מאמר שיטה

ייצור יעיל וניתן להרחבה של אסטרוציטים במוח התיכון הגחוני האנושי מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

DOI:

10.3791/62095

⸱

2 באוקטובר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה לשחזור של אסטרוציטים בתבנית המוח התיכון הגחוני מ-hiPSCs ופרוטוקולים לאפיונם להערכת פנוטיפ ותפקוד.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחלת פרקינסון, תפקוד לקוי מתקדם וניוון של נוירוני דופמין במוח התיכון הגחוני גורמים לתסמינים משני חיים. לניוון עצבי יש סיבות מגוונות בפרקינסון, כולל מנגנונים אוטונומיים שאינם תאים המתווכים על ידי אסטרוציטים. ברחבי מערכת העצבים המרכזית, אסטרוציטים חיוניים להישרדות ולתפקוד עצבי, מכיוון שהם שומרים על הומאוסטזיס מטבולי בסביבה העצבית. אסטרוציטים מקיימים אינטראקציה עם תאי החיסון של מערכת העצבים המרכזית, מיקרוגליה, כדי לווסת דלקת עצבית, הנצפית מהשלבים המוקדמים ביותר של פרקינסון, ויש לה השפעה ישירה על התקדמות הפתולוגיה שלה. במחלות עם אלמנט נוירו-דלקתי כרוני, כולל פרקינסון, אסטרוציטים רוכשים פנוטיפ נוירוטוקס, ובכך משפרים את הניוון העצבי. כתוצאה מכך, אסטרוציטים הם מטרה טיפולית פוטנציאלית להאטת או לעצירת מחלות, אך זה ידרוש הבנה מעמיקה יותר של תכונותיהם ותפקידיהם בפרקינסון. לכן יש צורך בדחיפות במודלים מדויקים של אסטרוציטים במוח התיכון הגחוני האנושי למחקר במבחנה.

פיתחנו פרוטוקול ליצירת תרביות בטוהר גבוה של אסטרוציטים ספציפיים למוח התיכון הגחוני (vmAstros) מ-hiPSCs שיכולים לשמש לחקר פרקינסון. ניתן לייצר vmAstros באופן שגרתי ממספר קווי hiPSC, ולבטא סמנים אסטרוציטים וגחוניים ספציפיים במוח האמצעי. פרוטוקול זה ניתן להרחבה, ולכן מתאים ליישומים בעלי תפוקה גבוהה, כולל לסינון תרופות. באופן מכריע, ה-hiPSC הנגזר-vmAstros מדגים מאפיינים אימונומודולטוריים האופייניים לעמיתיהם in vivo, ומאפשרים מחקרים מכניסטיים של איתות נוירו-דלקתי בפרקינסון.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחלת פרקינסון משפיעה על 2%-3% מהאנשים מעל גיל 65, מה שהופך אותה להפרעת התנועה הניוונית הנפוצה ביותר1. זה נגרם על ידי ניוון של נוירוני דופמין במוח התיכון הגחוני בתוך החומר השחור, וכתוצאה מכך תסמינים מוטוריים מתישים, כמו גם בעיות קוגניטיביות ופסיכיאטריות תכופות2. הפתולוגיה של פרקינסון מאופיינת על ידי אגרגטים של החלבון, α-synuclein, שהם רעילים לנוירונים וגורמים לתפקוד לקוי ולמותם 1,2,3. מכיוון שהנוירונים הדופמינרגיים הם האוכלוסייה המנוונת בפרקינסון, הם היו מוקד המחקר מבחינה היסטורית. עם זאת, ברור כי סוג תא אחר במוח, האסטרוציטים, מפגין גם הוא חריגות בפרקינסון, ומאמינים כי הוא תורם לניוון במודלים של פרקינסון 4,5,6,7.

אסטרוציטים הם אוכלוסיית תאים הטרוגנית שיכולה להשתנות הן פיזית והן תפקודית לפי הצורך. הם תומכים בתפקוד עצבי ובבריאות באמצעות שפע של מנגנונים, כולל אפנון של איתות עצבי, עיצוב ארכיטקטורה סינפטית ותמיכה טרופית באוכלוסיות עצביות באמצעות הפרשת גורמים ספציפיים 6,8,9,10. עם זאת, לאסטרוציטים יש גם תפקיד חיסוני משמעותי, חלק בלתי נפרד מהתפתחות והתפשטות דלקת עצבית10,11. דלקת עצבית נצפית במוחם של חולי פרקינסון, ולאחרונה הוכחה באופן משמעותי כמונעת את הופעת תסמיני הפרקינסון 12,13,14,15, ובכך תופסת את מרכז הבמה בחקר הפרקינסון.

ברמה התאית, אומרים שאסטרוציטים הופכים לתגובתיים בתגובה לפציעה, זיהום או מחלה, כניסיון להקל על הגנה עצבית 9,6,10,16. תגובתיות מתארת שינוי בפנוטיפ האסטרוציטים המאופיין בשינויים בביטוי גנים, הפרשה, מורפולוגיה ומנגנוני פינוי של פסולת תאים ותוצרי לוואי רעילים 9,10,11,17. שינוי תגובתי זה מתרחש בתגובה לאותות אינדוקטיביים ממיקרוגליה, שהם תאי החיסון של מערכת העצבים המרכזית והמגיבים הראשונים לפציעה ומחלות9. גם אסטרוציטים וגם מיקרוגליה מגיבים לאותות דלקתיים על ידי מיתון תפקודם ויכולים להמיר אותות דלקתיים ובכך להשפיע ישירות על דלקת עצבית 9,10. עם זאת, האופי הכרוני של פרקינסון מביא למעבר שבו אסטרוציטים תגובתיים הופכים רעילים לנוירונים, והם עצמם מקדמים ניוון ופתולוגיה של מחלות 6,9,10,18,19. לאחרונה הוכח כי חסימת הטרנספורמציה של אסטרוציטים לפנוטיפ נוירוטוקסיק תגובתי מונעת את התקדמות הפרקינסון במודלים של בעלי חיים11. תגובתיות אסטרוציטים בפרדיגמה של דלקת עצבית הפכה אפוא למוקד מרכזי של מחקר פרקינסון, ובאופן דומה מתייחסת לספקטרום רחב של מחלות של מערכת העצבים המרכזית. יחד ממצאים אלה בונים תמונה של מעורבות אסטרוציטית משמעותית באטיולוגיה של פרקינסון, ומדגישים את הצורך במודלים מחקריים מדויקים המסכמים את הפנוטיפ של אוכלוסיות האסטרוציטים האנושיים המעורבים בפרקינסון.

