מאמר שיטה

גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי

DOI:

10.3791/62077

⸱

3 בפברואר 2021

 ,  ,  , 
1Department of Oncology, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada, 2Department of Cell Biology & Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זוהי שיטה יעילה לסנן מדכאים או נהגים של גרורות סרטן. תאים, המועברים בספריית ביטויים, מוזרקים לתוך כלי הקרום chorioallantoic עוף כדי ליצור מושבות גרורתיות. מושבות שיש להם ירידה או פולשניות מוגברת הם excised, מורחב, reinjected כדי לאשר פנוטיפ שלהם, ולבסוף, מנותח באמצעות רצף תפוקה גבוהה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתקדמות האחרונה בחקר הסרטן המחישה את האופי המורכב ביותר של גרורות סרטן. גנים או רשתות גנים רבים נמצאו מעורבים בוויסות דיפרנציאלי של גנים מפלים גרורתיים וסרטן ומוצרי גנים התלויים בסוג הסרטן, ברקמה ובמאפייני המטופלים הבודדים. אלה מייצגים יעדים פוטנציאליים חשובים לטיפולים גנטיים וגישות לרפואה מותאמת אישית. פיתוח פלטפורמות סינון מהירות חיוני לזיהוי מטרות גנטיות אלה.

קרום chorioallantoic אפרוח (CAM) הוא קרום עשיר מאוד וסקולני, קולגן הממוקם מתחת קליפת הביצה המאפשר חילופי גז בעובר המתפתח. בשל המיקום וכלי הדם של CAM, פיתחנו אותו כמודל גרורות סרטן אנושי תוך-וינטלי המאפשר קסנוגרפטציה של תאים סרטניים אנושיים חזקים והדמיה בזמן אמת של אינטראקציות תאים סרטניים עם מטריצה עשירה בקולגן vasculature.

באמצעות מודל זה, פלטפורמת הקרנה כמותית תוכננה לזיהוי של נהגים חדשים או מדכאים של גרורות סרטן. העברנו מאגר של תאי סרטן HEp3 ראש וצוואר עם ספריית גנים שלמה של גנום אנושי shRNA, ואז הזרקנו את התאים, בצפיפות נמוכה, לתוך vasculature CAM. התאים התרבו ויצרו מושבות תאים חד-גידוליים. מושבות בודדות שלא הצליחו לפלוש לרקמת CAM נראו כפנוטיפ מושבה קומפקטי ונקראו לזיהוי של shRNA transduced הנוכחי בתאים. תמונות של מושבות בודדות הוערכו על ה פולשניות שלהן. סבבים מרובים של בחירות בוצעו כדי להקטין את שיעור החיוביות השגויות. שיבוטים בודדים, מבודדים של תאים סרטניים או שיבוטים מהונדסים חדשים המבטאים גנים מעניינים היו נתונים לבדיקת היווצרות גידול ראשונית או ניתוח אופציות משותפות של כלי התא הסרטני. לסיכום אנו מציגים פלטפורמת סינון מהירה המאפשרת זיהוי יעד אנטי גרורתי וניתוח תוך-וינטלי של מפל אירועים דינמי ומורכב.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גרורות הוא הגורם העיקרי למוות של חולה סרטן1,2,3. תאים סרטניים גרורתיים משתמשים במסלולי איתות ברורים, התלויים בסוג הסרטן, לאורך חמשת השלבים של המפל גרורתי: פלישה מקומית, תוך-פולשניות, הישרדות במחזור הדם, הפזרנות והרחבת המושבה באתרים גרורתיים מרוחקים. ההבנה הנוכחית של תהליך גרורתי זה מצביעה על כך שיש שני שלבים צוואר בקבוק, אחד הוא פלישה כיוונית של התא הסרטני מן הגידול העיקרי, והשני הוא הקמת הנגע גרורתי האתר הרחוק4,5,6. שני השלבים דורשים תאים סרטניים לקיים אינטראקציה פעילה עם קולגן vasculature באתרים של פלישה ראשונית או היווצרות נגע גרורתי רחוק. לכן, תאים סרטניים גרורתיים חייבים להיות מסוגלים להתחבר לתאים, לשפץ סיבי קולגן, בכיוון לפלוש לאורך קירות כלי הדם7. מודלים הקרנה שיכולים לזהות במהירות מטרות טיפוליות antimetastatic לחסום תאים סרטניים מלהשלים שלבים אלה הוא בעל חשיבות עליונה. מודלים קיימים של הקרנת במבחנה אינם מחקים באופן מלא את סביבת הרקמה החיה המורכבת. דגמי עכבר יקרים וגוזלים זמן רב. לכן, יש צורך דחוף בפלטפורמות סינון תוך-וינטליות המספקות סביבות רקמות חיות מורכבות וזיהוי מהיר של מטרות.

