבור הקיבוע וההתייבשות בשלב 2.13, 2.14 ו-2.15, הדגימות נותרות בטמפרטורה של 4°C ללא ערבוב נוסף או נדנוד.

3. צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם

  1. יש לשטוף את הלב ב-1% Triton X-100 מדולל ב-PBS ולחסום ולחדור בתמיסת חסימה (טבלה 1) למשך הלילה ב-4°C.
  2. מניחים את הלב בצינור של 1.5 מ"ל ודגורים עם ארנב נגד עכבר connexin-43 (דילול של 1:200) ונוגדנים נגד עכבר HCN4 (דילול של 1:200) מדוללים בתמיסת חסימה במשך 7 ימים ב 4 ° C.
    הערה: יש לבדוק את הריכוז האופטימלי של נוגדנים ראשוניים לפני השימוש בגיליונות הנתונים כהתמצאות. גם אנטיגנים אחרים בעלי עניין עלולים להיות מוכתמים בשלב זה, כל עוד המין המארח של האנטיגן הראשוני שונה מהאחרים. ריכוז גבוה יותר של Triton X-100 עשוי לסייע בהשגת צביעת נוגדנים יעילה יותר כפי שהודגם לפני10, אך הריכוז עשוי להיקבע בנפרד.
  3. לאחר 7 ימים, להסיר את התמיסה המכילה נוגדנים ראשוניים באמצעות פיפטה ולשטוף את הלב עם 1% Triton X-100 פתרון 3 פעמים (כל פעם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית).
  4. לאחר השטיפה, לדגור על הלב = עם Alexa Fluor 488 עז נגד חולדה IgG (דילול של 1:200) ו Alexa Fluor 647 עז נגד ארנב IgG (דילול של 1:200) במשך 7 ימים ב 4 ° C.
  5. לאחר 7 ימים, להסיר את כל הפתרון המכיל נוגדנים משניים באמצעות פיפטה. לאחר מכן שטפו את הלב באמצעות תמיסת שטיפה (טבלה 1) 3 פעמים (כל פעם למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על השייקר המסלולי).
  6. כדי להכתים גרעינים, יש לדגור על הלב בתמיסת DAPI (10 מיקרוגרם/מ"ל) למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C.
  7. למחרת, לשטוף את הלב עם פתרון כביסה 3 פעמים (כל פעם במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי).
    הערה: עבור חסימה, חלחול, דגירה נוגדנים וצביעת DAPI בשלב 3.1, 3.2, 3.4 ו -3.6, להשאיר את הדגימות במצב יציב ב 4 ° C, אין צורך ערבוב. הרקמה המוכתמת יכולה להישמר מכוסה במלואה בתמיסת כביסה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומוגנת מפני אור למשך מספר ימים עד להדמיה במיקרוסקופ קונפוקלי.