במוח העוברי, נוירונים מופיעים תחילה, כאשר השושלת האסטרוגליאלית, כלומר האסטרוציטים והאוליגודנדרוציטים, מופיעים מאוחר יותר בהתפתחות6. מחקרי in vivo ו-in vitro הדגישו מספר מסלולי איתות שנראה כי הם שולטים בעוצמה של תאי אב עצביים מנגזרות עצביות ועד נגזרות אסטרוגליאליות. בפרט, איתות JAK/STAT, EGF ו-BMP ממלאים תפקידים בהתפשטות, התמיינות והתבגרות של אסטרוגליה20,21. מסלולים אלה היו המוקד של פרוטוקולים במבחנה ליצירת אסטרוציטים מתאים פלוריפוטנטיים, כולל hiPSC 6,22,23. היו דוגמאות מוצלחות רבות ליצירת אסטרוציטים מ-hiPSCs 6,24,25. עם זאת, ברור כי לאסטרוציטים in vivo במערכת העצבים המרכזית יש זהויות אזוריות ספציפיות, המתייחסות ישירות לתפקודם, בהתאם לדרישות הספציפיות של אותם אסטרוציטים ביחס לשכניהם העצביים המתמחים 17,24,25,26. לדוגמה, בהתייחס ספציפית למוח התיכון הגחוני, הוכח כי אסטרוציטים באזור זה מבטאים קבוצות ספציפיות של חלבונים, כולל קולטנים לדופמין המאפשרים תקשורת עם האוכלוסייה המקומית של נוירוני דופמין במוח התיכון26. יתר על כן, אסטרוציטים במוח התיכון הגחוני מפגינים תכונות איתות ייחודיות26. לכן, כדי לחקור את תפקידם של אסטרוציטים במוח התיכון הגחוני בפרקינסון, אנו זקוקים למודל מבחנה המשקף את מערך המאפיינים הייחודי שלהם.

כדי לטפל בזה, פיתחנו פרוטוקול ליצירת אסטרוציטים במוח התיכון הגחוני (vmAstros) מ-hiPSCs. ה-vmAstros המתקבלים מציגים מאפיינים של עמיתיהם במוח התיכון הגחוני in vivo כגון ביטוי של חלבונים ספציפיים, כמו גם תפקודים חיסוניים. התוצאות המוצגות הן מהבידול של קווי NAS2 ו-AST23 hiPSC, שנגזרו והוענקו לנו במתנה על ידי ד"ר טילו קונאת27. NAS2 נוצר מנבדק ביקורת בריא ואילו AST23 נגזר מחולה פרקינסון הנושא שילוש בלוקוס המקודד α-Synuclein (SNCA). קווי hiPSC אלה אופיינו בעבר ושימשו במספר מאמרים מחקריים שפורסמו, כולל ליצירת סוגים שונים של תאים עצביים 27,28,29,30,31.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הפשרה, תחזוקה ושימור של קו hiPSC אנושי

  1. לציפוי לוחות תרבית hiPSC, יש לדלל ויטרונקטין ל-5 מיקרוגרם/מ"ל (1:100) ב-PBS ב-1 מ"ל לכל 10 ס"מ2 שטח פנים של צלחת תרבית תאים. השאירו למשך שעה בטמפרטורת החדר.
  2. הסר את הוויטרונקטין והמשך מיד להוספת hiPSCs/מדיה לצלחת התרבית.
    הערה כאשר מוציאים ויטרונקטין מהצלחת, חשוב שלא לאפשר למשטח התרבות להתייבש.
  3. כדי להפשיר hiPSCs, הסירו קריוביאלים המכילים hiPSCs מחנקן נוזלי והניחו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שהתוכן מופשר לחלוטין.
  4. הכן 9 מ"ל של מדיום תרבית תאים שחומם מראש (למשל, E8 או E8 Flex) המכיל תוסף תאים 1x (למשל, Revitacell). הוסף 1 מ"ל טיפתית לתכולת הקריוביאל. הנח את המדיה הנותרת של 8 מ"ל לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ואל זה הוסף את התוכן המדולל של הקריוביאל.
    זהירות: אין לזלזל בתוכן.
  5. צנטריפוגה ב -150 x גרם למשך 3 דקות. שאפו את הנוזל מבלי להפריע לכדור התא והשעו מחדש בנפח מתאים של מדיום תרבית תאים (למשל, E8 או E8 Flex) המכיל תוסף תאים 1x (למשל, Revitacell). לדוגמא, 2 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות.
  6. הוסיפו HiPSCs מרחפים לכלים מצופים ויטרונקטין והניחו באינקובטור 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 .
    הערה: hiPSCs אמורים להתחיל להיצמד לכלי פלסטיק מצופים ויטרונקטין תוך 30 דקות-שעתיים לאחר ההפשרה.
  7. שמור על hiPSCs במדיום תרבית תאים (למשל, E8 או E8 Flex). הזינו תאים מדי יום על ידי חילופי מדיה. יש לחמם תמיד את מצע התרבית למשך 30 דקות לפני ההאכלה.
    הערה אם משתמשים ב-E8 Flex, רכיבי hiPSC אינם דורשים החלפת מדיה כל 24 שעות וניתן להאריך את מרווחי ההזנה ל-48 שעות, במידת הצורך. מדיית E8 Flex או E8 מפיקה תרביות hiPSC באיכות גבוהה במידה שווה. יש לתרבית HiPSCs לפחות 14 יום לאחר ההפשרה, ולפני תחילת שלבי ההתמיינות. נראה כי תקופות תרבית של פחות מ-14 יום משפיעות לרעה על הישרדות ה-hiPSCs במהלך תקופת ההתמיינות הראשונית. מעבר hiPSCs בכ-80% מפגש (איור 1A: מרווח מעבר של 3-4 ימים).
  8. שעה אחת לפני תחילת הטיפול, יש להוסיף תוסף תא 1x (למשל, Revitacell) לתרבית hiPSC.
  9. שטפו את תרופות ה-hiPSCs פעם אחת עם PBS (ללא סידן או מגנזיום) והוסיפו 0.5 מ"מ EDTA (מדולל מהמלאי ב-PBS ללא סידן או מגנזיום).
  10. דגירה למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, או עד שה-hiPSCs מתחילים להתנתק זה מזה ולקבל מראה מעוגל יותר, כאשר הגבולות של כל iPSC נראים בהירים יותר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר.
  11. הוסיפו 200 מיקרוליטר EDTA לאזור ממוקד של ה-hiPSCs בעזרת פיפטה. אם הם מתנתקים בקלות, ויוצרים מקום ברור בשכבת התא, אז הם מוכנים לקציר. אם הם לא מתנתקים בקלות, השאירו ב-EDTA וחזרו על הפעולה לאחר דקה אחת.
  12. כאשר מוכנים להמשיך, הסירו בעדינות את ה-EDTA, ובעזרת פיפטה, שטפו בעדינות את ה-hiPSCs פעמיים עם מדיום תרבית תאים (למשל, E8 או E8 Flex).
    הערה: כדי להשיג זאת מבלי שה-hiPSCs יתנתקו, הטה את הצלחת והוסף מדיה טיפתית במורד הצד של לוחית התרבית.
  13. כדי לקצור hiPSCs השתמש במדיום תרבית תאים של 1 מ"ל (למשל, E8 או E8 Flex) המכיל תוסף תאים 1x (למשל, Revitacell). שחררו את המדיה ישירות לשכבת ה-hiPSC והתאים אמורים להתנתק. במידת הצורך, חזור על הפעולה עם מדיה נוספת של 1 מ"ל.
  14. צפו ב-hiPSCs מתחת למיקרוסקופ. באופן אידיאלי, hiPSCs צריכים להופיע באשכולות אחידים יחסית כפי שמוצג באיור 1B. אם אשכולות hiPSC גדולים בהרבה, או משתנים מאוד בגודלם, השתמשו בפיפטה כדי לפרק את אשכולות ה-hiPSC הגדולים יותר (איור 1B).
    הערה: אין לשלוש יתר על המידה רכיבי hiPSCs. למרות שהתוסף מגדיל את הישרדות התאים הכוללת, טריטורציה יתר משפיעה לרעה על הישרדות תרבית ה-hiPSC. מומלץ 1-4 מעברים עם פיפטה.
  15. בעזרת פיפטה סרולוגית, העבירו את תרחיף ה-hiPSC לצלחת מצופה ויטרונקטין כפי שהוכנה בשלב 1.1. החזר את תרבית ה-hiPSC לחממה של 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 .
    הערה: שימור בהקפאה של hiPSCs במפגש של כ-80%.
  16. שעה אחת לפני תחילת הטיפול, יש להוסיף תוסף תא 1x (למשל, Revitacell) לתרבית hiPSC.
  17. נתק hiPSCs מלוחות תרבית באמצעות 0.5 מ"מ EDTA כמתואר בשלב 1.4, איסוף תאים במדיום תרבית תאים (למשל, E8 או E8 Flex) המכיל תוסף תאים 1x (למשל, Revitacell). צנטריפוגה ב -150 x גרם למשך 3 דקות.
  18. השעו מחדש את ה-hiPSCs במצע הקפאת תאים (ראו טבלת חומרים). השתמש ב-700 מיקרוליטר לכל 10 ס"מ2 שטח תרבית, שווה ערך ל-1 קריוביאל של תאים לכל באר של צלחת של 6 בארות.
  19. העבר קריוביאלים לכלי הקפאת תאים מתאים (לפרטים ראה טבלת חומרים).
  20. מעבירים את כלי ההקפאה למקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, ניתן להעביר קריוביאלים לחנקן נוזלי (-196 מעלות צלזיוס) לאחסון לטווח ארוך.