בעשור האחרון, עובר העוף הוקם כמודל חזק וחסכוני של גרורות סרטןאנושיות 8,9,10,11,12. רקמת הממברנה הכוריואלנטואית (CAM) של אפרוח היא דקה ושקופה מה שהופך אותה לאידיאלית להדמיה מיקרוסקופית תוך-וינטלית של התנהגויות תאים ומושבות באתרי גידול ו/או גרורתיים12. גידול ראשוני מקווי תאים סרטניים אנושיים מרובים ניתן ליזום גרורות בתוך טווח של מספר ימים בלבד לאחר microinjection לתוך רקמת CAM. תאים סרטניים יכולים להינתן לתוך רקמת CAM במספר דרכים, כולל תוך ורידי, תוך-CAM או כמו קולגן onplants, גמישות זו מאפשרת לחוקר להתמקד בשלבים ספציפיים של התקדמות הסרטן, למשל, היווצרות נגע גרורתי, פלישה מתוך הגידול העיקרי או אנגיוגנזה.

כאן אנו מתארים פלטפורמת סינון כמותית שניתן להשתמש בה כדי למדוד את היכולת של תאים סרטניים ליצור נגעים גרורתיים פולשניים. תאים סרטניים שהועברו עם ספריית ביטוי מוזרקים תוך ורידי לתוך vasculature CAM בצפיפות נמוכה. מושבות גרורתיות נוצרות במשך 4-5 ימים, ואז מעריכים את יכולת הפלישה ואת האינטראקציה של המושבות המתקבלות. מושבות בודדות שאינן פולשות מובאות, מופצים והפנוטיפ שלהן מאושר ב- CAM על ידי נסיגה וכימות של קומפקטיות המושבה ומגעים בין כלי דם לתאים סרטניים. ספריית הביטויים בונה אחראי על פנוטיפ מוטציה המושבה גרורתי יחיד מזוהים מדנ"א גנומי מושבה מבודד באמצעות רצף תפוקה גבוהה. אותה פלטפורמה עשויה לשמש עוד יותר כדי לאמת את הקשר הסיבתי בין גן פנוטיפ נצפה או לבצע מחקרים מכניים מעמיקים על פנוטיפ שנצפו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניסויים בוצעו בהתאם לתקנות ולהנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אלברטה. עוברים של עופות אינם נחשבים לבעלי חיים על ידי מכוני מחקר רבים ואין צורך בפרוטוקולים של בעלי חיים. עם זאת, זוהי השקפה מקובלת כי עוברים עופות יכולים להרגיש כאב, ולכן, יש להתייחס בצורה אנושית ככל האפשר. יש ליצור קשר עם הרשות המקומית לחקר בעלי חיים לפני תחילת כל עבודת מחקר כדי להבטיח כי תקנות נאותות נשמרות.

1. תרבות הביצים ללא קליפה

  1. לרכוש ביצי עוף מופרות מהספק המקומי. ניסוי זה משתמש גזע עוף לגהורן לבן; עם זאת, גזעים אחרים יכולים לשמש גם כן.
    הערה: מומלץ לרכוש 10% יותר ביצים מהנדרש במקרה שחלק מהעוברים נפגעים במהלך הפיצוח ולא ניתן להשתמש בהם בפרוטוקול זה.
  2. מעבירים את מספר הביצים הנדרש לאינקובטור נדנדה לח של 60%. שאר הביצים ניתן לאחסן עד שבועיים ב 12 °C (50 °F) ללא אובדן הכדאיות.
  3. לדגור את הביצים באינקובטור הנדנדה הלח במשך ארבעה ימים.
    הערה: יום 1 הוא כאשר הביצים מועברות לאינקובטור הנדנדה.
  4. הכינו את הכלים השקילה ואת מכסי הפלסטיק לתרבות הביצים נטולת הקליפות. חותכים את אחת הפינות של כל אחת מהמנות השקילה כדי לאפשר גישה יעילה לאוויר לעובר(איור 1A).
  5. מסדרים את הכלים השקילה המוכנים בשורות במכסה המנוע הזרימה. (איור 1B).
  6. בצלחת שקילה נפרדת מכינים 70% אתנול לשטיפת ביצים.
  7. יש לטבול את הביצה ב-70% אתנול, ואז להשתמש בכלי הסיבובי החשמלי כדי לבצע בזהירות ארבעה חתכים בקוטר 2-3 מ"מ במקביל לקוטר הלאטיודינלי הגדול ביותר של הביצה (איור 1C).
  8. מעבירים את הביצה החתוכים לצלחת שקילה ולוחצים בעדינות את הביצה על תחתית המנה עד שנוצר סדק בקליפת הביצה(איור 1D).
  9. מפרידים את חצאי קליפת הביצה ומאפשרים לעובר להחליק לתוך צלחת השקילה. משליכים את קליפת הביצה ומכסים את צלחת השקילה במכסה.
  10. מעבירים את העוברים לאינקובטור לח ולא מתנדנד(איור 1E).
    הערה: כלים שוקלים המכילים את העוברים ממוקמים לתוך מיכלי פלסטיק נפרדים (12 עוברים / מיכל). זה מגביר את הכדאיות של העובר ומאפשר ארגון עובר ספציפי לניסוי.
  11. דגירה עוברים במשך 6 ימים נוספים (עד 10 ימים). בדוק אם יש עוברים מתים או מזוהמים מדי יום והסר אותם מהאינקובטור.
    הערה: עוברים יכולים להיות מזוהמים על ידי נבגי עובש מוטסים. זיהום עובש מתבטא בתחילה כתמים לבנים על פני השטח CAM העובר. הסר את העוברים המזוהמים מיד לנגב את האינקובטור עם 70% אתנול על בסיס שבועי כדי למנוע את הזיהום. מניסיוננו רמות הזיהום נמוכות מאוד ~ 1-3%.
  12. השתמש בעוברים אלה להזרקת תאים סרטניים בבוקר יום 10.

