מאמר שיטה

מערכת טיהור חלבונים חסכונית ורב-תכליתית בעלת תפוקה גבוהה באמצעות מתאם צלחת רב-עמודות

DOI:

10.3791/62075

⸱

21 במאי 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, University of Liverpool, 2Health Sciences Center, Texas Tech University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתאם צלחת מרובה עמודות מאפשר לממשק עמודות כרומטוגרפיה עם לוחות איסוף מרובי בארות לזיקה מקבילה או לטיהור חילופי יון המספקים שיטת טיהור חלבון חסכונית בעלת תפוקה גבוהה. זה יכול לשמש תחת כוח הכבידה או ואקום מניב כמויות מיליגרם של חלבון באמצעות מכשור סביר.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טיהור חלבונים הוא הכרחי לחקר מבנה החלבון ותפקודו ומשמש בדרך כלל בשילוב עם טכניקות ביופיזיות. זהו גם מרכיב מרכזי בפיתוח טיפולים חדשים. העידן המתפתח של פרוטאומיקה תפקודית מתדלק את הביקוש לטיהור חלבונים בתפוקה גבוהה וטכניקות משופרות כדי להקל על כך. ההשערה הייתה כי מתאם לוחות מרובה עמודות (MCPA) יכול לממשק עמודות כרומטוגרפיה מרובות של שרפים שונים עם לוחות רב-באר לטיהור מקביל. שיטה זו מציעה שיטה חסכונית ורב-תכליתית של טיהור חלבונים שניתן להשתמש בה תחת כוח משיכה או ואקום, המתחרה במהירות של מערכת אוטומטית. MCPA יכול לשמש כדי לשחזר תפוקות מיליגרם של חלבון על ידי שיטה סבירה ויעילה בזמן עבור אפיון וניתוח הבאים. ה- MCPA שימש לטיהור זיקה בתפוקה גבוהה של תחומי SH3. חילופי יון הוכח גם באמצעות MCPA כדי לטהר חלבון לאחר כרומטוגרפיה זיקה Ni-NTA, המציין כיצד מערכת זו יכולה להיות מותאמת לסוגי טיהור אחרים. בשל ההתקנה שלה עם עמודות מרובות, התאמה אישית אישית של פרמטרים יכול להתבצע באותו טיהור, בלתי ניתן להשגה על ידי שיטות מבוססות צלחת הנוכחי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות טיהור חלבונים להשגת כמויות מיליגרם של חלבונים מטוהרים הן הכרחיות לאפיון וניתוח שלהם, במיוחד עבור שיטות ביופיזיות כגון NMR. טיהור חלבונים הוא גם מרכזי בתחומים אחרים של מחקר כגון תהליכי גילוי תרופות ומחקרי אינטראקציה בין חלבונים לחלבון; עם זאת, השגת כמויות כאלה של חלבון טהור יכול להיות צוואר בקבוק עבור טכניקות אלה1,2,3. השיטה העיקרית לטיהור חלבונים היא כרומטוגרפיה, הכוללת מגוון שיטות המסתמכות על המאפיינים האישיים של חלבונים ותגיהם. ב כרומטוגרפיה זיקה, חלבונים יש חלבון נוסף או מוטיב פפטיד שעובד כתג שיש לו זיקה מצע מסוים על משרף כרומטוגרפיה4. שיטת הזיקה הנפוצה ביותר היא כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת (IMAC) באמצעות חלבונים מתויגים על ידי His, ואילו שיטה פופולרית נוספת היא כרומטוגרפיה של חילופי יון המפרידה חלבונים על סמך המטען שלהם. עבור הטוהר הגבוה ביותר, שילוב של כרומטוגרפיה זיקה והחלפת יון משמש לעתים קרובות יחד, בדרך כלל דורש ציוד מעבדה יקר עבור תפוקה גבוהה.

העידן המתפתח של פרוטאומיקה תפקודית מתדלק את הביקוש לטכניקות תפוקה גבוהה לטיהור חלבונים לא ייחודיים לניתוח ספציפי אלא למספר רב של חלבונים בו זמנית לניתוח מקיף ומחקרים רחבים בגנום5. כרומטוגרפיה של זיקה מתכת משותקת (IMAC) היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לטיהור חלבונים בתפוקה גבוהה6,7 ובכל זאת המערכות האוטומטיות שלה יקרות ובלתי ניתנות להשגה עבור מעבדות קטנות יותר8. החלופות הזולות יותר המבוססות על לוחית רישוי הזמינות כיום משתמשות בשימוש בציוד נגיש מבוסס מעבדה, כגון ואקום. למרות ששיטות אלה מצליחות לשפר את מהירות הטיהור, הן יכולות להשיג טיהור בעל תפוקה גבוהה רק בקנה מידה קטן יותר, רק מניב חלבון בטווח המיקרוגרם. מגבלות אלה אומרות כי ארוז מראש 96 גם מסנן צלחות (למשל, מ GE Healthcare עכשיו בבעלות Cytiva) לא ניתן להשתמש לפני טכניקות ביופיזיות9. כרומטוגרפיית הכבידה היא שיטת הטיהור החסכונית ביותר; עם זאת, הגדרת עמודות מרובות אינה נוחה ויכולה להיות מועדת לשגיאה עבור חלבונים מרובים.