2. פרוטוקול בידול vmAstro

הערה: סיכום סכמטי של פרוטוקול ההתמיינות vmAstros מוצג באיור 1A. רשימה מפורטת של ריאגנטים הנדרשים לפרוטוקול והכנתם ניתנת בטבלה 1.

  1. אינדוקציה של vmNPCs
    הערה: פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה להתחיל עם מינימום של 1x באר של צלחת 6 בארות (10 ס"מ2) של hiPSCs 70%-80% מפגש, שהם בערך 4-5 x 104 תאים/ס"מ2 (איור 1B)30. יש לבצע אופטימיזציה של מספר וצפיפות התאים ההתחלתיים עבור כל קו hiPSC מכיוון שהוא משפיע באופן משמעותי על ההישרדות ויעילות ההתמיינות.
    1. יש להסיר את מדיום תרבית התאים מ-hiPSCs ולשטוף 3 פעמים ב-DMEM/F12 + glutamax. החלף מדיה במדיית אינדוקציה vmNPC של 2 מ"ל (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189. ראה טבלה 1 לפרטים על הכנת מדיה וריאגנטים).
    2. הזנה בימים חלופיים עם החלפת מדיה של חצי לאחר 24 שעות, והחלפת מדיה מלאה לאחר 48 שעות.
      הערה: לאחר 3-4 ימים תרבית ה-vmNPC תדרוש מעבר. מומלץ יחס מעבר סטנדרטי של 1:3 או 1:4 - יש לבצע אופטימיזציה עבור כל קו hiPSC בשימוש.
    3. שעה אחת לפני המעבר, הוסף תוסף תאים 1x (למשל, Revitacell) ל-vmNPCs, והכן 1x מטריצת ממברנת בסיס (למשל, Geltrex) פלסטיק תרבית רקמות מצופה (סעיף 2.2 הכנת מטריצת קרום הבסיס וציפוי פלסטיק תרבית רקמה).
    4. הסר את המדיה מ-vmNPCs ושטוף פעמיים עם D-PBS. הוסף 1 מ"ל תמיסת ניתוק תאים מחוממת מראש (למשל, Accutase) לכל 10 ס"מ2 שטח תרבית (1 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות).
    5. מניחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ולאחר מכן בודקים vmNPCs באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
      הערה: ה-vmNPCs יתחילו להתעגל כלפי מעלה, התהליכים שלהם ייסוגו מחדש, ויופיעו פערים בשכבת התא. זה יכול להימשך בין 1-3 דקות בהתאם לצפיפות התאים.
    6. כאשר vmNPCs מקבלים מראה זה, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים (למשל, Accutase) לשכבת ה-vmNPCs.
      הערה: אם ה-vmNPCs מוכנים לניתוק, יופיע חור בשכבת התא. אם זה לא קורה, אז ה-vmNPCs דורשים דגירה נוספת עם פתרון ניתוק תאים.
    7. אם vmNPCs מתנתקים בקלות, הסר בעדינות את תמיסת ניתוק התאים ושטוף vmNPCs פי 2 עם מדיה N2B27. הוסף מדיה N2B27 בעדינות לאורך הצד של הבאר או כלי התרבות וערבב בעדינות לשטיפה, כדי להבטיח ש-vmNPCs לא יתנתקו.
      הערה: יש להשלים שלב זה במהירות כדי להבטיח ש-vmNPCs לא יתחברו מחדש למשטח התא. אם vmNPCs מתחילים להתנתק בשלבי הכביסה, אספו באמצעות צנטריפוגה ב-150 x g למשך 3 דקות. vmNPCs אינם צנטריפוגות כסטנדרט בעת המעבר מכיוון שהדבר יכול להפחית את הישרדותם.
    8. לבסוף, הסר vmNPCs באמצעות פיפטה, על ידי פליטה נמרצת של אמצעי אינדוקציה vmNPC המכיל תוסף תא 1x (למשל, Revitacell) ישירות לשכבת התא. זה אמור להסיר vmNPCs, אשר לאחר מכן ניתן להעביר ישירות לכלי התרבות המצופים המצופים החדשים.
      הערה: אל תעשה שימוש חוזר במדיה שכבר מכילה vmNPCs מושעים כדי להסיר תאים נוספים מכיוון שהדבר יגרום לטריטורציה יתר שלהם, מה שמפחית את הישרדותם.
    9. החלף באינקובטור 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 . vmNPCs צריכים להתחיל להיצמד למשטח המצופה מטריצה לאחר 20-30 דקות. החלף מחצית מהמדיה במדיית אינדוקציה vmNPC טרייה (ללא תוספת תאים) לאחר 24 שעות והמשך בלוח הזמנים של ההזנה כקודם.
    10. המשך במשטר ההאכלה והמעבר למשך 10 ימים.
  2. הכנת מטריצת קרום מרתף וציפוי פלסטיק תרבית רקמות
    הערה: לתחזוקת vmNPCs מטריצת קרום מרתף 1x (למשל, Geltrex) משמשת לציפוי כלי פלסטיק. לתחזוקת vmAPCs או vmAstros, ניתן להשתמש במטריצת ממברנת מרתף פי 0.25.
    1. מוציאים את ציר מטריצת הממברנה מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס ומכניסים למקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה להפשרה.
    2. יש לדלל 1:10 עם DMEM/F12 + גלוטמקס קר כקרח, לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כציר פי 10.
    3. בעת ציפוי כלי פלסטיק יש לדלל את המלאי הזה פי 10 ל-1x (עבור vmNPCs) או 0.25x (עבור vmAPCs או vmAstros) עם DMEM/F12 + glutamax קר כקרח.
    4. הוסף מיד לתרבית רקמות פלסטיק ב -1 מ"ל לכל 10 ס"מ2, למשל, 1 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות.
    5. יש להניח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה. אין להסיר את תמיסת מטריצת קרום המרתף מכלי פלסטיק עד שהיא מוכנה להוסיף מדיה/תאים כדי להבטיח שכלי הפלסטיק המצופים לא יתייבשו. צלחות מצופות מטריקס אינן דורשות שטיפה לפני הוספת תאים.
  3. הרחבת vmNPCs
    1. ביום העשירי של הפרוטוקול, החלף את מדיית האינדוקציה במדיית הרחבה vmNPC (N2B27 + GDNF + BDNF + חומצה אסקורבית. ראה טבלה 1 לפרטים על הכנת מדיה וריאגנטים).
      הערה: ה-vmNPCs אינם דורשים תוספת של מיטוגנים כדי לגרום להתפשטות. BDNF, GDNF וחומצה אסקורבית תומכים בהישרדות ובתחזוקה של vmNPCs30.
    2. הזנה בימים חלופיים עם החלפת מדיה של חצי לאחר 24 שעות, והחלפת מדיה מלאה לאחר 48 שעות.
      הערה: לאחר 3-4 ימים, תרבית vmNPC תדרוש מעבר. עבור מעבר, מומלץ יחס מעבר סטנדרטי של 1:3 או 1:4 (יש לבצע אופטימיזציה עבור כל קו hiPSC בשימוש). קבע את היחס שנותן את ההישרדות, ההתפשטות והיצירה הטובים ביותר של vmNPCs).