2. הכנת התאים הסרטניים להזרקה

הערה: בחירת המושבה גרורתית מבוססת על פנוטיפ שהוקם על ידי תאים סרטניים פלואורסצנטיים, המופק מספריית ביטויים או וקטור המתויג בחלבון פלואורסצנטי כגון חלבון פלואורסצנטי ירוק או אדום (ראה את זרימת המסך כולה באיור 2A). לא מומלץ להשתמש בתאים שהודבקו באופן חולף בחלבונים פלואורסצנטיים או מסומנים בצבעי פלואורסצנטיים חודרים לתאים עקב דהייה מהירה של האות הנגרמת על ידי התפשטות תאים סרטניים וכתמים לא אחידים.

  1. תאי סרטן תרבית ל 60-70% מפגש בזמן ההזרקה. שימוש בתאים סרטניים ברמות גבוהות יותר של השפעה יקטין את הכדאיות שלהם, וכתוצאה מכך יעילות נמוכה של היווצרות מושבה גרורתית. ודא כי התאים הסרטניים המשמשים הם mycoplasma חינם מאז זיהום mycoplasma עלול להוביל ירידה הכדאיות של עובר עוף.
  2. יש לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS pH 7.4. הסר את PBS הנותרים, ולאחר מכן להוסיף 0.5% טריפסין-EDTA ודגורה ב 37 °C (5 °F) במשך 2-5 דקות עד כל התאים מוסרים מפני השטח צלחת התרבות.
  3. העבר את השעיית התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ותאי צנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 200 x g במשך 5 דקות.
  4. resuspend תאים 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה התאים שוב כמו בשלב 2.3, כדי להסיר טריפסין ורכיבי מדיה אחרים תרבות כגון אנטיביוטיקה.
    הערה: נוכחות של טריפסין או רכיבי תרבית תאים כגון אנטיביוטיקה השעיית התא הסרטני עלולה לגרום לירידה הכדאיות של עובר העוף.
  5. שאפו בזהירות את תאי העל והתוכן מחדש עם 1 מ"ל של PBS קר כקרח.
  6. ספירת מספר התאים באמצעות hemocytometer או כל ציוד ספירת תאים אחר זמין.
    הערה: פרוטוקול סינון זה דורש שכל מושבה גרורתית תא בודד תא ייזום כל מושבה גרורתית. בעת ספירת התאים ודא שהתאים עוברים טריפסינציה מלאה וקיימים כהשעיית תא בודד (אין גושי תאים).
  7. עבור תאי רכז הזרקה תוך ורידי (IV) ל 0.5 x 106 עד 1.0 x 106 תאים/mL. השתמש בקרח קר 1x PBS כדי לדלל ו /או resuspend תרכיזים תא. צפו כי כ 1 מ"ל של השעיית תאים יהיה צורך עבור כל עשרה עוברים.
    הערה: ריכוז השעיית התאים הדרוש בהשעיה נקבע בעיקר על ידי רמת חוויית הנסיין. נא עיין בסעיף הבא לקבלת פרטים נוספים.

3. הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים להיווצרות מושבה גרורתית

הערה: בעקבות פרוטוקול זה ניתן להזריק עד מאה עוברים בתוך יום אחד. בדרך כלל לוקח זמן רב יותר לבודד את המושבות גרורתיות (שלב 5) ואז להזריק את התאים הסרטניים, ולכן, מומלץ לבצע ניסוי ראשוני כדי להעריך את הזמן הדרוש כדי להשלים את כל השלבים. שימוש בתוויות פלואורסצנטיות של תאים סרטניים דיפרנציאליים מסייע בהפחתת מספר בעלי החיים והזמן הנדרש לכל ניסוי. לדוגמה, תאי בקרה יכולים להיות מסומנים עם RFP (חלבון פלואורסצנטי אדום) בעוד תאים סרטניים מוטנטיים ניתן לתייג לחלופין עם GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק). במקרה זה, לכל ניסוי יש שליטה מובנית שמתקנת את השונות הבין-עוברית.

