Method Article

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

DOI:

10.3791/62088

⸱

May 22nd, 2021

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתפתחות התקינה של מוח היונקים מסתמכת על איזון עדין של התפשטות תאי גזע עצביים ובידול לסוגי תאים עצביים שונים. איזון זה נשלט היטב על ידי ביטוי גנים כי הוא מכוון היטב ברמות מרובות, כולל שעתוק, לאחר שעתוק ותרגום. בהקשר זה, גוף הולך וגדל של ראיות מדגיש תפקיד קריטי של רגולציה תרגום בתיאום החלטות גורל תאי גזע עצביים. שבר פוליזום הוא כלי רב עוצמה להערכת מצב תרגום mRNA הן ברמה הגלובלית והן ברמת הגנים האינדיבידואלית. כאן, אנו מציגים צינור פרופיל פוליזום בתוך הבית כדי להעריך יעילות תרגום בתאים מקליפת המוח המתפתחת של העכבר. אנו מתארים את הפרוטוקולים להכנת שיפוע סוכרוז, תמוגה לרקמות, ultracentrifugation וניתוח מבוסס שבר של מצב תרגום mRNA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך התפתחות המוח יונקים, תאי גזע עצביים להתרבות ולהבדיל כדי ליצור נוירונים גליה1,2 . ההפרעה של תהליך זה יכולה להוביל לשינויים במבנה המוח ובתפקוד, כפי שניתן לראות בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות3,4. ההתנהגות הנכונה של תאי גזע עצביים דורשת ביטוי מתוזמר של גנים ספציפיים5. בעוד שהשליטה האפיגנטית והתעתיקית של גנים אלה נחקרה באופן אינטנסיבי, הממצאים האחרונים מצביעים על כך שוויסות גנים ברמות אחרות תורם גם לתיאום התפשטות תאי גזע עצביים ובידול6,7,8

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל השימוש בבעלי חיים היה בפיקוח הוועדה לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת קלגרי. עכברי CD1 ששימשו לניסוי נרכשו מספק מסחרי.

1. הכנת פתרונות

הערה כדי למנוע השפלה RNA, לרסס שולחן עבודה וכל הציוד עם פתרון טיהור RNase. טיפים ללא RNase משמשים לניסוי. כל הפתרונות מוכנים במים נטולי RNase.

  1. הכן פתרון מלאי ציקלוהקסימיד (100 מ"ג / מ"ל) ב- DMSO ולאחסן ב -20 °C (70 °F).
  2. הכן פתרון מלאי סוכרוז 2.2 M על ידי הוספת 75.3 גרם של סוכרוז למים ללא RNase ומעלה את עוצמת הקול ל 100 מ"ל (להכנת שיפוע ~ 16). הפתרון יכול להישמר ב -20 °C (60 °F) לאחסון לטווח ארוך.
  3. הכן 10x פתרון מלח (1 M NaCl; 200 מ"מ Tris-HCl, pH 7.5; 5....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כהדגמה, ליסט קליפת המוח המכיל 75 מיקרוגרם RNA (מאוגד מ 8 עוברים) הופרד על ידי שיפוע סוכרוז ל 12 שברים. פסגות ספיגת UV ב-254 ננומטר זיהו שברים המכילים את יחידת המשנה 40S, יחידת משנה של 60S, מונוזום 80S ופוליזומים(איור 4A). ניתוח שברים לפי כתם מערבי עבור יחידת המשנה ריבוזומה גדולה, Rpl10 הראה את נוכחותו ב subunit 60S (שבר 3), מונוזום (שבר 4) ו polysomes (שברים 5-12) (איור 4B). לעומת זאת, חלבונים ציטופלזמיים Gapdh ו-Csde1 לא היו קשורים לריבוזומים אלא הועשרו בשברים .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרופיל פוליזום הוא טכניקה נפוצה ורבת עוצמה להערכת מצב התרגום הן בגן יחיד והן ברמות הגנום הרחבות14 . בדו"ח זה, אנו מציגים פרוטוקול של פרופיל פוליזום באמצעות פלטפורמה ביתית והיישום שלה כדי לנתח את קליפת העכבר המתפתחת. פלטפורמה חסכונית זו קלה להרכבה ולייצור שיפוע סוכרוז חזק וניתן לשחזור ופרופיל פוליזום ברגישות גבוהה.