    3. שעה אחת לפני המעבר, הוסף תוסף תא 1x (למשל, Revitacell) ל-vmNPCs, והכן מראש צלחות/צלוחיות מצופות מטריצה 1x (סעיף 2.2 הכנת מטריצת ממברנת הבסיס וציפוי פלסטיק תרבית rissue). מחממים מראש את תמיסת ניתוק התאים (למשל, Accutase) ל-37 מעלות צלזיוס. מחממים מראש מדיית הרחבה vmNPC טרייה המכילה תוסף תאים 1x (למשל, Revitacell).
    4. הסר מדיה מ-vmNPCs וכבס פעמיים עם D-PBS. הוסף תמיסת ניתוק תאים של 1 מ"ל (למשל, Accutase) לכל 10 ס"מ2 שטח תרבית (1 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות). מניחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת ולאחר מכן בודקים vmNPCs באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.
      הערה: ה-vmNPCs יתחילו להתעגל כלפי מעלה, התהליכים שלהם ייסוגו מחדש, ויופיעו פערים בשכבת התא. זה יכול לקחת בין 1-3 דקות בהתאם לצפיפות התא.
    5. כאשר vmNPCs מקבלים מראה מעוגל, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת ניתוק תאים (למשל, Accutase) לשכבת ה-vmNPCs.
      הערה: אם ה-vmNPCs מוכנים לניתוק, יופיע חור בשכבת התא. אם זה לא קורה, אז ה-vmNPCs דורשים דגירה נוספת עם פתרון ניתוק התאים.
    6. אם vmNPCs אכן מתנתקים בקלות, הסר בעדינות את תמיסת ניתוק התאים ושטוף vmNPCs פי 2 עם מדיה N2B27. הוסף מדיה N2B27 בעדינות לאורך הצד של הבאר או כלי התרבות וערבב בעדינות לשטיפה, כדי להבטיח ש-vmNPCs לא יתנתקו.
      הערה: אם vmNPCs מתחילים להתנתק במספרים גדולים בשלבי הכביסה, אספו באמצעות צנטריפוגה ב-150 x g למשך 3 דקות. יש להשלים שלב זה במהירות כדי להבטיח ש-vmNPCs לא יתחברו מחדש למשטח התא.
    7. הסר vmNPCs באמצעות פיפטה, והוצא במרץ את מדיית ההרחבה vmNPC המכילה תוסף תא 1x (למשל, Revitacell) ישירות לשכבת התא. זה אמור להסיר vmNPCs, אשר לאחר מכן ניתן להעביר ישירות לתוך הצלחות/צלוחיות המצופות מטריצה שהוכנו מראש (ראה סעיף 2.2 'הכנת מטריצת קרום הבסיס וציפוי פלסטיק תרבית רקמות').
      הערה: אל תעשה שימוש חוזר במדיה שכבר מכילה vmNPCs מושעים כדי להסיר תאים נוספים מכיוון שהדבר יגרום לטריטורציה יתר שלהם, מה שמפחית את הישרדותם.
    8. החלף באינקובטור 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 . vmNPCs צריכים להתחיל להיצמד למשטח המצופה מטריצה לאחר 20-30 דקות. לאחר 24 שעות, החלף מחצית מאמצעי התרבית באמצעי הרחבה טריים של vmNPC (ללא תוספת תאים) והמשך בלוח הזמנים הקודם.
    9. המשך במשטר זה של האכלה ומעבר למשך 10 ימים. ניתן להרחיב את vmNPCs עד ליום 50.
  4. בידול והרחבה של vmAPCs
    הערה: ניתן להשתמש בהצלחה ב-vmNPCs עבור יצירת vmAPCs/vmAstros בכל מקום בין 30 ל-50 יום משלב ה-hiPSC הראשוני (איור 1A).
    1. קח תרבית vmNPC משולבת ושטוף vmNPCs פי 3 ב-DMEM/F12 מתקדם כדי להסיר עקבות של הרכיבים של מדיית הרחבה vmNPC. החלף את המדיה במדיית הרחבה vmAPC (מדיה ASTRO +EGF +LIF. ראה טבלה 1 לפרטים על הכנת מדיה וריאגנטים).
    2. לאחר מעבר של 72 שעות, תרבית ה-vmNPC נמצאת ביחס גבוה (1:7.5). לדוגמה, בהנחה ש-vmNPCs נשמרו בבאר אחת של צלחת של 6 בארות, כעת יש להעביר אותם לבקבוק מצופה מטריצה 1x בגודל 75 ס"מ2 (מצופה כמתואר בסעיף 2.2 'הכנת מטריצת קרום מרתף וציפוי פלסטיק תרבית רקמות'). מעבר באמצעות פתרון ניתוק תאים, כמתואר עבור vmNPCs בסעיף 2.3 'הרחבת vmNPCs'.
    3. השהה מחדש vmNPCs בנפח מתאים של מדיית הרחבה vmAPC (מדיה של 7.5-15 מ"ל לכל בקבוקבגודל 75 ס"מ. החלפת מדיה מלאה כל 3 ימים, או לפי דרישת התאים.
      הערה: מנקודה זו ואילך, vmNPCs מכונים vmAPCs ויש לעבור אותם כתאים בודדים ולא כאשכולות תאים. יש לעבור vmAPCs כל 3-7 ימים או כשהם הופכים למתכנסים כדי למנוע התמזגות יתר. מנקודה זו ואילך יש להשתמש בריכוז המופחת של מטריצת 0.25x לציפוי כלי פלסטיק (כמתואר בסעיף 2.2 הכנת מטריצת קרום הבסיס וציפוי פלסטיק תרבית רקמות).
    4. הרחב את ה-vmAPCs עד שהם מגיעים ליום ה-90 (משלב ה-hiPSC), תוך שימור בהקפאה של vmAPCs בנקודות שונות בהתרחבותם.
  5. יצירת vmAstros בוגרים מ-vmAPCs
    הערה: בשלב זה, ניתן לגדל vmAPCs בצלוחיות תרביתרקמה בגודל 175 ס"מ. ניתן להרחיב זאת ליצירת מספר גדול של vmAstros בוגרים.
    1. כאשר vmAPCs מגיעים למפגש של 80%, יש לשטוף פי 3 במדיית ASTRO ולהחליף במדיית התבגרות vmAstros (מדיה ASTRO +BMP4 +LIF. ראה טבלה 1 לפרטים על הכנת מדיה וריאגנטים).
    2. בצע החלפת מדיה מלאה כל 3 ימים, או לפי דרישת התאים, למשך 10 ימים.
      הערה: א) בשלב זה, האפיון מצביע על כך שה-vmAstros בוגרים, כפי שאושר על ידי אימונוציטוכימיה (איור 2G - I) ועל ידי ניתוח ביטוי גנים (כתב יד בהכנה). ב) יש לצבוע מחדש את vmAstros המשמש מיד לאחר ההתבגרות על משטח מצופה מטריצה שהוכן לאחרונה. שמירה על vmAPCs או vmAstros על אותו משטח תרבית במשך יותר מ-14 יום עלולה להוביל לתרביות לא אופטימליות, שבהן התאים מתחילים להתכווץ בגודלם ואפילו להתנתק. ג) עבור יישומים הבוחנים אפנון נוירו-דלקתי, BMP ו-LIF מוסרים 72 שעות לפני גירוי נוירו-דלקתי. זאת כדי למנוע כל אינטראקציה פוטנציאלית בין איתות BMP/LIF לבין איתות נוירו-דלקתי מושרי.
    3. כעת ניתן לצפות מחדש את vmAstros לבדיקות ניסיוניות, למשל, על גבי כיסויים לאימונוציטוכימיה או לשמור בהקפאה ליישומים עתידיים (סעיפים 3, 4).
      הערה: אין צורך במעבר בשלב זה של הפרוטוקול מכיוון שההתפשטות צריכה להתרחש רק בקצב נמוך מאוד. vmAPCs מצופים בצפיפות רבה מדי בשלב זה שומרים על רמות גבוהות יותר של התפשטות. אם זה המקרה, מעבר ופיצול תאים כדי להשיג צפיפות כפי שמוצג באיור 1F.

