Method Article

גישות הדמיה וניתוח תלת-ממדיות וארבעה מימדים לחקר התארכות צירית וסגמנטציה צירית של בעלי חוליות

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

 ,  ,  , 
1Instituto Gulbenkian de Ciência, 2Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 3NOVA School of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים כלים ושיטות חישוביות המאפשרים הדמיה וניתוח של נתוני תמונה תלת-ממדיים וארבעה מימדיים של עוברי עכבר בהקשר של התארכות צירית וסגמנטציה, המתקבלים על ידי טומוגרפיה של הקרנה אופטית טוטו, ועל ידי הדמיה חיה וכתם אימונופלואורסצנטי בהר שלם באמצעות מיקרוסקופיה רב-פוטונית.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סומיטוגנזה הוא סימן היכר של התפתחות עוברית חוליות. במשך שנים, חוקרים חקרו את התהליך הזה במגוון רחב של אורגניזמים באמצעות מגוון רחב של טכניקות המקיפות גישות ex vivo ו במבחנה. עם זאת, רוב המחקרים עדיין מסתמכים על ניתוח של נתוני הדמיה דו-ממדיים (דו-ממדיים), המגבילים הערכה נכונה של תהליך התפתחותי כמו הרחבה צירית וסומיטוגנזה המערבת אינטראקציות דינמיות מאוד במרחב תלת-ממדי מורכב. כאן אנו מתארים טכניקות המאפשרות רכישת הדמיה חיה של עכבר, עיבוד ערכת נתונים, הדמיה וניתוח בתלת-ממד וב-4D כדי לחקור את התאים (למשל, אבות עצביים) המעורבים בתהליכים התפתחותיים אלה. אנו מספקים גם פרוטוקול שלב אחר שלב לטומוגרפיה של הקרנה אופטית ומיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית בהרכבה שלמה בעוברי עכבר (מהכנה מדגמית לרכישת תמונה) ומציגים צינור שפיתחנו לעיבוד ולהדמיה של נתוני תמונה תלת-ממדית. אנו מרחיבים את השימוש בכמה מטכניקות אלה ומדגישים תכונות ספציפיות של תוכנות זמינות שונות (למשל, פיג'י / ImageJ, Drishti, Amira ו- Imaris) שניתן להשתמש בהן כדי לשפר את ההבנה הנוכחית שלנו של הרחבה צירית ויצירת somite (למשל, שחזורים תלת-ממדיים). בסך הכל, הטכניקות המתוארות כאן מדגישות את החשיבות של הדמיה וניתוח נתונים תלת-ממדיים בביולוגיה התפתחותית, ועשויות לסייע לחוקרים אחרים לטפל טוב יותר בנתוני תמונה תלת-ממדית ודו-ממדית בהקשר של הרחבה צירית וסגמנטציה של בעלי חוליות. לבסוף, העבודה משתמשת גם בכלים חדשניים כדי להקל על הוראת התפתחות עוברית של בעלי חוליות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היווצרות ציר גוף חוליות היא תהליך מורכב ודינמי ביותר המתרחש במהלך התפתחות עוברית. בסוף גסטרולציה [בעכבר, סביב יום עוברי (E) 8.0], קבוצה של תאי אב אפיבלסט המכונה אבות נוירומסודרמליים (NMPs) הופכים לנהג מפתח של הרחבה צירית ברצף ראש לזנב, יצירת הצינור העצבי ורקמות mesodermal paraxial במהלך היווצרות הצוואר, תא המטען והזנב 1,2,2,3,4 . מעניין, העמדה כי NMPs אלה תופסים epiblast caudal נראה לשחק תפקיד מפתח בהחלטה של הבחנה לתוך mesoderm או neuroectoderm5. למרות שכרגע חסרה לנו טביעת אצבע מולקולרית מדויקת עבור NMPs, תאים אלה נחש....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ניסויים הקשורים בבעלי חיים עקבו אחר החקיקה הפורטוגזית (Portaria 1005/92) ואירופאית (הוראה 2010/63/EU) הנוגעת לדיור, גידול ורווחה. הפרויקט נבדק ואושר על ידי ועדת האתיקה של 'מכון גולבנקיאן דה Ciência' ועל ידי הישות הלאומית הפורטוגזית, 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (התייחסות רישיון: 014308).

1. הכנה מדגמית להדמיה תלת-ממדית ותלת-ממדית

הערה: כאן אנו מספקים תיאור מפורט על איך לנתח ולהכין עכבר E8.25 כדי E10.5 עוברים להדמיה חיה (1.1), E7.5 עד E11.5 עוברים עבור מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית הר שלם (1.2) ועוברים עבור טומוגרפיה הקרנה אופטית (1.3).

  1. הכנה לדוגמה להדמיה חיה
    1. ניתוח עובר עכבר והכ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות הייצוגיות המוצגות במאמר זה הן להדמיית החי והן להדמיית האימונופלואורסצנטית, התקבלו באמצעות מערכת דו-פוטונית, עם יעד מים של 20 × 1.0 NA, לייזר עירור המכוון ל-960 ננומטר, ו-GaAsP photodetectors (כמתואר בדיאס ואח' (2020)43. טומוגרפיה הקרנה אופטית נעשתה באמצעות סורק OPenT שנבנה בהתאמה אישית (כמתואר ב Gualda et al. (2013)28.

הדמיה חיה (ניתוח 4D)
ניתוח מייצג של פעילות הכתב LuVeLu בעוברי עכבר במהלך הארכה צירית, המתקבל על פי הפ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התארכות צירית וסגמנטציה הם שניים מהתהליכים המורכבים והדינמיים ביותר המתרחשים במהלך התפתחות עוברית של חוליות. השימוש בהדמיה תלת-ממדית ו-4D עם מעקב אחר תאים חד-תאיים הוחל, מזה זמן מה, כדי לחקור תהליכים אלה הן בעוברי זברה והן בעוברי עוף, אשר תנאי הנגישות והתרביות מאפשרים הדמיה מורכבת 19,44,44,45,46,47,48,49

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לאוליבייה Pourquié ואלכסנדר Aulehla על זן הכתב LuVeLu, מעבדת SunJin עבור מדגם הבדיקה RapiClear, הוגו Pereira על העזרה באמצעות BigStitcher, נונו Granjeiro על שעזר להקים את מנגנון ההדמיה החיה, מתקן בעלי החיים IGC וחברים בעבר ובהווה של מעבדת מאלו עבור הערות שימושיות ותמיכה במהלך עבודה זו.

אנו מודים על התמיכה הטכנית של מתקן ההדמיה המתקדם של IGC, הנתמך על ידי נציג המימון הפורטוגלי# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 ו- ref# PTDC/ BII-BTI/32375/2017, במימון משותף של תוכנית התפעול האזורית של Lisboa (Lisboa 2020), במסגרת הסכם השותפות של פורטוגל 2020, באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (FEDER) ו- Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FC....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
טמפרטורת ג'ל נמוכה של אגרוזסיגמאA9414משמש להרכבה של עוברים (למשל עבור OPT)
תוכנת אמירהכלי תוכנהתרמופישר-מסחרי
אנטי ברכיורי (פוליקלונל עיזים)מערכות R ו-DAF2085 RRID:AB_2200235לאימונופלואורסצנציה
אנטי-Sox2 (ארנב חד שבטי)Abcamab92494 RRID:AB_10585428עבור אימונופלואורסצנציה
אנטי-TBX6 (פוליקלונל עיזים)מערכות מו"פAF4744 RRID:AB_2200834לאימונופלואורסצנציה
אנטי-למינין111 (פוליקלונל ארנב)סיגמאL9393 RRID:AB_477163לאימונופלואורסצנציה
אנטי-עז 488 (פוליקלונל חמור)בדיקות מולקולריותA11055 RRID:AB_2534102לאימונופלואורסצנציה
אנטי-ארנב 568 (פוליקלונל חמור)תרמו-פישר   מדעיA10042 RRID:AB_2534017לאימונופלואורסצנציה
בנזיל אלכוהול (99+%)(כל)-משמש לניקוי עוברים (מרכיב של BABB)
בנזיל בנזואט (99+%)(כל)-משמש לניקוי עוברים (מרכיב של BABB)
אלבומין סרום בקרBiowestP6154לאימונופלואורסצנציה
כיסוי זכוכית כיסוי 20x20 מ"מ #0 (כל)-100um עבה
Coverglass 20x20 מ"מ #1(כל)-170um עובי
Coverglass 20x60 מ"מ #1.5(כל)-לשימוש כ " שקופיות"
DAPI (4',6-Diamidino-2- פנילינדול דיהידרוכלוריד)טכנולוגיות חייםD3571לאימונופלואורסצנציה
תוכנת Drishti(קוד פתוח)-כלי תוכנה חינמי
EDTASigmaED2SSלדה-מינרליזציה
תוכנת Fiji/ImageJ(קוד פתוח)-כלי תוכנה חינם
GlycineNZYtechMB01401עבור אימונופלואורסצנציה
תוכנת הויגנסכלי תוכנה הדמיה מדעית-מסחרית
HyClone מוגדר סרום בקר עובריGE Healthcare#HYCLSH30070.03להדמיה חיה
תמיסת מי חמצן 30Milipore1085971000לניקוי
תוכנת אימאריסBitplane / מכשירי אוקספורד-כלי תוכנה מסחרי
iSpacersSunJin Lab(משתנה)השתמש כמרווחים לתכשירים
L-גלוטמיןGibco#25030– 024למדיום הדמיה חי
גלוקוז נמוך DMEMGibco11054020למדיום הדמיה חי
M2 מדיוםסיגמאM7167לניתוח עוברים
מתנולVWRVWRC20847.307לשלבי התייבשות והתייבשות
מתיל סליצילאטסיגמאM6752משמש לניקוי עוברים
ParaformaldehydeSigmaP6148משמש בתמיסה לקיבוע עוברים
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמא#P0781למדיום הדמיה חי
PBS (תמיסת מלח חוצצת פוספט)BiowestL0615-500-RapiClear
SunJin LaboratoryRapiClear 1.52משמש לניקוי עוברים
תאי הכלאה של Secure-SeaSigmaC5474השתמש כמרווחים עבור תכשירים
תוכנת simLabכלי תוכנהמסחרי רך SimLab
שקופית, שקע זכוכית קעורה - 75x25 מ"מ(כל)-להרכבה של עוברים עבים.
Triton X-100SigmaT8787לאימונופלואורסצנציה
%

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
  2. Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vertebrate SomitogenesisAxial Elongation3D Visualization4D ImagingMouse EmbryosOptical Projection TomographyWhole Mount ImmunofluorescenceNeuromesodermal ProgenitorsTissue Clearing3D Reconstruction

Related Articles