ראוי לציין כי הכנת שיפוע סוכרוז עקבי ואיכותי היא קריטית כדי להשיג תוצאות פרופיל פוליזום לשחזור17. שינויים בנפח של 10-50% פתרונות סוכרו.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN/04246-2018 ל- G.Y.). G.Y. הוא קתדרת מחקר בקנדה. S.K. מומן על ידי מלגת בוגרי Mitacs Globalink ומלגת סטודנטים לתארים מתקדמים של ACHRI.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 מ"ל מיקרו צינורות ללא RNAAxygenMCT-150-C
10 ס"מ צלחתGreiner-Bio664160
1M MgCl2InvitrogenAM9530G
21-23G מחטBD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
30 מ"ל מזרקBD302832
קצה קהה מחטVWR20068-781
לוח לחםThorlabsMB2530 / M
ברומופנול כחולסיגמא115-39-9
CD1 עכברמעבדת צ'ארלס נהר
מלקחיים קצה מעוקלסיגמא#Z168785
CycloheximideSigma66-81-9
תוכנת רכישת נתונים TracerDAQמדידה מחשוב
ממירמדידה מחשובUSB-1208LS
Direct-zol RNA miniprep kitZymoR2070
Dithiothreitol (DTT)ביו-בייסיק12-03-3483
DMSOBioshop67-68-5
Dumont No.5 מלקחייםסיגמא#F6521
אספן שבריםBio-Radדגם 2110
HBSSWisent311-513-CL
מפעיל שלב ליניאריRattmmotorCBX1605-100A
בקרת לוציפראז RNAPromegaL4561
ערכת סינתזה cDNA גדיל ראשון של מקסימהThemo FisherM1681
מיניאטורי V-clampThorlabsVH1/M
לוח אב-טיפוס מסדרהמיני ThorlabsMSB7515/M
עמוד אופטי מסדרה מיניThorlabsMS2R/M
בסיס מחזיק עמוד מסדרה מיניThorlabsMBA1
NaClBio-basic7647-14-5
מדיה נוירו-בזאליתGibco21103-049
Ø 12.7 מ"מ אלומיניום פוסטThorlabsTRA150/M
ParafilmBemisPM992
PerfeCTa SYBR ירוק fastmixQuanta BioCA101414-274
פוספט חוצץ מלח (PBS)Wisent311-010-CL
PuromycinBioshop58-58-2
מהדק זווית ישרהThorlabsRA90/M
זווית ישרה ואוסלאש; 1/2 אינץ' ל-Ø 6 מ"מ מהדק פוסטThorlabsRA90TR/M
Rnase AWAYמוצרים ביולוגיים מולקולריים7002
טיפים ללא RNaseFrogga BioFT10, FT200, FT1000
RNase מים חופשייםWisent809-115-CL
RNasinPromegaN2111
סוגר דק בזווית ישרהThorlabsAB90B/M
קטן V-clampThorlabsVC1 / M
נתרן דאוקסיכולאטסיגמא302-95-4
נהג מנוע צעדSongHeTB6600
סוכרוזביושופ57501
SW 41 רוטור Tiבקמן קולטר331362
משאבת מזרקהרווארד מנגנון70-4500
משאבת מזרקהרווארד מנגנון70-4500
טריטון-X-100ביו-בסיסי9002-93-1
טריזולתרמופישר מדעי15596018
פירסר צינורברנדלBR-184
אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטרL8-70M
צינורות אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027
ערכת התחלה סופר פרויקט UNOElegooEL-KIT-003
צג UVBio-RadEM-1 Econo
תושבת אנכיתThorlabsVB01A/M
דיגיטלי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Polysome ProfilingTranslational RegulationMouse Brain DevelopmentSucrose GradientNeural Stem CellsmRNA TranslationUltracentrifugationFraction CollectionRibosomal SubunitsWestern Blot

Related Articles