4. מיקרוסקופ קונפוקלי

  1. הכינו טבעות פרספקס ומלאו בפלסטלינה (איור 1). במרכז הפלסטלינה נוצר חריץ קטן במרכז לטעינת הלב. צרו חריץ רדוד, מכיוון שיהיה קל יותר לרכוש מישור הדמיה שטוח, ולהתאים את החלל ולהימנע מבועות אוויר בין הדגימה לכיסויים בשלב 4.4.
  2. השתמש באותה דגימת לב להדמיה של SAN ו- AVN ברצף. עבור הדמיית SAN, טען ישירות את הלב ואילו עבור הדמיית AVN, בצע מיקרודיסקציה לפני.
    1. הדמיית SAN
      1. זהה את SAN לפי ציוני דרך אנטומיים: הוא ממוקם בצד הגבי של הלב בתוך האזור הבין-קוואלי (האזור שבין הווריד הנבוב העליון והנחות). קריסטה טרמינליס (באנגלית: crista terminalis, CT) הוא פס השרירים שבין ה-SAN ל-RAA.
      2. הכניסו את הלב לחריץ הפלסטלינה כשגב הלב פונה כלפי מעלה. הוסף PBS ללב כדי להזיז את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו עם PBS (בדרך כלל כמה טיפות של PBS מספיקות).
      3. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, לחץ בעדינות את RAA, LAA ואת החלקים הנותרים של החדר השמאלי לתוך הפלסטלינה כדי לתקן את הלב. ודא כי כל האזור inter-caval ואת מסוף crista ניתן לראות בבירור (לא מכוסה על ידי פלסטלינה). האזור שיצולם מוצג באיור 3A.
    2. הדמיית AVN
      1. לאחר סיום ההדמיה של SAN, אסוף מחדש את אותה דגימה ולאחר מכן השתמש בה עבור הדמיית AVN. עבור מיקרודיסקציה AVN, הניחו את הלב = על צלחת דיסקציה מתחת למיקרוסקופ הדיסקציה.
      2. כיוון הלב כאשר צד ימין פונה כלפי מעלה (כולל החלקים הנותרים של החדר הימני). שימו פינים דרך החלק הנותר של הדופן החופשית של LV (שנמצא עכשיו בתחתית) כדי לשתק את הרקמה (איור 2B).
      3. חתכו את הדופן הפנויה הנותרת של RV כלפי מעלה דרך המסתם הטריקוספיד והווריד הנבוב העליון. לאחר מכן הפוך את RV ו- RA כדי לחשוף מחיצות בין-חדריות ובין פרוזדוריות. (איור 3B)
        הערה: שימו לב לא לפגוע בסינוס הכלילי (CS), שכן זהו ציון דרך אנטומי חשוב למצוא את המשולש של קוך אשר לאחר מכן מאפשר למקם את AVN. ה-CS עובר באופן רוחבי בחריץ האטריובנטריקולרי השמאלי בצד האחורי של הלב, ופתח ה-CS ממוקם בין IVC לבין המסתם הטריקוספיד בחלק התחתון של המחיצה הבין-פרוזדורית (איור 3A ו-B).
      4. זהה את המשולש של קוך שניתן למצוא על פני השטח האנדוקרדליים של האטריום הימני, הגובל קדמית בקו הציר של עלון המחיצה של המסתם הטריקוספיד (TV), ואחורית על ידי גיד טודרו. הבסיס נוצר על-ידי פתח הסינוס הכלילי (איור 3B). מכיוון שזהו אזור היעד להדמיית AVN, הוא צריך להיות גלוי בבירור.
      5. מעבירים את הלב לחריץ הפלסטלינה בתוך טבעת הפרספקס כאשר משולש קוך חשוף בבירור (כלומר לא מכוסה בפלסטלינה). לחץ בעדינות על הרקמה סביב משולש קוך לתוך הפלסטלינה כדי לקבע את הדגימה. הוסף PBS ללב כדי להזיז את כל האוויר בתוך החלל עד שהלב מכוסה במלואו עם PBS (בדרך כלל כמה טיפות של PBS מספיקות).