מתאם צלחת מרובה עמודות (MCPA) פותח והוכח בהצלחה ובנוחות להפעיל עמודות כרומטוגרפיה זיקה מקבילה בבת אחת כדי לטהר שלו מתויג שמרים SH3 תחומים10. ה- MCPA מציע שיטת טיהור חסכונית בעלת תפוקה גבוהה שאינה תלויה במכשור יקר. העיצוב הגמיש שלו יכול לטהר ביעילות מיליגרם של חלבון על ידי עמודי כרומטוגרפיה זיקה מרובים תחת כוח הכבידה או סעפת ואקום. יתר על כן, ניתן להתאים סוג, אמצעי אחסון ופרמטרים אחרים עבור כל עמודה בודדת למיטוב מהיר יותר. מחקר זה מדגים כי כרומטוגרפיה חילופי יון על ידי MCPA ניתן להשתמש בשילוב עם כרומטוגרפיה זיקה על ידי MCPA כדי לשפר את הטיהור של התחום Abp1 SH3. בנוסף, ניתן להפריד עד 24 חלבונים שונים במקביל בשיטות אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. כרומטוגרפיה של Ni-NTA

  1. מכין מאגרים
    הערה: ראה טבלה 1 לקבלת פרטים על כל המאגרים.
    1. לפצות 500 מ"ל של 0.5 M NaOH, הקפד להוסיף את המים מילי-Q הראשון ולאחר מכן הוספת NaOH לאט בעוד הכומה היא על stirrer. סנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    2. הכן 100 מ"ל של 0.1 M ניקל סולפט ומסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    3. הכן 50 מ"ל של 2 M imidazole ומסנן באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    4. הכן ומסנן 0.22 מיקרומטר 1.5 L של מאגר denaturing ב pH 8.0 המורכב 5.3 mM Tris-HCl, 4.7 mM Tris-base (טריס (הידרוקסימתיל)מתילאמין), 13.7 מ"מ NaH2PO4, 86.3 מ"מנה 2HPO4 ו 6 M גואנידין הידרוכלוריד.
    5. הכן ו 0.22 מיקרומטר מסנן 500 מ"ל של פתרון מאגר תמוגה של 10 mM imidazole מומס מאגר denaturing (ראה 1.1.4) באמצעות 2 M מניית imidazole.
    6. הכן ו 0.22 מיקרומטר מסנן 500 מ"ל של פתרון חיץ לשטוף של 10 mM imidazole מומס מאגר denaturing (ראה 1.1.4) באמצעות 2 M מניית imidazole.
    7. הכן ו 0.22 מיקרומטר מסנן 500 מ"ל של 100 מ"מ מאגר EDTA, להתאים את ה-pH ל 8 באמצעות 1 M NaOH.
    8. הכן ו 0.22 מיקרומטר מסנן 500 מ"ל של מאגר elution מורכב 7 מ"ל של 99% חומצה אצטית קרחונית לתוך 6 M guanidine הידרוכלוריד.
      הערה: אם אתה משתמש במאגרים מקוריים, התאם בהתאם לטבלה 1.
  2. תאי Lysing (שיטת דנאטרינג)
    1. הוסף 2 מ"ל של מאגר תמוגה לכל 1 גרם של כדורי תא E. coli שנקטפו המכילים את החלבון שלו יתר על התויג. וורטקס במשך מספר דקות עד שהתאים מושעים מחדש. השאירו את הדגימות על נדנדה במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    2. כדורי צנטריפוגה ב lysed ב 18,000 x g במשך 30 דקות. שמור 50 μL בצד ב -20 מעלות צלזיוס מקפיא לנתח מאוחר יותר על ג'ל SDS-PAGE.
    3. בזהירות לשפוך את supernatants לוודא כי גלולה לא מופרע. Lysates צריך להיות ברור, צבע צהוב בהיר. אם lysates מעונן, מדגם צנטריפוגה שוב; שקול sonication אם זמין להשפיל חומצת גרעין.
    4. סנן את supernatants דרך עמודה ריקה (ללא שף אבל עם מסנן) ולאסוף במגש אוסף פתוח. לאחר מכן מעבירים לצינור לשימוש בשלב 1.3.
      הערה: אם אתה משתמש במאגרים המקוריים, לאחר שלב 1.2.1, לטפל בדגימות 3 מחזורים של הקפאה / הפשרה ב -80 מעלות צלזיוס או תהליך על ידי sonication או צרפתית הקש כדי ליז תאים.
  3. הכנת הגדרת טיהור ואקום ועמודות שיווי משקל
    הערה: ראה איור 1 עבור MCPA מוגדר עם 24 עמודות.