3. שימור בהקפאה של vmNPCs, vmAPCs ו-vmAstros

הערה: שמור בהקפאה vmNPCs/vmAPCs/vmAstros במפגש מלא.

  1. שעה אחת לפני תחילת השימוש, יש להוסיף תוסף תאים 1x (למשל, Revitacell) לתרבית. מלאו את כלי האחסון בהקפאה (ראה טבלת חומרים) באיזופרופנול בטמפרטורת החדר.
  2. נתק את התאים מלוחות התרבית באמצעות תמיסת ניתוק תאים כפי שתואר קודם לכן, איסוף תאים במדיה מתאימה (N2B27 או מדיה ASTRO) המכילה תוסף תאים 1x (למשל, Revitacell). צנטריפוגה ב -150 x גרם למשך 3 דקות.
  3. השעיה מחדש של vmNPCs/vmAPCs/vmAstros באמצעי הקפאה של תאים (ראה טבלת חומרים) באופן הבא (שלבים 3.3.1. - 3.3.3.3.)
    1. עבור vmNPCs: השתמש ב-700 מיקרוליטר לכל 10 ס"מ2 שטח תרבית, לתוך קריוביאל אחד.
    2. עבור vmAPCs: השתמש ב-700 מיקרוליטר לכל 60 ס"מ2 שטח תרבית, לתוך קריוביאל אחד (כ-1/3 מבקבוק תרבית T175).
    3. עבור vmAstros: השעו מחדש במדיה של 2 מ"ל וספרו את מספר ה-vmAstros. צנטריפוגה מחדש והשעיה מחדש באמצעי הקפאת תאים (ראה טבלת חומרים) במספר לכל קריוביאל המתאים ליישומים עתידיים. בהנחה של אובדן תאים משוער של 15% עקב הפשרה-הקפאה, vmAstros שהופשרו לאחרונה נספרים ומצופים במספר תאים עודף של 15% כדי לפצות על מוות תאים בתהליך ההקפאה-הפשרה. זה, אם כן, שווה ערך ל-74,750 vmAstros לס"מ2. vmAstros מופשרים נשמרים במשך 72 שעות במדיה ASTRO לפני הבדיקה.
  4. העבירו את הקריוביאלים לכלי הקפאה בתא (לפרטים ראו טבלת חומרים) והעבירו את כלי ההקפאה למקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, ניתן להעביר קריוביאלים לחנקן נוזלי (-196 מעלות צלזיוס) לאחסון לטווח ארוך.

