זוהי שיטה יעילה לסנן מדכאים או נהגים של גרורות סרטן. תאים, המועברים בספריית ביטויים, מוזרקים לתוך כלי הקרום chorioallantoic עוף כדי ליצור מושבות גרורתיות. מושבות שיש להם ירידה או פולשניות מוגברת הם excised, מורחב, reinjected כדי לאשר פנוטיפ שלהם, ולבסוף, מנותח באמצעות רצף תפוקה גבוהה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גילוי של רגולטורים גרורתיים באמצעות מודל ממברנה צ'יק תוך-ויאטואי מהיר וכמותי
במאמר זה
סיכום
תקציר
ההתקדמות האחרונה בחקר הסרטן המחישה את האופי המורכב ביותר של גרורות סרטן. גנים או רשתות גנים רבים נמצאו מעורבים בוויסות דיפרנציאלי של גנים מפלים גרורתיים וסרטן ומוצרי גנים התלויים בסוג הסרטן, ברקמה ובמאפייני המטופלים הבודדים. אלה מייצגים יעדים פוטנציאליים חשובים לטיפולים גנטיים וגישות לרפואה מותאמת אישית. פיתוח פלטפורמות סינון מהירות חיוני לזיהוי מטרות גנטיות אלה.
קרום chorioallantoic אפרוח (CAM) הוא קרום עשיר מאוד וסקולני, קולגן הממוקם מתחת קליפת הביצה המאפשר חילופי גז בעובר המתפתח. בשל המיקום וכלי הדם של CAM, פיתחנו אותו כמודל גרורות סרטן אנושי תוך-וינטלי המאפשר קסנוגרפטציה של תאים סרטניים אנושיים חזקים והדמיה בזמן אמת של אינטראקציות תאים סרטניים עם מטריצה עשירה בקולגן vasculature.
באמצעות מודל זה, פלטפורמת הקרנה כמותית תוכננה לזיהוי של נהגים חדשים או מדכאים של גרורות סרטן. העברנו מאגר של תאי סרטן HEp3 ראש וצוואר עם ספריית גנים שלמה של גנום אנושי shRNA, ואז הזרקנו את התאים, בצפיפות נמוכה, לתוך vasculature CAM. התאים התרבו ויצרו מושבות תאים חד-גידוליים. מושבות בודדות שלא הצליחו לפלוש לרקמת CAM נראו כפנוטיפ מושבה קומפקטי ונקראו לזיהוי של shRNA transduced הנוכחי בתאים. תמונות של מושבות בודדות הוערכו על ה פולשניות שלהן. סבבים מרובים של בחירות בוצעו כדי להקטין את שיעור החיוביות השגויות. שיבוטים בודדים, מבודדים של תאים סרטניים או שיבוטים מהונדסים חדשים המבטאים גנים מעניינים היו נתונים לבדיקת היווצרות גידול ראשונית או ניתוח אופציות משותפות של כלי התא הסרטני. לסיכום אנו מציגים פלטפורמת סינון מהירה המאפשרת זיהוי יעד אנטי גרורתי וניתוח תוך-וינטלי של מפל אירועים דינמי ומורכב.
מבוא
גרורות הוא הגורם העיקרי למוות של חולה סרטן1,2,3. תאים סרטניים גרורתיים משתמשים במסלולי איתות ברורים, התלויים בסוג הסרטן, לאורך חמשת השלבים של המפל גרורתי: פלישה מקומית, תוך-פולשניות, הישרדות במחזור הדם, הפזרנות והרחבת המושבה באתרים גרורתיים מרוחקים. ההבנה הנוכחית של תהליך גרורתי זה מצביעה על כך שיש שני שלבים צוואר בקבוק, אחד הוא פלישה כיוונית של התא הסרטני מן הגידול העיקרי, והשני הוא הקמת הנגע גרורתי האתר הרחוק4,5,6. שני השלבים דורשים תאים סרטניים לקיים אינטראקציה פעילה עם קולגן vasc....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הניסויים בוצעו בהתאם לתקנות ולהנחיות של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אלברטה. עוברים של עופות אינם נחשבים לבעלי חיים על ידי מכוני מחקר רבים ואין צורך בפרוטוקולים של בעלי חיים. עם זאת, זוהי השקפה מקובלת כי עוברים עופות יכולים להרגיש כאב, ולכן, יש להתייחס בצורה אנושית ככל האפשר. יש ליצור קשר עם הרשות המקומית לחקר בעלי חיים לפני תחילת כל עבודת מחקר כדי להבטיח כי תקנות נאותות נשמרות.
1. תרבות הביצים ללא קליפה
- לרכוש ביצי עוף מופרות מהספק המקומי. ניסוי זה משתמש גזע עוף לגהורן לבן; עם זאת, גזעים אחרים יכולים לשמש גם כן.