  1. הרכיבו את מנגנון ההזרקה כפי שמוצג באיור 2B. ראשית לעלות מחט על המזרק ולאחר מכן להרחיב את מחט המזרק עם 3-5 ס"מ ארוך חתיכת צינורות.
  2. לשבור את הקצה של מחט borosilicate את באמצעות מלקחיים עדינים (~ 20-60 μL רחב).
  3. טען את המזרק עם השעיית התא הסרטני (50-200 μL) והכניס את מחט borosilicate לתוך הצינורות(איור 2B).
  4. בדוק את מחט borosilicate עבור סתימת תאים ובועות אוויר. זה קריטי להזריק תאים כמו השעיה תא יחיד כדי להבטיח כי כל מושבה גרורתית מופעלת על ידי תא בודד.
    הערה: תאים סרטניים נוטים לצבור PBS בתוך 1-2 h לאחר טריפסיניזציה, ולכן, צריך להיות מוכן מיד לפני ההזרקה. במידת הצורך, תאים ניתן resuspended מעת לעת באמצעות מזרק 1 מ"ל המשמש זריקות (ללא מחט borosilicate).
  5. אם סתימת תאים נצפתה בתוך נימי, להסיר את נימי, להשעות מחדש את התאים, ולהחליף אותו עם נימי חדש. השתמש בוכנה לדחוף החוצה כל בועות. אם לא נצפו סתימת תאים או בועות, המשך לשלב הבא.
  6. הסר את מכסה הכיסוי והעביר את העובר מתחת לסטריאוסקופ. זהה את הווריד המתאים להיות מוזרק על פני השטח CAM. ורידים ועורקים יוצרים את הרשת המורכבת בתוך רקמת CAM(איור 2C). ורידים נבדלים על ידי צבע אדום בהיר יותר כי הם נושאים דם עשיר בחמצן לעובר.
    הערה: עבור מניפולציה כללית של עוברים, הזרקת תאים סרטניים וקטע מושבה גרורתית, השתמש סטריומיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במטרות 0.8x ו- 1.5x ו-10x שעונים להדמיה. מיקרוסקופ פחות מתקדם יכול לשמש בהצלחה גם עבור הליכים אלה, בהתאם לרמת החוויה של המשתמשים. הקוראים יכולים לפנות למחברים לקבלת המלצות מפורטות יותר.
  7. מצא את הווריד האידיאלי להזריק תאים אשר בדרך כלל רק מעט רחב יותר (10-20%) מאשר הקוטר של קצה מחט borosilicate וממוקם באמצע הדרך בין העובר לקיר צלחת שקילה. בדרך כלל קל יותר להזריק בנקודה הסמוכה לתפרות הווריד.
    הערה: הזרקה לתוך וריד גדול יותר עשוי להיראות קל יותר אבל יוביל דימום מוגזם וירידה בהישרדות העובר.
  8. לחץ על קצה המחט על דופן כלי הדם והפעל לחץ עדין באותו כיוון כמו זרימת הדם. במידת הצורך, השתמש צמר גפן (מוחזק ביד השנייה) כדי לעזור לעגן או לייצב את כלי כי הוא מוזרק.
  9. מדכאים בעדינות את בוכנה המזרק. אפשר לדמיין זריקה מוצלחת על ידי התבוננות "ניקוי" של כלי הדם כאשר השעיית תא הסרטן נכנס לזרם הדם.
  10. המשך לדכא את בוכנה המזרק במשך 2-10 s עד נפח ההשעיה הרצוי מוזרק לתוך זרם הדם של הווריד. כל יחד הזרקה של עובר יחיד עשוי לדרוש 1-10 דקות בהתאם לרמת החוויה של המשתמש. אם דימום מוגזם או הצטברות נוזל ברור מופיע באתר ההזרקה, להשליך את העובר.
    הערה: קל "להזריק יתר על המידה" עובר. השיקול הכללי שיש לזכור הוא כי מושבות גרורתיות לא צריך לגעת זה בזה לאחר תקופת צמיחה 4-5 ימים. באופן אידיאלי ~ 5-10% של נימי וריד CAM מסוף צריך תאים משותקים בהם לאחר זריקה מוצלחת (איור 2D,E). כפי שהוזכר בשלב 2, ניתן להשתמש בטווח ריכוז תאים (0.5 x 106 - 1.0 x 106 תאים/מ"ל). ריכוזים נמוכים יותר ידרשו זמן הזרקה ארוך יותר אך יקטין את סתימת המחט. ריכוזים גבוהים יותר ידרשו זמני הזרקה קצרים יותר אך יגדילו את סתימת המחט. מומלץ לנסות כמה ריכוזים כדי למצוא את אחד כי הוא נוח ביותר עבור מפעיל. בדרך כלל, ריכוז גבוה יותר (1.0 x 106 תאים/מ"ל) עדיף להפחית את זמן ההזרקה.
  11. הסר את המחט מן CAM בעדינות לטבול את אתר ההזרקה עם צמר גפן כדי להסיר כל דם או תאים סרטניים עודפים.
  12. מכסים את העובר בצלחת השקילה במכסה ומחזירים את עובר העוף המוזרק לאינקובטור.
  13. חזור על ההליך עם העובר הבא עד שכל העוברים מוזרקים.