    1. קבע כמה עמודות דרושות וכן את סוג השרף ואמצעי האחסון הרצויים. ככלל אצבע עבור 100 מ"ל של תרבות אוטואינדוקציה (~ 2 גלולה גרם) המבטא תחומי SH3 מתויגים באמצעות פלסמידים מבוססי T7, להשתמש 0.6 מ"ל של שרף Ni-NTA לכל עמודה להניב כ 3 מ"ג של חלבון מכ 6 מ"ל של ליסטאט.
    2. הכנס את המספר הרצוי של עמודות 12 מ"ל (ללא שרפין אך עם מסנן) לתוך MCPA מורכב מראש (צלחת טפטוף ארוך עם מחצלת איטום מנוקבת). העמודים צריכים להתאים בנוחות בחורים של מחצלת האיטום שנוקבו.
    3. אם נעשה שימוש בפחות מ- 24 עמודות, סגור חורים ריקים בעמודה סגורה ריקה.
    4. קח צלחת אוסף פתוחה ולשים את הצלחת הזאת לתוך הבסיס של סעפת ואקום ולסגור עם החלק העליון של סעפת.
    5. הנח את MCPA התאספו עם עמודות על גבי סעפת ואקום.
    6. חבר צינורות ממערכת משאבת ואקום לתוך / זרבובית בתחתית סעפת ואקום.
    7. ודא כי חרוזי Ni-NTA נמצאים בתמיסה של 50% עם 20% אתנול. לפני שעושים משהו עם החרוזים בעדינות לנער / לערבב את הפתרון חרוז / אתנול לשימוש חוזר באופן שווה. לאחר מכן, באמצעות פיפטה 5 מ"ל, פיפטה 1.2 מ"ל של פתרון 50% לתוך העמודות. בעוד pipetting לוודא את החרוזים להישאר מעורבים לחלוטין.
    8. לאחר צינור לתוך כל 24 עמודות, להפעיל את משאבת ואקום ולהפעיל את 20% אתנול דרך העמוד לתוך צלחת האיסוף למטה.
    9. לכבות את המשאבה לאחר כל 20% אתנול רץ דרך כל העמודות (Ni-NTA שרפין יכול לסבול ייבוש קצר אם ואקום עדיין מוחל לאחר המאגר עבר דרך העמודה). להשליך את מה שיש בצלחת האיסוף הפתוחה לתוך קופסת פסולת.
      התראה: כל מוצרי הפסולת של חרוזי Ni-NTA מסוכנים, בעת טיפול חרוזים או להיפטר הפסולת, ללבוש כפפות, משקפי מגן PPE אחרים. יתר על כן, להשליך את כל פסולת ניקל סולפט במיכל נפרד לסילוק בודדים מאוחר יותר.
      הערה: אם שוסף חדש או נוצר לאחרונה, ניתן להתעלם משאר השלבים הללו, לעבור לסעיף הבא.
    10. הוסף 3 אמצעי אחסון שרף (1.8 מ"ל) של 100 mM EDTA מאגר באמצעות מזרק 20 מ"ל או התקן מזרק מהדר עם מזרק 50 מ"ל. לאחר מכן הפעל את משאבת ואקום לתת את מאגר EDTA לשטוף דרך ולכבות את המשאבה ברגע שהוא נשטף דרך.
      הערה: לשטוף זה צריך להסיר את הצבע הכחול ניקל אבל אם זה לא המקרה ואז לחזור על שלב זה עד כל העמודות איבדו את הצבע הכחול שלהם. מכבים את המשאבה ויוצקים את תכולת צלחת האיסוף הפתוחה לתוך קופסת הפסולת.
    11. הוסף 3 שרף כרכים (1.8 מ"ל) של 0.5 M NaOH מאגר לתוך כל עמודה לפני הפעלת המשאבה והפעלת זה דרך כל עמודה. לוחית איסוף ריקה.
    12. הוסף 4 כמויות שרף (2.4 מ"ל) של 100 מ"מ ניקל סולפט לתוך כל עמודה. הפעל את משאבת ואקום ולהפעיל את זה דרך העמודה שוב.
    13. הוסף 10 שרף כרכים (~ 6000 μL) של מים מילי-Q והפעלת זה דרך העמודים. מכבים את המשאבה ויוצקים את תכולת צלחת האיסוף לתוך קופסת הפסולת.
    14. לשטוף את העמודות פעמיים עם 4 נפחי משרף (2.4 מ"ל) של 10 mM imidazole במאגר לשטוף (denaturing או מקורי) בכל פעם כדי להסיר כל ניקל עודף שיווי משקל. לוחית איסוף ריקה.
      הערה: אם עמודות כלשהן פועלות לאט יותר באופן משמעותי, ניתן לדחוף את העמודה ולבדוק את האוויר דרך ה- MCPA באמצעות מזרק גדול. אם ביטול החסימה מתבצע, השתמש בעמודה אחרת עם מסנן חדש.
    15. אם דגימות שונות מרובות / חלבונים הולכים להיות מטוהרים על MCPA ואז להחליף את צלחת האוסף הפתוח עם 48 x (5 מ"ל / טוב) צלחת איסוף. עם זאת, כאשר רק פועל אותן דגימות חלבון על כל עמודה, זה בסדר להמשיך באמצעות צלחת אוסף פתוח.