הערה: מומלץ לרכוש 10% יותר ביצים מהנדרש במקרה שחלק מהעוברים נפגעים במהלך הפיצוח ולא ניתן לה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הזרקת תאים סרטניים נחשבת למוצלחת אם רוב התאים התקועים בנימים הם בודדים וממוקמים בהבדל משמעותי זה מזה (~ 0.05-0.1 ס"מ) כך שהמושבות לא יחפפו לאחר 5-6 ימים של תקופת הדגירה (איור 3A). ההזרקה לא הצליחה אם ניתן לראות הצטברות של תאים סרטניים ברוב הנימים, עוברים המציגים זאת צריכים להיות מושלכים (איור 2E). מספר משמעותי של תאים סרטניים מוזרקים נספו בתוך 24 שעות של הזרקה מה שהופך כמה עוברים נראה לדחות את כל התאים הסרטניים. הישרדות תאים סרטנ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מתארים מיקרוסקופיה פלואורסצנטית מהירה המבוססת על פרוטוקול סינון תוך-וינטלי שניתן להשתמש בו עבור יישומים חשובים כגון מסכים גנטיים או מועמדים לתרופה. תאים סרטניים שהועברו עם ספרייה גנטית של עניין או שהודבקו עם מבני ביטוי בודדים ניתן לסנן במהירות ולכומת כמו פנוטיפ של עניין באמצעות מודל זה אפרוח CAM. מאחר שפרוטוקולי התמרה או טרנס-זיהום משתנים באופן משמעותי, בהתאם לסוג הספריה, הם אינם נכללים בהליך זה. מושבות גרורתיות רלוונטיות פנוטיפיות נקטעות מה- CAM, מורחבות, ודנ"א מבודד לרצף תפוקה גבוה כדי לזהות את מבנה הביטוי של ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מכון המחקר הקנדי למלחמה בסרטן גרנט #702849 ל- JDL ו- KS. ד"ר לואיס מחזיקה בכיסא פרנק וקרלה סוגיוני בחקר סרטן הערמונית בתמיכת הקרן לסרטן אלברטה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| מזרקים חד פעמיים 1 מ"ל | BD | BD309659 | |
| צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"ל. | קורנינג | CLS430791-500EA | |
| 18 מד x 1 1/2 מחט דיוק BD | BD | BD305196 | אנו משתמשים ב-1.2 מ"מ x 40 מ"מ, ניתן להשתמש במחטים קצרות יותר אם מעדיפים |
| תמיסת טריפסין 2.5% | מקורות רבים זמינים | ||
| סרטן שד עכבר 4T1 | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 קו תאי מלנומה של עכבר | ATCC | CRL-6475 | |
| צנטריפוגה ספסלית. | מקורות רבים זמינים | כל צנטריפוגה תואמת TC שניתן להשתמש בה כדי לסובב את התאים מתאימה | |
| עגול, 22 מ"מ. | פישר סיינטיפיק | 12-545-101 | |
| קולגנאז | סיגמא | C0130-100MG | |
| מיקרוסקופ | צמר גפן של ניקון A1r | ||
| רבים זמינים | יש לעקר לפני השימוש | ||
| בתרבית מדיה המתאימה לקווי התאים המשמשים | מקורות רבים זמינים אנו מגדלים | קווי תאים HT1080, HEp3 ו- b16 ב- DMEM, 10% מדיה FBS | |
| חממת ביצים | מקורות רבים זמינים | מודל מדויק הדרוש תלוי בקנה המידה של המסך. המקורות הזמינים הם MGF Company Inc., סוואנה, ג'ורג'יה, או Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubes, 1.5 מ"ל | Sigma | T4816-250EA | |
| ביצי לגהורן לבנות מופרות | כל ספק | ||
| מלקחיים עדינים | מקורות רבים זמינים | חייבים להיות מעוקרים לפני השימוש | |
| בהמוציטומטר | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 קו תאי פיברוסרקומה אנושית | ATCC | CCL-121 | |
| תוכנת | אנו משתמשים ב-Nikon Elements | ||
| Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) מצומד עם פלואורסצאין או רודמין | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | מלאי מדולל (5 מ"ג/מ"ל) פי 50-100 בהתאם לחוש המיקרוסקופ. חייב להיות בצבע שונה מצבע קו התאים המשמש להקרנת |
| MDA-MB-468 סרטן שד אנושי | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | מקורות רבים זמינים | ||
| כלי שקלול פלסטיק | Simport | CA11006-614 | מידות 78x78x25 מ"מ; מקורות רבים אחרים זמינים |
| מספריים כירורגיים קטנים | קיימים | שיש לעקר לפני השימוש | |
| צינורות נימי זכוכית נתרן בורוסיליקט, קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.58 מ"מ, אורך 10 ס"מ | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| צלחות פטרי מרובעות (משמשות כמכסים לכלי השקלול). | VWR | CA25378-115 | המידות הן 100x100x15 מ"מ; קיימים מקורות רבים אחרים |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו | אנו משתמשים בצינורות מעבדה Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 בקוטר פנימי, 3/32 אינץ' קוטר חיצוני, 1/32 אינץ' עובי דופן |
| U-118 MG גליובלסטומה אנושית | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG גליובלסטומה אנושית | ATCC | HTB-14 | |
| חולץ פיפטה אנכי | מקורות רבים זמינים | אנו משתמשים במכשירי דיוויד קופף, טוג'ונגה, קליפורניה; דגם 720 |
מקורות
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