4. תחזוקת העובר במהלך צמיחת המושבה גרורתית

  1. תבדוק חזותית את העוברים. אם יש כאלה שמתים, ו/או מזוהמים בחיידקים או עובש, מוציאים אותם מהאינקובטור, אז מקללים אוטומטית ומשליכים אותם בהתאם לנהלי סילוק המעבדה.
    הערה: מומלץ כי עוברים נבדקים כל יומיים (ימים 1, 3, 5 לאחר הזרקת תאים לאחר סרטן) לצמיחת המושבה גרורתית. הימנע הזזת העוברים מוזרק שלא לצורך שכן הוא עלול לגרום נזק לעובר ו /או מוות.
  2. אם תאים מציגים צמיחת יתר (מושבות גרורתיות חופפות זו לזו) או התפלגות לא אחידה בתוך רקמת CAM (מושבות גרורתיות הממוקמות באזור משנה קטן של משטח CAM) הסר את העובר מהניסוי. המת חסד עוברים שהושלכו על ידי הקפאה ב -20 °C (או שיטה מאושרת אחרת) מיד לאחר הסרת הניסוי. מספר התאים גרורתיים קיימא בתוך רקמת CAM יקטן בתחילה (ימים 1-2) ולאחר מכן להגדיל (ימים 2-5).
    הערה: עוברים מסוימים עשויים "לדחות" את התאים הסרטניים, כלומר, כל התאים הסרטניים ייעלמו מרקמת CAM. יש להסיר את העוברים האלה מהניסוי. בדרך כלל, מושבות תאים סרטניים ניתן לראות דרך המכסה השקוף תחת מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי מבלי לפתוח את צלחת השקילה.
  3. ודא מושבות גרורתיות מופיעות אחידות בצורתן (1-3 הימים הראשונים לאחר ההזרקה). זהה מושבות גרורתיות פולשניות או לא פולשניות בימים 4-5 לאחר הזרקה (ראה סעיף 5 לקבלת פרטים נוספים).

5. בידוד מושבות גרורתיות

  1. ביום 5 לאחר הזרקה להסיר עוברים מן האינקובטור ולבדוק את CAMs העובר עבור התפלגות מושבה גרורתית. זהה את העוברים עם התפלגות מושבה אחידה שבה מושבות קומפקטיות (או פולשניות מדי) קיימות.
    הערה: תהליך פולחן עוברי עוף אינו סטרילי, ולכן, כל שלבי ההקרנה חייב להתבצע בתנאים נקיים מאוד כדי למנוע זיהום תרבות רקמות בעתיד. זיהום זה די נדיר וניתן להימנע בקלות על ידי לבישת כפפות ומסכה ושימוש בכלים סטריליים בלבד במהלך הזרקת תאים והליכי בידוד המושבה. מומלץ לבדוק עוברים בזה אחר זה כדי להקטין את חשיפתם לטמפרטורת המעבדה התת-סביבתית ולמנוע זיהום.
  2. אתר את המושבה גרורתית של עניין. מושבה קומפקטית יכולה להיות מתוארת כאחת עם רוב התאים הסרטניים הממוקמים בתוך אזור מוגבל ברקמת CAM (תאים מופיעים "מגובשיים יחד"). מושבה פולשנית יכולה להיות מתוארת כמושבה שבה תאים סרטניים "מתפזרים" ברקמת CAM(איור 3A,B).
    הערה: "דחיסות" של המושבה גרורתית יכול להיות מוסבר או על ידי עיכוב של פלישת תאים סרטניים, עיכוב של התפשטות תאים סרטניים, או שניהם. יש לשים לב לכל התרחישים ולבודד את מושבות המגע(איור 3א,B). סטריאוטירוסקופ פלואורסצנטי פשוט יכול לשמש כדי להפלות בין פנוטיפים מושבה גרורתית קומפקטית פולשנית.
  3. תחת מיקרוסקופ הניתוח משוך בעדינות את רקמת CAM המכילה את המושבה גרורתית של עניין כלפי מעלה באמצעות מלקחיים עדינים (איור 3C).
  4. לחתוך את רקמת CAM המכילה את המושבה גרורתית באמצעות מספריים כירורגיים.
  5. העבר את רקמת CAM המכילה את המושבה גרורתית לתוך צינור ריק, סטרילי 1.5 מ"ל (על קרח) ולסגור את מכסה הצינור.
    הערה: מושבות מבודדות ניתן לשמור על קרח עד 3 שעות ללא אובדן הכדאיות.
  6. חזור על הליך כריתת עד שכל המושבות מעניינים נאספים לצינורות נפרדים. כדי למנוע סבל של בעלי חיים, אין לסלק יותר מ-2-3 מושבות מעובר אחד. להרדים עוברים על ידי הקפאה ב -20 °C (או שיטה מאושרת אחרת) מיד לאחר כריתת המושבה.
  7. טחון בעדינות את רקמת CAM בצינור microcentrifuge באמצעות מחט סטרילית 18 מד. השתמש במחט נפרדת עבור כל מושבה.
  8. יש להוסיף 100 מיקרול של תמיסת קולגנאז 1x ולדגירה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
  9. ספין את התאים ורקמת CAM ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת הסביבה.
  10. שאפו את תמיסת הקולגנאז ותאים משופצים מחדש במדיה מלאה המשמשת לקו העניין של התא.
    הערה: בדרך כלל רקמת CAM אינה מנותקת לחלוטין לאחר טיפול קולגנאז ותאים סרטניים יתרבו תחילה בתוך חתיכות רקמת CAM ורק מאוחר יותר נודדים לצלחת תרבית הרקמות.
  11. לסובב את התאים ואת רקמת CAM שוב ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת הסביבה.
  12. תאים resuspend חתיכות רקמת CAM ב 1 מ"ל של מדיה מלאה בתוספת גורם בחירה (אם בכלל), ולאחר מכן להעביר יחיד 12 צלחת תרבית רקמות היטב.
    הערה: פיברובלסטים עוף CAM עשוי להתמיד בתרבית הרקמות עבור מעברים מרובים מעכבים התרחבות כלנית. היכולת להרחיב את המושבות גרורתיות בנוכחות גורם בחירה (כלומר, אם וקטור ששימש לעיבוד תאים סרטניים פלואורסצנטי גם מקודד גן עמידות לאנטיביוטיקה של יונקים) עשוי להאיץ מאוד את התפשטות הכליה. ניסוי עקומת להרוג צריך להתבצע לפני ההקרנה כדי להבטיח כי ריכוז נכון של אנטיביוטיקה משמש.
  13. במשך 1-3 שבועות הבאים לפקח על תאים סרטניים מדי יום לצמיחה וזיהום.
  14. כאשר תאים מגיעים ל-70-80% מהמפגש מעביר תאים לצלחת תרבית גדולה יותר.
    הערה: מומלץ להרחיב תאים עד לפחות שני בקבוקונים קריוגניים של כל שיבוט ניתן להקפיא. שמירה על כמויות גדולות של תרבית רקמות יכול להיות מייגע ומיותר.
  15. המשך לרצף או לסיבוב הבחירה הבא ברגע שיגיעו מספיק מספרי תאים סרטניים. בדרך כלל, 1 x 106 של תאים סרטניים מספיקים לטכניקות רצף מודרניות בעלות תפוקה גבוהה.
  16. המשך לחזרה ושיבוט הדמיה וכימות של קומפקטיות המושבה או מגע כלי דם תאים סרטניים (איור 2A). לחלופין, המשך לרצף תפוקה גבוה או חזור על בחירת המושבה.
    הערה: כדי להקטין את מספר החיוביות השגויות מומלץ לפחות שני סבבי בחירה. שתי גישות הועסקו בהצלחה. 1) להרחיב כל שיבוט ולהיבחר מחדש בנפרד כדי לאשר את פנוטיפ המושבה. 2) מערבבים את כל השיבוטים המורחבים ביחס 1:1 כל אחד, חוזרים כתערובת וחוזרים על מחזור הבחירה.

6. הזרקת לציטין מתויג פלואורסצנטי לתוך vasculature CAM.

  1. זהה את הווריד שיש להזריק. קל יותר להשתמש באותו אתר הזרקה עבור lectin ששימש להזרקת תאים סרטניים.
  2. לדלל תמיסת ציר לצין פלואורסצנטי (5 מ"ג/ מ"ל) 50-100x עם 1x PBS ולהעמיס אותו לתוך אותו מנגנון הזרקה המשמש להזרקת תאים סרטניים.
    הערה: כמות הלצין שיש להזריק (בדרך כלל 20-100 μL) עבור הדמיית כלי הדם תלויה ברגישות מיקרוסקופ ויש לקבוע באופן ניסיוני לפני ההקרנה.
  3. הזרקת לציטין באותה טכניקה כמו הזרקת תאים סרטניים (ראה שלבים 3.6.-3.10.).
  4. לאחר הזרקת הלטין, מניחים את העובר לתוך האינקובטור כדי להתאושש במשך 5 דקות. הזריקו רק עובר אחד בכל פעם ומיד לפני ההדמיה של העובר.
    הערה. עוברים בני 12 ימים ומעלה בדרך כלל מתאוששים היטב מזריקות הלציטין וניתן להחזירם עם לציטין שוב למחרת להדמיה רציפה. עוברים צעירים רגישים יותר ועשויים להציג קרישת דם.

7. הדמיה של מגעים בין כלי דם לתאים סרטניים

  1. הגדר את מארז המיקרוסקופ המוסדר בטמפרטורה ל- 37 °C (7°F) כ-6 שעות לפני ההדמיה. פעולה זו תייצב את טמפרטורת המיקרוסקופ ותסייע למזער את הסחף XYZ במהלך ההדמיה.
    הערה. תא הדמיה מיוחד של עובר עוף9,10,11,12,13 שימש לניסוי זה. מיקרוסקופ ניתוח פלואורסצנטי פשוט יכול לשמש עבור כל השלבים החל הזרקת תאים סרטניים כדי בחירת שיבוט ו reinjection שיבוט, והערכה של קומפקטיות המושבה. מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בתא הדמיה נחוץ להדמיה וכימות של מגעים בין כלי דם לתאים סרטניים. אין צורך בחימום עד שעה אחת ובדרך כלל עוברים שורדים לפחות שני מפגשי הדמיה רציפים ללא השפעה על הכדאיות שלהם.
  2. ודא כי העדשה האובייקטיבית הדרושה (עדשה אובייקטיבית טבילת מים 20x או 25x מומלץ) הותקנה.
  3. יש למרוח שכבה דקה של שומן ואקום על החלק התחתון של מכסה תא ההדמיה כדי ליצור אטם מאובטח עם כיסוי.
  4. מניחים בעדינות כיסוי למכסה ומנגבים כל עודף שומן ואקום.
  5. מוציאים את העובר המוזרק ללצטין מהחממה וחותכים את חישוקי צלחת השקילה במידת הצורך.
  6. מקם את העובר בתא ההדמיה עם כיסוי הוריד ישירות על האזור של CAM שבו מושבות גרורתיות של עניין ממוקמים. מורידים לאט את המכסה על העובר עד שהכיסוי יוצר קשר עם המצלמה. הדקו את הברגים כדי לאבטח את המכסה במקום, ודאו שהמכסה מופל ושהכיסוי אינו מפעיל לחץ כלפי מטה על ה-CAM.
  7. לרכוש תמונות של מושבות מרובות, אקראיות מקבוצות שליטה וניסוי (10-20) ממספר עוברים (5-10).
    הערה. מומלץ להשיג ערימות תלת-ממד אקראיות (1-5um Z-שלבים; טווח של 50-100um; פי 25) מכל שדה.
  8. השתמש באפשרות תפירת שדה בתוכנת רכישת המיקרוסקופ אם היא זמינה. מאחר שתמונות המשמשות לכימות לא יהיו באיכות הפרסום, השתמש במצבי רכישה מהירה כגון סריקת מהדהוד אם הן זמינות. השתמש 25x המטרה ותפירה 3 x 3 עם 5-10 מיקרומטר Z-שלב, 100 מיקרומטר טווח כולל. תמונה לפחות 100 תאים (~ 20 מושבות) לכל תנאי.

8. כימות מגעים עם כלי דם של תאים סרטניים

  1. פתח את קובץ ה- 3D כערימת Z באמצעות התוכנה הדרושה.
    הערה. תוכנה מיוחדת חייבת לשמש כדי לרכוש ולנתח תמונות ברזולוציה גבוהה על מנת לכמת מגע בין כלי דם תאים סרטניים. מספר חבילות תוכנה המסוגלות לנתח תמונה תלת-ממדית זמינות. נא עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים נוספים.
  2. אם התרחשה תנועת XY משמעותית במהלך רכישת התמונה, יישר את מחסנית Z באמצעות התוסף ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
  3. אתר את התא (ים) של עניין.
  4. גלול בתמונת XYZ בכיוון Z וזיהה את החלק האופטי המכיל את האורך המרבי של מגע כלי הדם של התא הסרטני עבור תא העניין (איור 2E).
  5. מדוד את מגע כלי הדם של התא הסרטן באמצעות "פונקציית מדידת האורך הידנית".
  6. הזן את המדידות בחבילת תוכנת הנתונים המשמשת לניתוח סטטיסטי.
    הערה: היכולת של תאים סרטניים להיצמד לכלי הדם ניתן למדוד או כאורך המגעים של כלי דם תאים-דם סרטניים או אחוז התא במגע עם vasculature עבור שיבוט תאים סרטניים מסוימים (או שניהם).
  7. המשך לתא העניין הבא.
  8. נתח את הנתונים לקבלת משמעות סטטיסטית המשווה בין שיבוט מוטציות (ים) ושליטה על ערכות נתונים.