  3. יש למרוח סיליקון על שולי טבעות הפרספקס כדי לאפשר כיסוי הלבבות הטעונים בתוך טבעות הפרספקס מלאות הפלסטלינה באמצעות החלקות כיסוי.
  4. לחץ בעדינות על הצד האחורי של הפלסטלינה כדי לסחוט חלקים של PBS ולחבר את הלב לכיסוי תוך הימנעות מבועות אוויר באזור ההדמיה.
    הערה: ודא שאזורי העניין אינם מקופלים ומכוסים במהלך לחיצה על הצד האחורי של הפלסטלינה. מישור הדמיה שטוח ללא דחיסת יתר של הדגימה נחוץ לשימור האנטומיה ולהדמיה קונפוקלית נכונה של הדגימות. עבור SAN, חשוב לוודא שהאזור הבין-קוואלי חשוף בבירור. עבור AVN, המשולש של קוך צריך להיות חשוף במלואו.
  5. הניחו את דגימות הצביעה בהרכבה שלמה הפוכה על פלטפורמת המיקרוסקופ הקונפוקלי. ה-SAN/AVN החשוף המחובר לחלקת הכיסוי נמצא כעת בתחתית פלטפורמת המיקרוסקופ (איור 4).
    הערה: כדי לצלם תמונות, אנו משתמשים ב- Carl Zeiss LSM800 עם Airyscan Unit ובתוכנה ZEN 2.3 SP1 שחור.
  6. בחר צלחת "BP420-480 + LP605" עבור עירור של Alexa Fluor 647 מצומד אנטי HCN4. לשנות את רווח המאסטר מ 650-750.
  7. צלם תמונת סקירה כללית של אזור SAN ו- AVN כולו באמצעות הפונקציה סריקת אריחים . לאחר מכן בחר את האזור החיובי HCN4 על ידי לחיצה והוספת ריבוע על תמונת הסקירה סביב אזור העניין שייסרק.
  8. בדוק את הפרמטרים, כולל לוחות ורווח מאסטר עבור שאר הערוצים (Alexa Fluor 488 ו- DAPI) של המיקרוסקופ הקונפוקלי והגדר כמתואר בשלב 4.6.
  9. כוונן באיטיות את המוקד מלמעלה למטה של הדגימה כדי להציג תצוגה מקדימה של הדגימה כולה ולהגדיר את הראשון והאחרון עבור טווח מחסנית Z. הגדר מרווח זמן אופטימלי עבור מחסנית Z בהתבסס על עובי הדגימה האופטית. אנו משתמשים במטרה של 20x, ו- 0.8-1 מיקרומטר כמרווח עבור Z-stack.
  10. לאחר שכל הפרמטרים מוגדרים כראוי, סרוק את כל האזור של SAN ו- AVN.
  11. בצע שחזור תלת ממדי של התמונות באמצעות תוכנה (למשל, Imaris גרסה 8.4.2).
    1. בחר עיבוד תמונות | חיסור קווי בסיס להסרת צביעת רקע.
    2. בחרו 'יצירת משטח ב'קביעה' לערוץ ולאזור העניין שנבחרו לעיבוד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, ניתן לבצע הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית הן של SAN והן של AVN. צביעה ספציפית של מערכת ההולכה באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים ל-HCN4 וצביעה של שריר הלב העובד באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים המכוונים ל-Cx43 מאפשרת זיהוי ברור של SAN (איור 5, וידאו 1) ו-AVN (איור 6, וידאו 2) בתוך האנטומיה השלמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנטומיה של הלב נחקרה באופן מסורתי באמצעות חתכים היסטולוגיים דקים11. עם זאת, שיטות אלה אינן משמרות את המבנה התלת מימדי של מערכת ההולכה ולכן מספקות מידע דו-ממדי בלבד. פרוטוקול צביעת האימונופלואורסנציה המתואר כאן מאפשר להתגבר על מגבלות אלה וניתן להשתמש בו באופן שגרתי להדמיית SAN ו-AVN.