4. אפיון פנוטיפ vmAstro

  1. אימונוציטוכימיה
    1. מניחים 100-200 כיסויי זכוכית 13 מ"מ בצלחות פטרי זכוכית על שכבת נייר פילטר ומעקרים אותם בחיטוי יבש.
    2. העבירו את תלושי הכיסוי לבארות של צלחות 4 או 24 בארות באמצעות מלקחיים סטריליים. הוסף תמיסת מטריצה 1x (למשל, Geltrex) על החלקות הכיסוי כטיפות של 50 מיקרוליטר ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    3. לעבור או להפשיר vmAstros, להשעות מחדש במדיה ASTRO ולבצע ספירה. צלחת vmAstros ב-25-100,000 תאים לכל כיסוי בטיפה של 50 מיקרוליטר.
    4. הסר את המטריצה מכיסוי הכיסוי והוסף מיד vmAstros בטיפת מדיה. מניחים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן מציפים את הבארות במדיית ASTRO נוספת של 250 מיקרוליטר.
      הערה: אם מבצעים אימונוציטוכימיה כדי פשוט לבדוק אם יש ביטוי של אסטרוציטים וסמני מוח אמצעי, ניתן לתקן את vmAstros 24 שעות לאחר הציפוי.
    5. הכן תמיסת פורמלדהיד 4% על ידי דילול תמיסת פורמלדהיד 36% 1:9 ב-D-PBS.
    6. שטפו את vmAstros 1x עם D-PBS. מוסיפים מיד פורמלדהיד 4% לבארות ומשאירים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
    7. הסר פורמלדהיד והחלף ב-D-PBS. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או להמשיך לאימונוציטוכימיה.
    8. שטפו את הכיסויים בבארות פי 3 עם D-PBS. לחלחל ולחסום ב-10% סרום עיזים, 1% BSA ב-0.1% PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) למשך שעה בטמפרטורת החדר.
    9. הוסף נוגדנים ראשוניים (טבלת חומרים) בסרום עיזים 1%, 0.1% BSA ב-0.1% PBTx (D-PBS + 1:1000 Triton-X) ודגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס על נדנדה.
    10. למחרת, הסר נוגדנים ראשוניים ושטוף את הכיסויים פי 3 עם D-PBS.
    11. הוסף נוגדנים משניים מתאימים (טבלת חומרים) בסרום עיזים 1%, 0.1% BSA ב-0.1% PBTx, ודגר במשך 1-2 שעות בטמפרטורת החדר והגן עליו מפני אור על נדנדה. שטפו את הכיסויים פי 3 עם D-PBS.
    12. הוסף תמיסת DAPI (0.1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI ב-D-PBS) ודגר בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. שטפו את הכיסויים פי 3 עם D-PBS.
    13. כדי להרכיב את הכיסוי, הוסף טיפה של 5 מיקרוליטר של מדיית הרכבה של Mowiol/DABCO [12% Mowiol (w/v), 12% גליצרול (w/v) מומס למשך הלילה תוך ערבוב ב-0.2 M Tris (pH 8.5) עם 25 מ"ג/מ"ל 1,4-דיאזאביצילו [2.2.2] אוקטן (DABCO)] לשקופית מיקרוסקופ זכוכית. בעזרת מלקחיים, הסר בזהירות את הכיסוי מהבאר; טפחו את קצה הכיסוי על הרקמה כדי להסיר את עודפי הנוזל והניחו את הצד של vmAstros כלפי מטה על טיפת Mowiol/DABCO.
    14. חזור על הפעולה עבור כל כיסוי והשאיר לייבוש למשך 8 שעות לפני בדיקה מיקרוסקופית.
  2. מדידת ELISA של הפרשת vmAstros של IL-6 בתגובה לטיפול בציטוקינים
    הערה: לאחר התבגרות של 10 ימים עם BMP4 ו-LIF, יש לעבור, לספור ולצפות את vmAstros על כלי פלסטיק לתרבית רקמות מצופה מטריצה 0.25x (כמפורט ב סעיף 2.2הכנת מטריצת קרום מרתף וציפוי פלסטיק תרבית רקמות), בצפיפות של 65,000 vmAstros לס"מ2 במדיה ASTRO. יש להסיר BMP4 ו-LIF מה-vmAstros 72 שעות לפני הטיפול בציטוקינים מכיוון שאיתות פעיל מגורמים אלה יכול להפריע ליעילות הטיפול בציטוקינים. לחלופין, ניתן להפשיר vmAstros בהקפאה ולהשתמש בו לבדיקות.
    1. ביום הבדיקה, שטפו בעדינות את vmAstros 3x במדיה שאינה חיזור (DMEM/F-12 + glutamax + N2).
    2. השתמש בבקרה לא מטופלת ובבאר שטופלה בציטוקינים לצורך השוואה. הוסף ציטוקין נבחר בריכוז אופטימלי. הנתונים באיור 2J - L נוצרו באמצעות IL-1α ב-3 ננוגרם/מ"ל9 במדיה שאינה חיזור ב-1 מ"ל לכל 10 ס"מ2 שטח תרבית תאים.
    3. החלף את vmAstros בחממה של 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, אסוף אמצעי תרבית לצינורות מיקרופוגה סטריליים.
    4. אם ELISA לא יבוצע באופן מיידי, הצמד דגימות מדיה להקפאה על ידי טבילת צינורות מיקרופוגה בחנקן נוזלי ואחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי.
      הערה: הפרוטוקול הבא מותאם במיוחד לשימוש עם ערכת IL-6 ELISA המפורטת בטבלת החומרים. יש להרכיב מחדש נוגדנים ותקנים המסופקים כאבקה ליופילית בערכת ELISA חדשה לפני השימוש הראשון, ויש לצרף אותם לשימוש עתידי. גיליון הנתונים המצורף לערכה מפרט את הריאגנטים והנפחים הנדרשים להרכבה מחדש. יש להרכיב מחדש את נוגדן הלכידה ב-PBS (ללא חלבון נשא).
    5. בצע את ה-ELISA בפורמט צלחת של 96 בארות וחשב את נפחי הריאגנטים בהתאם לבארות המשמשות. ביום ELISA, הכינו נוגדנים ללכידה על ידי דילול מלאי 1:120 ב-PBS. מצפים את הצלחת על ידי העמסת 50 מיקרוליטר של נוגדן לכידה לבאר. מכסים את הצלחת ברצועת דבק ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
    6. למחרת, שטפו את הצלחת 3x עם D-PBS-Tween (D-PBS עם 0.05% Tween-20), 100 מיקרוליטר לבאר. כתם יבש.
    7. חסום את הצלחת על ידי טעינת 150 μL D-PBS/1% BSA לבאר. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות. יש לשטוף את הצלחת כמתואר.
    8. הפשירו דגימות על קרח (זה יכול לקחת 1-2 שעות). לדלל דגימות 1:5 על ידי טעינת דגימה של 10 מיקרוליטר ו-40 מיקרוליטר D-PBS/1% BSA. מערבולת כל דגימה לפני הטעינה.
      הערה: יש צורך לדלל דגימות בעת ביצוע IL-6 ELISA, יש לייעל את הדילול.
    9. הכן את הסטנדרט העליון (1,000 ρg/mL) על ידי דילול מלאי 1:180 ב-D-PBS/1% BSA. הכן 7 תקנים על ידי ביצוע דילול סדרתי של התקן העליון. מערבולת בין כל דילול.
    10. הוסף 50 מיקרוליטר של תקנים/דוגמאות לבארות. השתמש ב-D-PBS/1% BSA כריק. דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים על שייקר אורביטלי כדי לערבב כראוי את הדגימות המדוללות. יש לשטוף את הצלחת כמתואר.
    11. הכן נוגדנים לזיהוי על ידי דילול מלאי 1:60 ב-D-PBS/1% BSA. טען 50 מיקרוליטר של נוגדן זיהוי לכל באר. מכסים את הצלחת ודוגרים ב-RT למשך שעתיים. יש לשטוף את הצלחת כמתואר.
    12. הכן סטרפטווידין מצומד לחזרת פרוקסידאז (Strep-HRP) על ידי דילול מלאי 1:40 ב-D-PBS/1% BSA. טען 50 מיקרוליטר Strep-HRP לבאר ודגר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות בחושך. יש לשטוף את הצלחת כמתואר.
    13. התחל את תגובת הצבע על ידי טעינת תמיסת מצע TMB של 50 μL לכל באר. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך למשך 20 דקות (או עד שהתקנים והדגימות פיתחו צבע כחול).
      הערה: TMB מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס אך יש להשתמש בו בטמפרטורת החדר.
    14. עצור את התגובה על ידי הוספת תמיסת עצירה של 25 מיקרוליטר (1 M H2SO4) לכל באר ושים לב לשינוי הצבע מכחול לצהוב.
    15. קרא את הצלחת בספיגה של 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרו-פלטות. הגדר את תיקון אורך הגל לספיגה של 540 ננומטר כדי למקסם את הדיוק. חשב את ריכוזי החלבון בדגימות מהעקומה הסטנדרטית המיוצרת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתודולוגיית בידול והתקדמות
כאן אנו מציגים את הפרטים הן של השיטות ששימשו ליצירת vmAstros והן של הפרוטוקולים המשמשים לאפיון הפנוטיפי שלהם לאחר מכן. השיטה ליצירת vmAstros מורכבת מכמה שלבי התמיינות נפרדים, שאפשר לנטר באמצעות מיקרוסקופיה וזיהוי מאפיינים מורפולוגיים מובהקים (איור 1A-F). תרבית hiPSC נטולת מזין (איור 1B) חשופה לגורמים ספציפיים כדי לגרום להתמיינות שלהם לעבר שושלת עצבית (LDN193189, SB431542), במיוחד של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטה זו ליצירת vmAstros מ-hiPSCs יעילה ביותר, יוצרת תרביות טהורות של vmAstros, וניתנת לשחזור ליצירת vmAstros מקווי hiPSC שונים. פרוטוקול זה פותח סביב סיכום האירועים ההתפתחותיים הנדרשים בעובר כדי לעצב נכון את המוח התיכון המתפתח וליצור אסטרוציטים וכולל שלושה שלבים מוגדרים: 1) אינדוקציה עצבית של המוח התיכון הגחוני ליצירת vmNPCs, 2) יצירה והרחבה של vmAPCs, ולבסוף 3) התבגרות של vmAstros.