9. כימות קומפקטיות המושבה

  1. הכנס מחדש את התאים מהשכפול המורחב באותה טכניקה כמו בשלב 2.
  2. חמישה ימים לאחר הזרקה לרכוש תמונות של 10-50 מושבות גרורתיות אקראיות עבור כל שיבוט.
    הערה: אין צורך בתמונות באיכות גבוהה לכימות קומפקטיות של המושבה גרורתית. תמונות מיקרוסקופ מונוכרומטיות (הגדלה פי 10) מספיקות. יש לשים לב לבהירות התמונה (יש לראות את רוב התאים במושבה) וניגודיות (הבדל בין תא אחד או שניים).
  3. בודד דיגיטלית את תמונת המושבה (ראה איור 2C,D) והמשיך לכימות קומפקטיות המושבה באמצעות מודול כימות קומפקטיות המושבה העצמאי או ניקוד עיוור13.
  4. המשך למושבה הבאה של עניין.
  5. נתח את הנתונים לקבלת משמעות סטטיסטית המשווה בין ערכות נתונים של שיבוט מוטציות ושליטה (כלומר לטרוף shRNA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הזרקת תאים סרטניים נחשבת למוצלחת אם רוב התאים התקועים בנימים הם בודדים וממוקמים בהבדל משמעותי זה מזה (~ 0.05-0.1 ס"מ) כך שהמושבות לא יחפפו לאחר 5-6 ימים של תקופת הדגירה (איור 3A). ההזרקה לא הצליחה אם ניתן לראות הצטברות של תאים סרטניים ברוב הנימים, עוברים המציגים זאת צריכים להיות מושלכים (איור 2E). מספר משמעותי של תאים סרטניים מוזרקים נספו בתוך 24 שעות של הזרקה מה שהופך כמה עוברים נראה לדחות את כל התאים הסרטניים. הישרדות תאים סרטנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מהירה המבוססת על פרוטוקול סינון תוך-וינטלי שניתן להשתמש בו עבור יישומים חשובים כגון מסכים גנטיים או מועמדים לתרופה. תאים סרטניים שהועברו עם ספרייה גנטית של עניין או שהודבקו עם מבני ביטוי בודדים ניתן לסנן במהירות ולכומת כמו פנוטיפ של עניין באמצעות מודל זה אפרוח CAM. מאחר שפרוטוקולי התמרה או טרנס-זיהום משתנים באופן משמעותי, בהתאם לסוג הספריה, הם אינם נכללים בהליך זה. מושבות גרורתיות רלוונטיות פנוטיפיות נקטעות מה- CAM, מורחבות, ודנ"א מבודד לרצף תפוקה גבוה כדי לזהות את מבנה הביטוי של ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מכון המחקר הקנדי למלחמה בסרטן גרנט #702849 ל- JDL ו- KS. ד"ר לואיס מחזיקה בכיסא פרנק וקרלה סוגיוני בחקר סרטן הערמונית בתמיכת הקרן לסרטן אלברטה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מזרקים חד פעמיים 1 מ"לBDBD309659
צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"ל.קורנינגCLS430791-500EA
18 מד x 1 1/2  מחט דיוק BDBDBD305196אנו משתמשים ב-1.2 מ"מ x 40 מ"מ, ניתן להשתמש במחטים קצרות יותר אם מעדיפים
תמיסת טריפסין 2.5%מקורות רבים זמינים
סרטן שד עכבר 4T1ATCCCRL-2539
B16F10 קו תאי מלנומה של עכברATCCCRL-6475
צנטריפוגה ספסלית.מקורות רבים זמיניםכל צנטריפוגה תואמת TC שניתן להשתמש בה כדי לסובב את התאים מתאימה
עגול, 22 מ"מ.פישר סיינטיפיק12-545-101
קולגנאזסיגמאC0130-100MG
מיקרוסקופצמר גפן של ניקון A1r
רבים זמיניםיש לעקר לפני השימוש
בתרבית מדיה המתאימה לקווי התאים המשמשיםמקורות רבים זמינים אנו מגדליםקווי תאים HT1080, HEp3 ו- b16 ב- DMEM, 10% מדיה FBS
חממת ביציםמקורות רבים זמיניםמודל מדויק הדרוש תלוי בקנה המידה של המסך. המקורות הזמינים הם MGF Company Inc., סוואנה, ג'ורג'יה, או  Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA
eppendor tubes, 1.5 מ"לSigmaT4816-250EA
ביצי לגהורן לבנות מופרותכל ספק
מלקחיים עדיניםמקורות רבים זמיניםחייבים להיות מעוקרים לפני השימוש
בהמוציטומטר Millipore-SigmaMDH-4N1-50PK
HT1080 קו תאי פיברוסרקומה אנושיתATCCCCL-121
תוכנתאנו משתמשים ב-Nikon Elements
Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) מצומד עם פלואורסצאין או רודמין Vector LaboratoriesRL-1042, FL-1041מלאי מדולל (5 מ"ג/מ"ל) פי 50-100 בהתאם לחוש המיקרוסקופ. חייב להיות בצבע שונה מצבע קו התאים המשמש להקרנת
MDA-MB-468 סרטן שד אנושיATCCHTB-132
PBS (1x)מקורות רבים זמינים
כלי שקלול פלסטיק SimportCA11006-614מידות 78x78x25 מ"מ; מקורות רבים אחרים זמינים
מספריים כירורגיים קטנים קיימיםשיש לעקר לפני השימוש
צינורות נימי זכוכית נתרן בורוסיליקט, קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.58 מ"מ, אורך 10 ס"מ Sutter InstrumentBF100-58-10
צלחות פטרי מרובעות (משמשות כמכסים לכלי השקלול).  VWR CA25378-115 המידות הן 100x100x15 מ"מ; קיימים מקורות רבים אחרים
מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו אנו משתמשים בצינורות מעבדה Zeiss Lumar v12
Tygon R-3603Cole-ParmerAAC000011/32 בקוטר פנימי, 3/32 אינץ' קוטר חיצוני, 1/32 אינץ' עובי דופן
U-118 MG גליובלסטומה אנושיתATCCHTB-15
U-87 MG גליובלסטומה אנושיתATCCHTB-14
חולץ פיפטה אנכי מקורות רבים זמיניםאנו משתמשים במכשירי דיוויד קופף, טוג'ונגה, קליפורניה; דגם 720
כיסוי קונפוקלי אנו משתמשים בספוגיות מקורות מקומי ניתוח תמונה מקורות רבים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
  3. Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), London, England. 1742-1757 (2007).
  4. Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
  5. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  6. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  7. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  8. Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
  9. Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
  10. Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
  11. Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
  12. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815(2011).
  13. Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343(2018).
  14. Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
  15. Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D. The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. , Springer. New York. 27-37 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Intravital ImagingshRNAVasculature Co Option

מאמרים קשורים