בהשוואה לשיטות סטנדרטיות כגון אימונוהיסטוכימיה קונבנציונלית הדורשות הטבעה של פרפין, חתך ושליפת אנטיגן, מתודולוגיית ההרכבה המלאה מועילה לטיפול בלוקליזציה התלת-ממדית המדויקת ובמורפולוגיה של SA...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המלגות של סין (CSC, ל R. Xia), המרכז הגרמני למחקר לב וכלי דם (DZHK; 81X2600255 ל S. Clauss, 81Z0600206 ל S. Kääb), קרן הקורונה (S199/10079/2019 ל S. Clauss), SFB 914 (פרויקט Z01 ל H. Ishikawa-Ankerhold ו S. Massberg ופרויקט A10 ל C. Schulz), ERA-NET על מחלות לב וכלי דם (ERA-CVD; 01KL1910 ל S. Clauss) ואת קרן Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl (ל S. Clauss). למממנים לא היה כל תפקיד בהכנת כתבי היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חזקה>הרדמה
איזופלורן הוגו זקס אלקטרוניק34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910כולל תא אינדוקציה, יחידת פינוי גז ומסנני פחם
מעגל ביין שונההוגו סאקס אלקטרוניק73-4860כולל מסכת הרדמה לעכברים
פלטפורמה כירורגיתקנט סיינטיפיקSURGI-M
In vivo מכשור
מלקחיים עדיניםכלי מדע עדינים11295-51
מספריים איריסכלי מדע עדינים14084-08
מספריים אביבייםכלי מדע עדינים91500-09
מלקחיים לרקמותכלי מדע עדינים11051-10
סיכות רקמותכלי מדע עדינים26007-01יכול להשתמש במחטי 27G כתחליף
<מכשירי מעבדה חזקים>כלליים
שייקר אורביטליSunlabD-8040
בוחש מגנטיIKA פיפטה בסיסית
, נפח 10 ומיקרו; L, 100 ומיקרו; L, 1000 ומיקרו; LEppendorfZ683884-1EA
מיקרוסקופים
דיסקציה סטריאו-זום מיקרוסקופ VWR10836-004
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקליZeissLSM 800
תוכנה
Imaris 8.4.2מכשירי
ZEN 2.3 SP1 שחורZeiss
כללי חומר מעבדה
0.2 ומיקרו; m מסנן מזרקSartorius17597
100 מ"מ צלחת פטריפלקון351029
27 גרם מחטBD מיקרולנס 3300635
50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילןפלקון352070
5 מ"ל מזרקבראון4606108V
כיסוי מחליקתרמו מדעי7632160
צינורות אפנדורף30121872
<חזקים>כימיקלים
0.5 מ' EDTASigma20-158רכיבים של תמיסת פורמלדהיד TEA
16%Thermo Scientific 28908השתמש כפתרון של 4% 
חומצה אצטיתMerck100063רכיבים של TEA
AgaroseBiozym850070
סרום בקר אלבומיןסיגמאA2153-100G
DPBS (1X) פוספט מבודד של DulbeccoGibco14190-094
סרום עיזים רגילSigmaNS02L
סוכרוזSigmaS1888-1kg
רכיבי Tris-baseRocheTRIS-ROשל TEA
Triton X-100SigmaT8787-250mlמדולל ל-1% ב-PBS
Tween 20SigmaP2287-500ml
<חזק>תרופות
פנטניל 0.5  מ"ג/10  mLBraun Melsungen
Isoflurane 1 מ"ל/מ"לCp-pharma31303
חמצן 5 ליטרלינדה2020175כולל ווסת לחץ
<חזק>נוגדנים
עז נגד ארנב IgG Alexa Fluor  488 טכנולוגיית איתות תאים#4412מדולל ל-1:200
עיזים נגד חולדות IgG Alexa Fluor 647Invitrogen#A-21247מדולל ל-1:200
Hoechst 33342, טריהידרוכלוריד, טריהידראט (DAPI)InvitrogenH3570מדולל ל-1:1000
ארנב אנטי-קונקסין-43סיגמהC6219מדולל ל-1:200
חולדה אנטי-HCN4 (SHG 1E5)InvitrogenMA3-903מדולל ל<1:200
חזק>אחר
טבעתבעיצוב עצמי ומודפס בתלת מימד
פלסטלינהCernit49655005
Silikonpasten, BaysiloneVWR291-1220
<חזק>בעלי חיים
עכבר, C57BL/6ג'קסון
<מערכת אידוי RHאוקספורד פרספקס מעבדת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
  2. Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374(2020).
  3. Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
  4. van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
  5. Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
  6. Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
  7. Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
  8. Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
  9. Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
  10. Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  11. Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
  12. Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
  13. Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. Dictyostelium discoideum Protocol. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).
  14. Shaw, P. J. Handbook Of Biological Confocal Microscopy. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).
  15. Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
  16. Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
  17. Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
  18. Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
  19. Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664(2014).
  20. Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
  21. Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81(2013).
  22. van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

to:

Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

תגיות

HCN443

מאמרים קשורים