בעבודתנו הקודמת שפורסמה, הדגשנו את החשיבות של אופטימיזציה של ריכוזי CHIR99021 ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי מענק פרויקט פרקינסון בבריטניה (G-1402) וסטודנטים. המחברים מודים למתקן וולפסון להדמיה ביולוגית על תמיכתם ועזרתם בעבודה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ריאגנטים
0.2M Tris-Cl (pH 8.5)n/an/a מורכבמבסיס Tris ובתוספת HCl
0.5M EDTA, PH 8ThermoFisher  15575-0201:1000 ב-D-PBS עד 0.5 מ"מ גמר 
1,4-דיאזאביצילו[2.2.2]אוקטן (DABCO)סיגמאD27802-  25 מ"ג/מ"ל בתמיסת הרכבה של Mowiol
13 מ"מ כיסוייםVWR631-0149
2-Mercaptoethanol (50 מ"מ)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010יש 1x NEAA אך אנו מוסיפים לריכוז הסופי של 2x (0.2 מ"מ)
חומצה אסקורביתSigmaA5960מלאי 200 מ"מ, 1:1000 עד 200 ומיקרו; M סופי
B27 תוסףThermoFisher17504-04450x מלאי
BSASigma5470
מדיה להקפאת תאיםSigmaC2874Cryostor CS10
כלי הקפאת תאיםNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem1386מלאי 0.8 מ"מ, דילול 1:1000 ל-0.8 ומיקרו; M
Cryovials סופיים  סיגמאCLS430487
DAPI סיגמאD95421 מ"ג/מ"ל, 1:10,000 עד 100 ננוגרם/מ"ל סופי (ב-PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS ללא מ"ג או Ca)ThermoFisher<חזק>14190144<חזק>pH 7.2
E8 Flex ערכה בינוניתThermoFisherA2858501
פורמלדהיד (תמיסה של 36%)סיגמא47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 או 1:400 ב-DMEM/F12
GlutamaxThermoFisherקר כקרח 35050038מלאי 2 מ"מ (1:200 ב-N2B27, 1:100 במדיה ASTRO עד 20 ומיקרו; גמר M) 
גליצרולסיגמאG5516
BDNF אנושי  פפרוטק450-0220 ומיקרו; גרם/מ"ל מלאי, 1:1000 עד 20 ננוגרם/מ"ל סופי
אנושי BMP4פפרוטק120-0520 ומיקרו; מלאי גרם/מ"ל, 1:1000 עד 20 ננוגרם/מ"ל סופי
אנושי EGFPeprotechAF-100-1520 ומיקרו; גרם/מ"ל מלאי, 1:1000 עד 20 ננוגרם/מ"ל סופי
אנושיGDNF Peprotech450-1020 ומיקרו; מלאי גרם/מ"ל, 1:1000 עד 20 ננוגרם/מ"ל
תמיסת אינסולין אנושיתסיגמא I9278מלאי 10 מ"ג/מ"ל, 1:2000 עד 5 ומיקרו; g/mL סופי
LIF אנושיPeprotech300-0520 ומיקרו; גרם/מ"ל מלאי, 1:1000 עד 20 ננוגרם/מ"ל
ערכת ELISA סופית IL-6BiotechneDY206
איזופרופנולסיגמא  I9516-4Lלמילוי כלי אחסון קריו של מר פרוסטי
LDN193189סיגמאSML0559100 ומיקרו; מלאי M, 1:10,000 דילול ל-10 ננומטר סופי
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 תוסףThermoFisher17502048100x מלאי
NEAAThermoFisher11140035מלאי 10 מ"מ, 1:100 עד 0.1 מ"מ סופי 
מדיה נוירובזליתThermoFisher21103049
Normal Goat SerumVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x מלאי, 1:100 עד 1x סופי
SB431542Tocris161410 מ"מ מלאי, 1:1000 דילול ל-10 ומיקרו; M סופי
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 ומיקרו; מלאי גרם/מ"ל, 1:1000 עד 200 ננוגרם/מ"ל סופי
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
Tween-20סיגמא P7949
VitronectinThermoFisherA147001:50 ב-D-PBS
<נוגדנים חזקים>נוגדנים לאימונוציטוכימיה  CompanyCatalogue Number>Host species
נוגדן נגד S100bSigmaSAB4200671 Mouse; 1:200
נוגדן נגד FOXA2SCBTNB600501Mouse; 1:50
נוגדן נגד ארנב LMX1AProSci7087; 1:300
נוגדן נגד ארנב AB10533 LMX1AMillipore; 1:2000
נוגדן נגד ארנב LMX1BProteintech18278-1-AP; 1:300
נוגדן נגד ארנב GLASTProteintech20785-1-AP; 1:300
נוגדן נגד ארנב GFAPDakoZ0334; 1:400
נוגדן נגד ארנב CD49fProteintech27189-1-AP; 1:100
נוגדן נגד MSI1Abcamab52865ארנב; 1:400
Alexa Fluor 488 עז נגד ארנב ThermoFisherA32731עז; 1:500
Alexa Fluor 488 עז נגד עכברThermoFisherA32723; 1:500
Fluor 568 עז נגד ארנבThermoFisherA110361:500
עז Fluor 488 עז נגד עכברThermoFisherA11031; 1:500
סופית עז עז ;