  4. טעינה, כביסה והתעלות
    1. עם ואקום כבוי, לטעון lysates לתוך עמודות (כמות lysate ישתנה, בדרך כלל מ 1 עד 12 מ"ל או יותר וייתכן שיידרש לטעון בכמה אצוות). השתמש מערבל פלסטיק דק בעדינות לערבב את החרוזים ואת lysate בעמודה כדי למקסם את הכריכה.
    2. לאחר ערבוב עדין של כל עמודה במשך מספר דקות, הפעל את משאבת הוואקום והפעל את הליטסאטים דרך העמודות. אם דגימות חלבון מרובות מנוהלות, להשתמש צלחת איסוף 48 גם ולוודא להחליף את צלחת האוסף עבור צלחת נוספת 48 גם לאחר 4 מ"ל יש לרוץ דרך כמו בארות בצלחות אלה יכול להחזיק רק 4 מ"ל של פתרון. המשך להפעיל את lysate עד שכל ה- lysates יפעל בעמודה. הקפא לוחות איסוף המכילים את הזרימה.
      הערה: עמודות עלולות להפוך ל"חסומות" ולגרום ל- lysate לזרום דרך העמודה לאט בהרבה מכפי שהוא אמור לזרום. זה מזוהה בקלות כמו העמודים הסמוכים יהיה זורם בקצב נורמלי. במקרה כזה, מומלץ להעביר את תערובת הליוזט/שף לעמודה המכילה מסנן חדש.
    3. החלף את צלחת האיסוף עם צלחת אוסף פתוחה ריקה ולאחר מכן להוסיף 9 כרכים שרף (5.4 מ"ל) של 10 mM imidazole לשטוף מאגר לכל עמודה ולהפעיל את ואקום ולהפעיל את לשטוף דרך. חזור על זה 4-5 פעמים. כדי למנוע גלישה, צלחת פסולת ריקה מעת לעת.
      1. לאחר מכן החליפו את צלחת האיסוף בצלחת מתאימה ונקייה (צלחת פתוחה לחלבון אחד בלבד ו-96 באר אם יש מספר חלבונים, מה שמבטיח ש- A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה).
    4. באמצעות מזרק מהדר עם מזרק 12.5 מ"ל, פיפטה ~ 1 שרף נפח (0.75 מ"ל) של מאגר elution denaturing לתוך כל עמודה.
    5. כדי למנוע קצף חלבון, הפעל את משאבת ואקום בסביבה הנמוכה ביותר. בעדינות להרים את MCPA כדי לבדוק שום דבר לא נשאר לטפטף לתוך צלחת האוסף.
      הערה: חלופה ל eluting עם ואקום או כוח הכבידה הוא דוחף בוכנה מזרק 10 מ"ל לתוך החלק העליון של העמודה כדי לדחוף בעדינות את חוצץ elution דרך העמודה. עשה זאת עבור כל עמודה, להיות זהיר בעת הסרת בוכנה מזרק לא להפריע את החרוזים בתחתית העמודה. לאחר חיץ elution כבר דחף דרך, בעדינות להסיר את הבוכנה מזרק מהעמודה האחרונה זה שימש בקצרה להפעיל את משאבת ואקום כדי להסיר את הטיפות האחרונות מן העמודות.
      1. אם נעשה שימוש בצלחת איסוף של 96 באר, בדקו את לוחית האיסוף כדי לוודא שמה שזורם מכל עמודה דרך צלחת הטפטוף הארוכה זורם רק לבאר אחת ושום דבר לא עובר לבארות השכנות על צלחת האיסוף.
    6. עבור elution הבא לחזור על 2 השלבים לעיל ולאסוף טרי multi-well (דגימות שונות) או צלחת אוסף פתוח (אותן דגימות).
    7. צעד אופציונלי, לקחת 50 μL aliquot של כל elution לניתוח טוהר וריכוז.
    8. הוסף 2 מ"ל של 20% אתנול לכל עמודה ולהפעיל את זה באמצעות משאבת ואקום. לאחר מכן הוסיפו עוד 2 מ"ל של 20% אתנול לעמודים והשתמשו בווסטר פלסטיק דק וטרי כדי לערבב את האתנול 20% ואת החרוזים לפני המעבר לצינור 50 מ"ל לאחסון ב 4 מעלות צלזיוס. נקה את העמודות ובדוק שהמים זורמים בחופשיות דרך כל עמוד ולאחר מכן לנקות הכל ולשים בצד לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: עמודות מסוימות יחסמו בסופו של דבר את המסננים שלהן ויפעלו לאט מדי, יש להחליף עמודות אלה או לנקות מסננים. ככזה, מומלץ לבדוק מסננים מעת לעת על ידי הסרת שף ומילוי העמודה במים כדי לראות אם היא זורמת במהירות. ניתן לנקות מסננים על-ידי השארת עמודה סגורה מלאה במאגר התרוממות רוח ורעידות בין לילה.

2. החלפת יון - טיהור חלבונים יחיד

  1. הכנת המאגרים
    הערה: ראה טבלה 1 לקבלת פרטים אודות כל המאגרים
    1. הכינו חיץ מלח נמוך ב-2 ליטר: 10 מ"מ טריס pH 8.1 (5 מ"מ חומצת טריס, בסיס טריס 5 מ"מ). פתרון סינון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
    2. הכן חיץ מלח גבוה 0.5 L: 10 mM Tris pH 8.1, 4 M NaCl. מדידה 116.9 גרם של NaCl ולעשות עד 0.5 L עם 10 mM Tris pH 8.1 מלמעלה. פתרון סינון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
  2. ביצוע סדרת ריכוז מלח: 0-1 M NaCl.
    הערה: ניתן להתאים את מגוון ריכוזי המלח לכל חלבון.
    1. התקנה 24 x 50 מ"ל שכותרתו צינורות צנטריפוגה בארון תקשורת
    2. באמצעות המאגרים שנעשו לעיל, להכין 24 x 14 מ"ל NaCl דילולים החל 0-1000 μM. התחל על ידי הוספת הנפחים הנדרשים של 4 M NaCl 10 mM Tris. זה יכול להיעשות על ידי במרווחים של 25 מ"מ או 50 מ"מ בהתאם לחלבון.
    3. לאחר מכן להוסיף את הנפחים הנדרשים של 10 mM Tris לכל צינור. הפוך כל צינור מספר פעמים כדי לערבב.
  3. הכנת דוגמאות
    1. השג את הדגימות שיש לטהר על-ידי החלפת יון. באופן אופציונלי, לקחת 50 μL aliquot לניתוח מאוחר יותר.
      הערה: דגימות תמיד צריך להישמר קר; אלה עשויים להיות lysates, או אולי פוסט Ni-NTA. דגימות מ- Ni-NTA במאגרי denaturing דורשות חיוג או החלפת מאגר במאגר Tris 10 mM. דגימות מ Ni-NTA במאגרים מקוריים יכול להיות מדולל עם 10 mM Tris מאגר כדי להפחית את ריכוז המלח, כך החלבון יכול להיקשר לשרסום IEX.
    2. ספין דגימות ב 18,000 x g במשך 10 דקות.
    3. בזהירות לשפוך את supernatant לתוך סירת שקילה. הימנע להפריע גלולה.
    4. קח את supernatant בזהירות לתוך מזרק 20 מ"ל ולחבר מסנן 0.22 מיקרומטר.
    5. לאט לאט להוציא את supernatant החוצה דרך המסנן לתוך צינור טרי 50 מ"ל.
    6. אם נדרש דילול, לדלל supernatant עם 10 mM Tris מאגר עשה לעיל (בניסוי זה supernatant היה מדולל 1 ב 2). חנות ב 4 מעלות צלזיוס בינתיים.
  4. הכנת מערך טיהור ואקום והתקנת שיווי משקל
    הערה: בפרוטוקול זה, רק עמודה אחת משמשת לטיהור IEX מדגם אחד. לקבלת טיהורים מרובים, עיין בסעיף הבא.
    1. קבע את סוג השרף ואת אמצעי האחסון הרצויים. ככלל אצבע עבור עד 20 מ"ג של תחומי SH3 מתויגים חלקית שלו, השתמש 0.4 מ"ל של שרף זרימה מהירה Q-sepharose לכל עמודה (ראה שלב 2.4.8).
    2. הוסף 24 עמודות ריקות פתוחות (ריקות ללא מסנן בתחתית) לתוך MCPA שהורכב מראש. העמודים צריכים להתאים בנוחות בחורים של מחצלת האיטום שנוקבו.
    3. הנח בוכנה מזרק 10 מ"ל לתוך כל עמודה ריקה למעט המיקום הראשון, שבו הטיהור יתחיל.
    4. לדחוף את החלק התחתון של עמודה פתוחה (עם מסנן) דרך אטם גומי בוכנה מזרק 5 מ"ל (כי כבר פירסינג) כדי ליצור טבעת גומי בסוף העמודה. טבעת גומי זו תבטיח חותם טוב כאשר עמודה זו מוכנסת לכל עמודה ריקה לעיל. לעת עתה, הוסף עמודה זו לעמודה הריקה הראשונה ב- MCPA.
    5. קח צלחת אוסף פתוחה ולשים את הצלחת הזאת לתוך הבסיס של סעפת ואקום ולסגור עם החלק העליון של סעפת.
    6. הנח את ה- MCPA המורכב (עם העמודות) על גבי סעפת הוואקום.
    7. חבר צינורות ממערכת משאבת ואקום למפרצון / זרבובית בתחתית הוואקום.
    8. חותכים קצה פיפטה כחול ~ 2 ס"מ מהתחתית ולהשתמש כדי לקחת עד 800 μL של חרוזי Q-sepharose (או כל שרפרף חילופי יון אחר), להבטיח כי פתרון 50/50 חרוז-אתנול מעורבב כדי למנוע שכבות. פיפטה 800 μL לתוך עמודה אחת פתוחה (עם מסנן) במיקום הראשון וברגע החרוזים להתיישב לתחתית העמודות לעבור על ואקום מספיק כדי לרוץ דרך 20% אתנול.
    9. לשטוף את העמודה המכילה חרוזי sepharose עם 2 x 2 מ"ל של 10 mM Tris. כבה את הוואקום רגע לפני שמאגר Tris עובר כדי למנוע את התייבשות שרף. ניתן לבטל את ההפעלה.
      הערה: אם שרף שימש בעבר, לחדש על ידי כביסה ב 5 כמויות שרף של 4 M NaCl ולאחר מכן 5 שרף כמויות של 10 mM Tris לפני שלב 2.4.9.
  5. טעינה, כביסה והתעלות
    1. להעביר את כל המדגם כדי להיות מטוהרים (ראה סעיף 3) לעמודה Q sepharose במיקום הראשון, להשתמש בלולאת פלסטיק קטנה כדי לבחוש מדגם וחרוזים במשך כ ~ 2 דקות לפני החלפת משאבת ואקום.
      הערה: במקרים של עודף על-טבעי (>12 מ"ל), היזהר ממלאת יתר של העמודה. תן לדגימה לעבור ואז להוסיף עוד, ערבוב לפני לתת לרוץ דרך שוב.
    2. אחסן/הקפא את הזרימה לניתוח מאוחר יותר.
    3. מניחים עוד צלחת איסוף פתוחה לתוך סעפת ואקום ולאחר מכן לשטוף כל עמוד sepharose עם 2 x 2 מ"ל של 10 mM Tris ולאחסן.
    4. הכנס צלחת איסוף של 96 באר, וודא ש- A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה.
    5. כדי לאסוף את שבר ההקלה הראשון, הסר את בוכנה המזרק מהעמודה הבאה לאורך, הזז את העמודה Q sepharose למצב זה והצב את בוכנה המזרק במיקום הקודם. ואז פיפטה 1 מ"ל של ריכוז המלח הראשון לתוך עמוד Sepharose Q. הפעל את המשאבה ולאסוף את elution. מכבים את המשאבה בדיוק כמו הקווים הנוזליים ליד החרוזים כדי למנוע ייבוש החרוזים.
    6. כדי לאסוף את שבר elution הבא, להסיר את הבוכנה מזרק מהעמודה הבאה לאורך, להעביר את העמודה Q sepharose למצב זה ולשים את בוכנה מזרק במיקום הקודם.
    7. מוסיפים 1 מ"ל של ריכוז המלח הבא לעמודה וחוזרים על התהליך עד שכל הריכוזים שימשו ו -24 elutions נאספו ב 24 בארות נפרדות. בדוק שום נוזל לא נכנס כל בארות השכנות.
    8. לשטוף את הטור עם 2 מ"ל של 4 M NaCl 10 mM Tris. תן לזה לעבור.
    9. לשטוף עם 2 מ"ל של 20% אתנול. תן אתנול לרוץ עד שהוא רק מעל החרוזים ועמודת חותם לאחסון.
    10. לאחסן 96 צלחת איסוף היטב ולנתח על ידי ספקטרוסקופיה UV ו- SDS PAGE.

3. חילופי יון - טיהורים בו זמנית של 24 חלבונים שונים

הערה: ראה שלבים 2.1-2.3 לקבלת פרטים על ביצוע מאגרים, סדרה של ריכוזי מלח והכנת דגימות

  1. הכנת כיוונון הטיהור
    הערה: אופן ההגדרה של מערכת הטיהור תלוי מאוד במספר החלבונים המטוהרים ובכמה תנאי מלח ייעשה שימוש. כדי לטהר 12 דגימות עד למקסימום של 24 דגימות בו זמנית, צלחת איסוף עבור כל ריכוז מלח המשמש elute נדרש. עבור פחות מ 12 דגימות, ניתן להזיז את עמודות כרומטוגרפיה כמה עמדות בתוך MCPA אותו לפני שינוי לוחות אוסף. במקרה זה, אין צורך למקם את העמודות בעמודות ריקות והם יכולים להיות מחוברים ישירות מחצלת איטום MCPA. הפרוטוקול שלהלן מיועד ל-24 טיהורי חילופי יון בו זמנית.
    1. הנח את ה- MCPA שהורכב ישירות מחובר ל- 24 עמודות ריקות עם מסננים על גבי סעפת הוואקום המכילה צלחת איסוף פתוחה והכן ושטוף 24 עמודות החלפת יון כמו בשיטת טיהור אחת לעיל. לטיהור זה, נוח להשתמש במשדר או במזרק של Eppendorf כדי להיכנס במהירות לפיפטה לעמודות.
  2. טעינה, כביסה והתעלות
    1. מניחים צלחת איסוף של 48 באר בבסיס סעפת הוואקום לפני התאמת MCPA (עם עמודי הטיהור שטופים המצורפים). ודא ש- A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה.
    2. פיפטה כל דגימת חלבון (עד 5 מ"ל בכל פעם) לתוך העמודה המתאימה שלהם. מערבבים כל עמוד באמצעות לולאת פלסטיק דקה (לולאה אחת לכל עמודה כדי למנוע זיהום) במשך כ 2 דקות. ואז להפעיל את משאבת ואקום ולתת את הזרימה supernatant דרך.
      הערה: במקרים של עודף על-טבעי, היזהרו ממילוי יתר של העמודות. תן לדגימה לעבור בעמודה שלה ולאחר מכן להוסיף עוד ערבוב לפני שתתן לרוץ שוב.
    3. אחסן/הקפיא את צלחת האיסוף של 48 באר לניתוח מאוחר יותר מכיוון שהיא מכילה את הזרימה עבור כל חלבון.
    4. מניחים עוד צלחת איסוף של 48 באר לתוך סעפת ואקום ולאחר מכן לשטוף כל עמוד sepharose עם 2 x 2 מ"ל של 10 mM Tris.
    5. הכנס את צלחת האיסוף הראשונה של 96 באר לסעפת, תוך הבטחה כי A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה ולאחר מכן פיפטה 1 מ"ל של ריכוז המלח הראשון לתוך כל עמודה ולאחר מכן להפעיל את משאבת ואקום כדי להפעיל את זה דרך העמודות. הסר את צלחת האוסף, לכסות עם parafilm ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לניתוח.
    6. חזור על שלב עבור כל ריכוז מלח רצופים המשמשים כדי elute. ודא כי צלחת אוסף חדשה משמשת עבור כל elution וכי כל צלחת אוסף מסומן ומאוחסן.
    7. לשטוף כל עמודה עם 2 מ"ל של 10 mM Tris, 4 M NaCl.
    8. לשטוף כל עמודה עם 2 מ"ל של 20% אתנול. תן אתנול לרוץ עד שהוא רק מעל החרוזים ועמודי חותם לאחסון.
    9. לאחסן 96 לוחות איסוף היטב ולנתח על ידי ספקטרוסקופיה UV ו SDS-PAGE.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לדוגמה, ה- MCPA טיהר בהצלחה 14 מוטציות AbpSH3 בתנאים דאנטוריים באמצעות Ni-NTA (איור 2A). מזהם קטן ~ 25 kDa ניתן לראות, אולם החלבון הוא עדיין טהור במידה רבה. מזהם זה הוא האמין להיות YodA, חלבון משותף מטוהר נפוץ נמצא E. coli11. איור 2B מציג את הטיהור של 11 תחומי SH3 שונים בתנאים מקוריים. מזהם קטן לראות בתנאי denaturing מוסר בתנאים מקומיים. פעולה זו מראה כי MCPA יכול לשמש להשוואת טיהורים המורכבים מאגרים מקוריים או denaturin...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה היא חזקה ופשוטה לשימוש עבור ביוכימאים חלבון לא מנוסה יחסית, עם זאת יש כמה שיקולים לזכור.

זהירות לגבי מילוי יתר של צלחות איסוף

צלחת אוסף 48 באר עצמו מחזיק רק 5 מ"ל לבאר בעוד כל 96-באר מחזיק רק 2 מ"ל. יש לזכור זאת בעת הוספת מאגר והפעלת מדגם דרך העמודה מכיוון שקיים סיכון למילוי יתר של הבארות. בפרט, יש לנקוט טיפול בעת העברת הדגימות הגדולות יותר לעמודת הכרומטוגרפיה לטיהור. במקרים שבהם יש עודף supernatant, לחלק בחלקים, מספיק כדי למלא את העמודה, אשר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי פרס פיתוח מוסדי (IDeA) מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספר המענק P20GM103451 ומענק מחקר פנימי מאוניברסיטת ליברפול.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2 מ"ל / צלחת איסוף בארטכנולוגיות Agilent201240-100
5 מ"ל / צלחת איסוף בארטכנולוגיות Agilent201238-100
עמודות כרומטוגרפיה 12 מ"לBio-Rad7311550
96 צלחת טפטוף ארוכה היטבטכנולוגיות Agilent200919-100מגיעות עם מסנני 0.25 אום שיש להסיר.
96 באר צלחת אטם/מחצלתטכנולוגיות Agilent201158-100צריך להיות ניתן לזיהוי
His60 Ni Superflow ResinTakara Bio635660
HiTrap Q HP אניון חילופי טוריםGE Healthcare (Cytiva)17115301
קורא צלחות LvisBMG LABTECHתואם לקורא צלחות FLUOstar Omega
זכר leur plugsCole-ParmerEW-45503-70
PlatePrep 96 באר ערכת התחלה של סעפת ואקוםSigma-Aldrich575650-U
צלחת איסוף מאגרטכנולוגיות Agilent201244-100
The Repeater PlusEppendorf2226020עם מזרקים של 5 מ"ל ו-50 מ"ל
ואקום VACUSAFEINTEGRA158 320לשואב הוואקום טווח ואקום בין 300 mBar ל-600 mBar ובקבוק איסוף פסולת של 4 ליטר

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C., et al. Development of an Automated Mid-Scale Parallel Protein Purification System for Antibody Purification and Affinity Chromatography. Protein Expression and Purification. , 128(2016).
  2. Renaud, J. P., et al. Biophysics in Drug Discovery: Impact, Challenges and Opportunities. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (10), (2016).
  3. Kim, Y., et al. High-throughput Protein Purification and Quality Assessment for Crystallization. Methods (San Diego, Calif). 55 (1), (2011).
  4. Pan, W., Wang, Y. A New Metal Affinity NCTR 25 Tag as a Better Alternative to the His-tag for the Expression of Recombinant Fused Proteins. Protein Expression and Purification. , 164(2019).
  5. Locatelli-Hoops, S., Sheen, F. C., Zoubak, L., Gawrisch, K., Yeliseev, A. A. Application of HaloTag Technology to Expression and Purification of Cannabinoid Receptor CB2. Protein Expression and Purification. 89 (1), 62-72 (2013).
  6. Pina, A. S., Lowe, C. R., Roque, A. C. A. Challenges and Opportunities in the Purification of Recombinant Tagged Proteins. Biotechnology Advances. 32 (2), (2014).
  7. Gaberc-Porekar, V., Menart, V. Perspectives of Immobilized-Metal Affinity Chromatography. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), (2001).
  8. Anderson, A. C. The Process of Structure-Based Drug Design. Chemistry & Biology. 10 (9), (2003).
  9. Cummin, E., et al. A Simple High-Throughput Purification Method for Hit Identification in Protein Screening. Journal of Immunological Methods. 339 (1), (2008).
  10. Dominguez, M. J., et al. A Multi-Column Plate Adapter Provides an Economical and Versatile High-Throughput Protein Purification System. Protein Expression and Purification. , 152(2018).
  11. Bolanos-Garcia, V. M., Davies, O. R. Structural Analysis and Classification of Native Proteins From E. Coli Commonly Co-Purified by Immobilised Metal Affinity Chromatography. Biochimica et Biophysica Acta. 1760 (9), (2006).
  12. Ayyar, B. V., Arora, S., Murphy, C., O'Kennedy, R. Affinity Chromatography for Antibody Purification. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). , (1129).
  13. Jubb, H., Higueruelo, A. P., Winter, A., Blundell, T. L. Structural Biology and Drug Discovery for Protein-Protein Interactions. Trends in Pharmacological Sciences. 33 (5), (2012).
  14. Grabowski, M., Niedzialkowska, E., Zimmerman, M. D., Minor, W. The Impact of Structural Genomics: the First Quindecennial. Journal of Structural and Functional Genomics. 17 (1), 1-16 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Nickel NTASH3

מאמרים קשורים