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poewe, W., et al. Parkinson disease. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013(2017).
  2. Lees, A. J., Hardy, J., Revesz, T. Parkingson's disease. Lancet. 373, 2055-2066 (2009).
  3. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).
  4. Booth, H. D. E., Hirst, W. D., Wade-Martins, R. The role of astrocyte dysfunction in Parkinson's disease pathogenesis. Trends in Neurosciences. 40, 358-370 (2017).
  5. Lindstrom, V., et al. Extensive uptake of alpha-synuclein oligomers in astrocytes results in sustained intracellular deposits and mitochondrial damage. Molecular and Cellular Neuroscience. 82, 143-156 (2017).
  6. Crompton, L. A., Cordero-Llana, O., Caldwell, M. A. Astrocytes in a dish: Using pluripotent stem cells to model neurodegenerative and neurodevelopmental disorders. Brain Pathology. 27, 530-544 (2017).
  7. di Domenico, A., et al. Patient-specific iPSC-derived astrocytes contribute to non-cell-autonomous neurodegeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 12, 213-229 (2019).
  8. Zhang, Y., Barres, B. A. Astrocyte heterogeneity: an underappreciated topic in neurobiology. Current Opinions in Neurobiology. 20, 588-594 (2010).
  9. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541, 481-487 (2017).
  10. Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: production, function, and therapeutic Potential. Immunity. 46, 957-967 (2017).
  11. Yun, S. P., et al. Block of A1 astrocyte conversion by microglia is neuroprotective in models of Parkinson's disease. Nature Medicine. 24, 931-938 (2018).
  12. Stokholm, M. G., et al. Assessment of neuroinflammation in patients with idiopathic rapid-eye-movement sleep behaviour disorder: a case-control study. The Lancet Neurology. 16, 789-796 (2017).
  13. Williams-Gray, C. H., et al. Serum immune markers and disease progression in an incident Parkinson's disease cohort (ICICLE-PD). Movement Disorders. 31, 995-1003 (2016).
  14. Gelders, G., Baekelandt, V., Vander Perren, A. Linking neuroinflammation and neurodegeneration in Parkinson's disease. Journal of Immunology Research. 2018, 4784268(2018).
  15. Hall, S., et al. Cerebrospinal fluid concentrations of inflammatory markers in Parkinson's disease and atypical parkinsonian disorders. Scientific Reports. 8, 13276(2018).
  16. Zamanian, J. L., et al. Genomic analysis of reactive astrogliosis. Journal of Neuroscience. 32, 6391-6410 (2012).
  17. Clarke, B. E., et al. Human stem cell-derived astrocytes exhibit region-specific heterogeneity in their secretory profiles. Brain. 143 (10), 85(2020).
  18. Sevenich, L. Brain-resident microglia and blood-borne macrophages orchestrate central nervous system inflammation in neurodegenerative disorders and brain cancer. Frontiers in Immunology. 9, 697(2018).
  19. Friedman, B. A., et al. Diverse brain myeloid expression profiles reveal distinct microglial activation states and aspects of Alzheimer's disease not evident in mouse models. Cell Reports. 22, 832-847 (2018).
  20. Viti, J., Feathers, A., Phillips, J., Lillien, L. Epidermal growth factor receptors control competence to interpret leukemia inhibitory factor as an astrocyte inducer in developing cortex. Journal of Neuroscience. 23, 3385-3393 (2003).
  21. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H., Taga, T. Astrocyte differentiation mediated by LIF in cooperation with BMP2. FEBS Letters. 457, 43-46 (1999).
  22. Serio, A., et al. Astrocyte pathology and the absence of non-cell autonomy in an induced pluripotent stem cell model of TDP-43 proteinopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 4697-4702 (2013).
  23. Gupta, K., et al. Human embryonic stem cell derived astrocytes mediate non-cell-autonomous neuroprotection through endogenous and drug-induced mechanisms. Cell Death and Differentiation. 19, 779-787 (2012).
  24. Krencik, R., Ullian, E. M. A cellular star atlas: using astrocytes from human pluripotent stem cells for disease studies. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 25(2013).
  25. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. -J., Zhang, S. -C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 528-534 (2011).
  26. Xin, W., et al. Ventral midbrain astrocytes display unique physiological features and sensitivity to dopamine D2 receptor signaling. Neuropsychopharmacology. 44, 344-355 (2019).
  27. Devine, M. J., et al. Parkinson's disease induced pluripotent stem cells with triplication of the alpha-synuclein locus. Nature Communications. 2, 440(2011).
  28. Chen, Y., et al. Engineering synucleinopathy-resistant human dopaminergic neurons by CRISPR-mediated deletion of the SNCA gene. European Journal of Neuroscience. 49, 510-524 (2019).
  29. Crompton, L. A., et al. non-adherent differentiation of human pluripotent stem cells to generate basal forebrain cholinergic neurons via hedgehog signaling. Stem Cell Research. 11, 1206-1221 (2013).
  30. Stathakos, P., et al. A monolayer hiPSC culture system for autophagy/mitophagy studies in human dopaminergic neurons. Autophagy. , 1-17 (2020).
  31. Stathakos, P., et al. Imaging autophagy in hiPSC-derived midbrain dopaminergic neuronal cultures for Parkinson's disease research. Methods in Molecular Biology. 1880, 257-280 (2019).
  32. Bilican, B., et al. Mutant induced pluripotent stem cell lines recapitulate aspects of TDP-43 proteinopathies and reveal cell-specific vulnerability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 5803-5808 (2012).
  33. Cordero-Llana, O., et al. Clusterin secreted by astrocytes enhances neuronal differentiation from human neural precursor cells. Cell Death and Differentiation. 18, 907-913 (2011).
  34. Morrow, T., Song, M. R., Ghosh, A. Sequential specification of neurons and glia by developmentally regulated extracellular factors. Development. 128, 3585-3594 (2001).
  35. Namihira, M., et al. Committed neuronal precursors confer astrocytic potential on residual neural precursor cells. Developmental Cell. 16, 245-255 (2009).
  36. Ochiai, W., Yanagisawa, M., Takizawa, T., Nakashima, K., Taga, T. Astrocyte differentiation of fetal neuroepithelial cells involving cardiotrophin-1-induced activation of STAT3. Cytokine. 14, 264-271 (2001).
  37. Nakashima, K., Yanagisawa, M., Arakawa, H. Synergistic signaling in fetal brain by STAT3-Smad1 complex bridged by p300. Science. 284 (5413), 479-482 (1999).
  38. Nakashima, K., et al. Developmental requirement of gp130 signaling in neuronal survival and astrocyte differentiation. Journal of Neuroscience. 19, 5429-5434 (1999).
  39. Barbar, L., et al. CD49f is a novel marker of functional and reactive human iPSC-derived astrocytes. Neuron. 107, 436-453 (2020).
  40. Barbar, L., Rusielewicz, T., Zimmer, M., Kalpana, K., Fossati, V. Isolation of human CD49f(+) astrocytes and in vitro iPSC-based neurotoxicity assays. STAR Protocols. 1, 100-172 (2020).
  41. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and alpha-synuclein dysfunction potentiate each other, driving chronic progression of neurodegeneration in a mouse model of Parkinson's disease. Environmental Health Perspectives. 119, 807-814 (2011).
  42. Gao, H. M., et al. Neuroinflammation and oxidation/nitration of alpha-synuclein linked to dopaminergic neurodegeneration. Journal of Neuroscience. 28, 7687-7698 (2008).
  43. Horvath, I., et al. Co-aggregation of pro-inflammatory S100A9 with alpha-synuclein in Parkinson's disease: ex vivo and in vitro studies. Journal of Neuroinflammation. 15, 172(2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Ventral Midbrain AstrocytesHuman Astrocyte GenerationInduced Pluripotent Stem CellsParkinson s Disease ModelsAstrocyte NeuroinflammationAstrocyte NeurotoxicityAstrocyte Drug ScreeningAstrocyte ImmunomodulationAstrocyte Marker ExpressionHigh Throughput Protocol
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים